專利名稱：一種副豬嗜血桿菌lc株及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物制品中副豬嗜血桿菌疫苗領域，特別涉及一種副豬嗜血桿菌LC 株，還涉及所述副豬嗜血桿菌LC株的應用。
背景技術：
副豬嗜血桿菌parasuis, HPS)是一種 NAD (Nicotinamide adenine dinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸即輔酶I )依賴型、不運動的革蘭氏陰性細小桿菌， 屬于巴斯德菌科(Pastteurellacea)嗜血桿菌屬(Haemophilus)。HPS常引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎以及腦膜炎，由該菌引起的病又稱為豬革拉斯氏病。該菌是在1922年由 khermer和Ehrlich首次分離出來的，但是直到1992才通過SPF (Specific Pathogen Free，無特定病原體)豬證實HPS的致病性以及不同血清型菌株之間的毒力差異。據(jù)調查， HPS可以影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，通常見于5周齡 8周齡的豬，發(fā)病率可達40%，嚴重時死亡率可達50%。HPS還可感染生產母豬，引起流產、產死胎或弱仔等。隨著養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展，豬場規(guī)?；?、集約化程度的不斷提高，豬群飼養(yǎng)密度越來越大，副豬嗜血桿菌感染有明顯增加趨勢，已成為豬場保育豬發(fā)病和死亡的一個重要原因。另外，一些免疫抑制性疾病如豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病等經常與 HPS混合感染或繼發(fā)感染，對全球的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失，也給副豬嗜血桿菌病的診斷和綜合防治帶來更多的難度。近年來，副豬嗜血桿菌病已在我國普遍流行，在我國的主要養(yǎng)豬區(qū)域如廣東、河南、湖北、湖南、山東、江西、河北、上海、吉林、四川、浙江、甘肅、江蘇等省份都有副豬嗜血桿菌病發(fā)生以及HPS分離鑒定的報道。而HPS的真實發(fā)病率可能為實際確診的10倍之多，給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的威脅，已經引起了政府和社會上的高度重視。由于HPS耐藥性現(xiàn)象越來越常見，常用的抗生素對副豬嗜血桿菌病已無明顯的療效，而且隨著人們對綠色食品需求的期望越來越高，抗生素在本病預防和控制等方面的應用必將受到嚴格限制和逐步禁止，疫苗免疫成為預防和控制副豬嗜血桿菌病的主要措施。 由于HPS血清型較多，且不同血清型的菌株，其毒力與致病力差異較大，各個血清型之間免疫交叉保護力很低，不同地方分離的菌株具有較強的地方性特征，致使現(xiàn)有國內外的副豬嗜血桿菌商品化疫苗不能對該病提供完全有效的免疫保護。因此發(fā)掘更多的交叉保護性好且免疫原性強的HPS并利用其研制高效的副豬嗜血桿菌疫苗是該病防控的迫切需要。Bak, Riising于2002年在《Veterinary record))上報道了一種血清5型副豬嗜血桿菌滅活疫苗，并評估了免疫豬群對同源和異源副豬嗜血桿菌0 parasuis)進行實驗感染后其保護性免疫的形成。5 7周齡的豬群免疫2周后，同源攻毒(血清5型非疫苗株) 的保護率可達到80% (4/5);血清1型副豬嗜血桿菌攻毒的保護率可達40% (2/5);血清12 型副豬嗜血桿菌攻毒的保護率可達100% (5/5)；血清13型副豬嗜血桿菌攻毒的保護率可達75% (3/4)；血清14型副豬嗜血桿菌攻毒的保護率可達100% (5/5)。可見，該血清5型副豬嗜血桿菌滅活疫苗不僅可保護同源攻毒，還可為異源攻毒(血清1、12、13和14)提供部分保護。

發(fā)明內容
為了解決以上現(xiàn)有國內外的副豬嗜血桿菌商品化疫苗各個血清型之間免疫交叉保護力低、免疫原性不強的問題，本發(fā)明提供了一種免疫原性強的副豬嗜血桿菌LC株。本發(fā)明還提供了所述副豬嗜血桿菌LC株在制備各個血清型之間免疫交叉保護力強的滅活疫苗中的應用。本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的
一種副豬嗜血桿菌OyaewoMih1S parasuis) LC株,其保藏編號為CGMCC No. 5257。所述的副豬嗜血桿菌(Jbemophilus parasuis) LC株在制備副豬嗜血桿菌滅活疫苗中的應用。優(yōu)選所述副豬嗜血桿菌滅活疫苗為油乳劑疫苗或鋁膠疫苗。優(yōu)選所述副豬嗜血桿菌滅活疫苗為鋁膠疫苗。所述鋁膠疫苗中含菌量彡2. 5 X IO9 CFU/mL。本發(fā)明的有益效果副豬嗜血桿菌LC株對豬有較強的致病性，且具有良好的免疫原性，應用其制備的滅活鋁膠疫苗安全可靠，不僅能提供同源攻毒保護，還可為血清4型、5 型、10型、12型、14型和15型HPS等異源攻毒提供一定的交叉保護，免疫后能夠產生較強免疫力，接種豬群的發(fā)病率和死亡率均明顯減少，其免疫效果達到或優(yōu)于市場上現(xiàn)有的商品化疫苗，具備了與國內外同類產品競爭的優(yōu)勢，能夠有效預防副豬嗜血桿菌病的流行和傳播，降低本病造成的經濟損失，有著廣闊的應用前景。菌株保藏信息
保藏時間2011年9月17日，
保藏單位中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)， 保藏編號CGMCC No. 5257，
保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所， 分類命名副豬嗜血桿菌OyaewpoA/im parasuis).


附圖1為攻毒試驗中腹腔注射不同劑量LC株菌液后仔豬體溫變化狀況。
具體實施例方式為了更好的理解本發(fā)明，下面結合具體實施例來進一步說明。實施例1:
副豬嗜血桿菌(MaemophiIus ^araMi1S)LC株，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No. 5257。生產用培養(yǎng)基
TSA培養(yǎng)基配制稱取4 g TSA粉末加入100 mL蒸餾水中，充分混勻后，121°C滅菌15 min,冷卻至50°C 60°C時，加入終濃度0. 001% NAD和5%新生牛血清，混合均勻后傾倒平板備用。TSB培養(yǎng)基配制稱取3 g TSB粉末加入100 mL蒸餾水中，121°C滅菌15 min。臨用前加入終濃度0. 001% NAD和5%新生牛血清，混合均勻后配制而成。
1. 1 HPS菌株的分離純化方法
從山東省聊城疑似副豬嗜血桿菌病的某大型養(yǎng)豬場選取病豬，無菌采集病豬的心包積液、胸腔積液、關節(jié)液和心血劃線接種于含0.001% NAD (Nicotinamide adenine dinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸即輔酶I )和5%新生牛血清的TSA (Tryptic Soy Agar，胰蛋白胨大豆瓊脂)培養(yǎng)基上，置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h 72 h，挑取圓形、光滑濕潤、無色透明的露珠狀小菌落革蘭氏染色鏡檢，選取革蘭氏陰性細小桿菌進行劃線純培養(yǎng)。將純培養(yǎng)菌株分別劃線接種于鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板，同時水平劃線接種鮮血瓊脂平板后，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，37°C培養(yǎng)M h 48 h，選取在鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板上不生長，但與金黃色葡萄球菌在鮮血瓊脂平板上共同培養(yǎng)時呈現(xiàn)明顯的“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”且不溶血的微小菌落進行純化培養(yǎng)。將進一步純化培養(yǎng)的兩株菌株，分別接種于含NAD的微量生化反應管，37°C培養(yǎng) 48 h，結果均為硝酸鹽還原試驗陽性，吲哚試驗陰性，脲酶試驗陰性，氧化酶試驗陰性，接觸酶試驗陽性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和果糖，不發(fā)酵麥芽糖、半乳糖、木糖和甘露醇。該菌株根據(jù)其病豬的來源地命名為LC株。1. 2 16S rRNA基因序列測定與分析
1.2.1引物設計根據(jù)HPS 16S rRNA (GenBank No: M75065)序列設計引物，上游引物5，-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3，，下游引物5，-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3，，該引物擴增編碼16S rRNA長度約為822 bp的特異片段，引物由上海生物工程有限公司合成。1. 2. 2細菌DNA模板的制備將被檢菌株菌液5000 r/min離心5 min,棄上清液， 用無菌水重懸后，于沸水中煮沸10 min，-20°C凍結、融化后，10000 r/min離心5 min，取上清液作模板進行PCR擴增。1. 2. 3 PCR 擴增將細菌 DNA 模板 3 μ , 10 倍 PCR 緩沖液 2. 5 PL、dNTP( 10 mmol/ L)0. 5 μ 、引物各 1 μ (10 Mmol/L)和 TaqDNA 聚合酶 0. 25 μ (5 U/μ )混合，加水至 25 PL，94°C預變性 5 min，94°C變性 30 s、58°C退火 30 s、72°C延伸 1 min，循環(huán)；34 次，最后 72°C延伸10 min, PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到822 bp大小的特異DNA條帶。 用DNA快速回收試劑盒回收PCR產物，-20°C保存?zhèn)溆谩?. 2. 4 16S rRNA擴增產物的克隆與測序將回收的PCR產物與pMD19_T在16°C 連接30 min，轉化DH5a感受態(tài)細菌，37°C過夜培養(yǎng)12 h 16 h。挑取平板上的單菌落于氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中37°C過夜振蕩培養(yǎng)，次日應用菌液PCR的方法擴增16S rRNA基因篩選陽性克隆，鑒定為陽性的菌液提取質粒交由上海生工公司測序。LC株16S rRNA基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，將序列在GenBank中進行BLAST比對，與已發(fā)布的副豬嗜血桿菌相應序列的同源性達到98. 5%以上。1.3 HPS LC株的血清學鑒定
將LC株分別密集劃線接種于TSA培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)20 h M h后，用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗下菌落，將懸液稀釋至含菌量為3. OX IO9 CFU/mL，12rC高壓2 h，菌液7000 r/min 離心10 min，取上清用于瓊脂擴散試驗的分型抗原。用生理鹽水配制1%的瓊脂糖凝膠，根據(jù)需要在相應的瓊脂糖凝膠孔中加抗原和相應的抗血清，以剛加滿孔為宜，濕盒內37°C下放置M h 48 h，可見LC株于1型血清孔與抗原孔之間出現(xiàn)清晰的白色沉淀線，故判定副豬嗜血桿菌LC株為血清1型。
1. 4動物攻毒試驗
1.4.1攻毒菌液的制備分別挑取HPS LC株單菌落密集劃線接種于TSA培養(yǎng)基，37°C 培養(yǎng)12 h 16 h后，用PBS收獲細菌。將菌液涂布于TSA培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)20 h后，用 PBS收獲細菌，并將菌液的活菌數(shù)調整為3. OX IO9 CFU/mL。1.4.2動物攻毒試驗結果取3周齡 4周齡健康易感仔豬40頭，隨機分成4 組，每組10頭，其中3組分別以1 mL、1. 5 mL和2mL三個不同劑量進行腹腔注射LC株菌液 (3.0X109 CFU/mL)，另外1組注射滅菌生理鹽水2 mL作為對照。攻毒組大部分仔豬的體溫在攻毒第二天或第三天開始升高，持續(xù)三四天后，體溫逐漸恢復正常，如圖1所示；其還出現(xiàn)被毛粗亂、精神沉郁、食欲減退、呼吸困難、關節(jié)腫大、跛行、甚至死亡等臨床癥狀；剖檢可觀察到其胸腹腔積液增多、胸腹腔內粘連甚至出現(xiàn)纖維素性滲出物、心包積液增多甚至心包膜增厚有纖維素滲出物、全身淋巴結腫大、或后肢關節(jié)腔內關節(jié)液增多甚至有膠凍樣滲出物。LC株的攻毒劑量越大，試驗豬的最高體溫越高，死亡越快，其發(fā)病率和死亡率越大。 攻毒組仔豬的發(fā)病率和死亡率如表1所示。對照組仔豬的體溫無明顯變化，亦無發(fā)病和死亡。由于用1.5 mL菌液(3. OX IO9 CFU/mL)攻毒可使仔豬發(fā)病率達到80%，所以后面的LC 株攻毒試驗選用1. 5 mL劑量。表1 LC株不同攻毒劑量仔豬的發(fā)病率和死亡率
權利要求
1.一種副豬嗜血桿菌(Memophilus parasuis)LC株，其特征在于其保藏編號為CGMCC No. 5邪7。
2.權利要求1所述的副豬嗜血桿菌OYa^oMiAz1S/^rawi^LC株在制備副豬嗜血桿菌滅活疫苗中的應用。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于所述副豬嗜血桿菌滅活疫苗為油乳劑疫苗或鋁膠疫苗。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的應用，其特征在于所述副豬嗜血桿菌滅活疫苗為鋁膠疫田ο
5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于所述鋁膠疫苗中含菌量>2.5X109CFU/mLo
全文摘要
本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物制品中副豬嗜血桿菌疫苗領域，特別涉及一種副豬嗜血桿菌LC株，其保藏編號為CGMCCNo.5257。副豬嗜血桿菌LC株在制備副豬嗜血桿菌滅活疫苗中的應用。副豬嗜血桿菌LC株對豬有較強的致病性，且具有良好的免疫原性，應用其制備的滅活鋁膠疫苗安全可靠，不僅能提供同源攻毒保護，還可為血清4型、5型、10型、12型、14型和15型HPS異源攻毒提供較好的交叉保護，免疫后能夠產生較強免疫力，接種豬群的發(fā)病率和死亡率均明顯減少，其免疫效果達到或優(yōu)于市場上現(xiàn)有的商品化疫苗，具備了與國內外同類產品競爭的優(yōu)勢，能夠有效預防副豬嗜血桿菌病的流行和傳播，降低本病造成的經濟損失，有著廣闊的應用前景。
文檔編號A61P31/04GK102399724SQ20111034996
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權日2011年11月8日
發(fā)明者叢曉燕, 于江, 吳家強, 張玉玉, 杜以軍, 王大鵬, 王金寶 申請人:山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所