一種副豬嗜血桿菌菌株的制作方法
【專利說明】一種副豬嗜血桿菌菌株 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種副豬嗜血桿菌菌株。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 副豬嗜血桿菌病曾一度被認(rèn)為是由應(yīng)激引起的仔豬條件性、散發(fā)性疾病，隨著養(yǎng) 豬工業(yè)化、集約化程度的提高，如今其已成為危害仔豬和生長豬最嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病。
[0003] 副豬嗜血桿菌主要危害2~28周齡的仔豬和生長豬，以5-8周齡斷奶保育仔豬危 害最為嚴(yán)重，引起多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎等癥狀，發(fā)病率高達(dá)15 %~90%，死亡率有時可高 達(dá)90%。起初副豬嗜血桿菌被稱為豬嗜血桿菌或豬流感嗜血桿菌，后來證實其生長不需要 X因子（血紅素和其他卟啉類的物質(zhì)），因而改名為副豬嗜血桿菌。副豬嗜血桿菌具有多形 態(tài)性，生長時嚴(yán)格需要NAD或V因子，血清型復(fù)雜多樣，根據(jù)同型細(xì)菌外膜蛋白抗原的不同， 至少可分為15種血清型，另有20%以上的分離株不能分型；而且不同國家或地區(qū)的流行血 清型不同，據(jù)蔡旭旺等報道，認(rèn)為我國當(dāng)前流行的血清型主要有4,5,12,13型，但不同地方 的優(yōu)勢血清型有所不同，所以對病的防控增加難度。根據(jù)我國血清流行病學(xué)調(diào)查和分離菌 株的鑒定，以4、5型最為流行，其次是12型、13型。近年來，各副豬嗜血桿菌血清群之間交 互免疫力不強，接種的疫苗菌株血清群與當(dāng)時當(dāng)?shù)亓餍械母必i嗜血桿菌病的病原血清群不 相符，給副豬嗜血桿菌的預(yù)防和治療帶來了一定的難度。
[0004] 目前國內(nèi)用于副豬嗜血桿菌病免疫預(yù)防的疫苗有勃林格殷格翰動物保?。绹?有限公司生產(chǎn)的副豬嗜血桿菌病滅活疫苗（Z-1517株），西班牙海博萊生物大藥廠生產(chǎn)的 豬副豬嗜血桿菌病1型和6型滅活疫苗，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公 司、中牧實業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的副豬嗜血桿菌病4型和5型滅活疫苗；這些疫苗的應(yīng)用起 到了一定的預(yù)防作用，而該病的病原流行株和多種血清型感染已經(jīng)使現(xiàn)有疫苗很難達(dá)到預(yù) 期的免疫效果，因此，用于參與制備防治多種血清型副豬嗜血桿菌病原引起的副豬嗜血桿 菌病疫苗的合適毒株是從業(yè)人員所迫切需要解決的問題。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種副豬嗜血桿菌菌株LYW1(Haemophilus parasuis)，于2015年07月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCCNo. 11146。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的：
[0007] 2011年，申請人在無菌條件下采集福建省泉州市新羅某豬場中疑似Hps發(fā)病仔豬 的肺臟、關(guān)節(jié)積液、氣管，并分別劃線接種于TSA培養(yǎng)基，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，燭缸厭氧 培養(yǎng)24-48h，將培養(yǎng)獲得的菌株進(jìn)行理化特性與分子學(xué)鑒定，最終確定其為副豬嗜血桿菌 菌屬的一個菌株。
[0008] 本發(fā)明的有益效果在于：提供一種副豬嗜血桿菌菌株LYW1(Haemophilus parasuis)，該菌株能夠用于參與制備防治多種血清型的副豬嗜血桿菌引起的疾病的疫苗， 最終所制得的疫苗安全性及防治能力均良好。 【【附圖說明】】
[0009] 下面參照附圖結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0010] 圖1是本發(fā)明實施例1-5中PCR產(chǎn)物的1. 0%瓊脂糖凝膠電泳圖。 【【具體實施方式】】
[0011] 本發(fā)明中副豬嗜血桿菌菌株LYW1(Haemophilusparasuis)是2011年時將采集自 福建省泉州市新羅某豬場中疑似Hps發(fā)病仔豬的肺臟、關(guān)節(jié)積液進(jìn)行培養(yǎng)得到的菌株。且 需要說明的是，本發(fā)明中還涉及了其它幾個菌株，分別為副豬嗜血桿菌菌株LYD1、副豬嗜血 桿菌菌株LYH5、副豬嗜血桿菌菌株LY02及副豬嗜血桿菌菌株LYC2。
[0012] 副豬嗜血桿菌菌株LYD1(Haemophilusparasuis)于2015年07月21日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 保藏編號為CGMCCNo. 11143 ;副豬嗜血桿菌菌株LYH5(Haemophilusparasuis)于2015年 07月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCCNo. 11144 ;副豬嗜血桿菌菌株LY02(Haemophilus parasuis)于2015年07月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCCNo. 11145 ;副豬嗜血桿菌 菌株LYC2(Haemophilusparasuis)于2015年07月21日保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No.11147。
[0013] 為了對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述說明，申請人給出了如下具體實施例為了對本發(fā)明進(jìn) 行詳細(xì)闡述說明，申請人給出了如下具體實施例。
[0014] 實施例1菌株LYW1的分離與鑒定
[0015] 1、菌株LYW1的分離：
[0016] 2011年，申請人在無菌條件下采集福建省泉州市新羅某豬場中疑似Hps發(fā)病仔豬 的肺臟、關(guān)節(jié)積液、氣管，并分別劃線接種于TSA培養(yǎng)基，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，燭缸厭氧 培養(yǎng)24-48h，將培養(yǎng)獲得的菌株命名為菌株LYW1。
[0017] 2、菌株LYW1的鑒定：
[0018] 初步鑒定：
[0019] 將所獲得的菌株LYW1進(jìn)行形態(tài)學(xué)與生化特性的測定，結(jié)果如下：呈革蘭氏陰性， 細(xì)小桿菌，具有多種不同的形態(tài)，從單個的球桿菌到長的、細(xì)長的、以致絲狀的菌體；無溶血 現(xiàn)象、分離株不產(chǎn)生吲哚，能發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖，不發(fā)酵木糖、L-阿拉伯糖、乳糖、棉子 糖，接觸酶、尿素酶試驗陰性，對甘露糖生化反應(yīng)不穩(wěn)定，生長均需要V因子而不需要X因 子；因此，可初步認(rèn)定菌株LYW1屬于副豬嗜血桿菌菌屬。
[0020] 進(jìn)一步鑒定：
[0021] 提取模板：挑取菌株LYW1的單菌落進(jìn)行亞克隆培養(yǎng)，用滅菌的雙蒸水小心刮洗 菌苔并置于1. 5mL離心管中，之后于12000rpm下離心30s，棄上清，保留細(xì)胞沉淀；接著加 入567μLTE懸浮沉淀，用等體積第一抽提液（體積比為25 : 24 : 1的酚：氯仿：異戊 醇）抽提，使兩相完全混合，冰浴10分鐘；然后12000rpm離心10分鐘，吸取上清液，等體 積第二抽提液（體積比為24 : 1的氯仿：異戊醇）再抽提1次，至溶液中有絮狀的DNA沉 淀出現(xiàn)；將DNA沉淀轉(zhuǎn)移到lmL70 %乙醇中洗滌，再于65 °C干燥箱中干燥2分鐘；最后用 50-100μLTE緩沖液（含20μg/mLRNase)溶解DNA沉淀，即為所需的模板，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0022] PCR鑒定：委托上海生工生物工程有限公司合成上游引物P1 (如SEQIDN0 : 1 所示）：5'-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3' ；下游引物P2(如SEQIDNO:2 所示）： 5,-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3, 。
[0023] 以本實施例提取所獲得模板為模板，且以上述引物（P1/P2)為引物對進(jìn)行PCR反 應(yīng)，并以現(xiàn)有公認(rèn)的副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陰性對照：
[0024]PCR反應(yīng)體系（50yL) :10XPCRBuffer(Mg2+)5yL，2. 5mmol/LdNTPs4yL，5U/ yLTaqDNA聚合酶 0.5yL，H20 36.5 4 1^，10 4111〇1/1上游引物14 1^1(^111〇1/1下游引物 1μL，模板 2μL;
[0025] PCR反應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性5min;接著94°C變性30s，58°C退火30s，72°C復(fù)性 lmin，重復(fù)30個循環(huán)；最后72°C下延伸7min。
[0026] PCR產(chǎn)物的檢測：將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，以DNA MarkerDL2000作為標(biāo)準(zhǔn)分子量，80V電壓、1XTAE緩沖液中電泳20min。
[0027] 即進(jìn)行凝膠電泳分離檢驗，電泳分離檢驗結(jié)果如圖1 (圖1中，Μ為DNAladder;1 為本實施例待測菌株；2為陰性對照；3為雙蒸水空白對照）所示，由圖1可知，本實施例待 測菌株即菌株LYW1同副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株一樣，均在821bp位置擴增出單一條帶，即確 認(rèn)該菌株LYW1與副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株同屬于同一菌屬。
[0028] 依據(jù)上述的鑒定，最終確認(rèn)菌株LYW1屬于副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis)菌屬的一個菌株。
[0029] 血清型鑒定：將菌株LYW1接種于TSA培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)大量增殖后，于7000r/min 下離心取菌體；往菌體中加入9體積倍于菌體的pH7. 4PBS緩沖溶液，121°C蒸汽處理2h， 再7000r/min離心lOmin取上清液并進(jìn)行瓊脂擴散試驗，具體根據(jù)Keilstein和Rapp- Gabrielson所建立的瓊脂擴散試驗法鑒定其Hps血清型，鑒定結(jié)果為Hps12型。
[0030] 實施例2菌株LYD1的分離與鑒定
[0031] 1、菌株LYD1的分離：
[0032] 2009年，申請人在無菌條件下采集福建省泉州市新羅某豬場中疑似Hps發(fā)病仔豬 的肺臟、關(guān)節(jié)積液、氣管，并分別劃線接種于TSA培養(yǎng)基，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，燭缸厭氧 培養(yǎng)24-48h，將培養(yǎng)獲得的菌株命名為菌株LYD1。
[0033] 2、菌株