專利名稱：一種利用發(fā)酵牛膽汁和復(fù)合膽紅素鈣制備牛膽結(jié)石的方法
一種利用發(fā)酵牛膽汁和復(fù)合膽紅素鈣制備牛膽結(jié)石的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種中藥原料藥的制造方法，尤其涉及一種制備牛膽結(jié)石的方法。
背景技術(shù)：
牛膽結(jié)石即牛黃，是珍貴的中藥材。它具有清心、豁痰、開(kāi)竅、涼肝、息風(fēng)、解毒等功效。我國(guó)許多名貴中成藥，如安宮牛黃丸、六神丸等均以牛黃為主藥配制而成。但是牛體內(nèi)自然成石率僅為廣2%，因此，藥用資源非常稀缺，價(jià)格昂貴，依賴進(jìn)口，不僅花費(fèi)了大量的外匯，而且也制約了我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展。
1956年以來(lái)，我國(guó)的醫(yī)藥工作者積極從事人工牛黃的研究，1971年人工牛黃應(yīng)用于中成藥組方中，部分緩解了天然牛黃的供需矛盾。但這種人工牛黃主要是膽酸、豬去氧膽酸和極微量的膽紅素以及大量淀粉研末過(guò)篩而得的粉末，不是牛膽結(jié)石，其成份、結(jié)構(gòu)、含量及已知各種微量成份均與天然牛黃相差太遠(yuǎn)，不具備天然牛黃的性狀、結(jié)構(gòu)、成份、含量特征，臨床療效遠(yuǎn)不及天然牛黃。
上世紀(jì)70年代以來(lái)，我國(guó)云南、廣東、內(nèi)蒙等地的醫(yī)藥工作者，在活牛膽囊內(nèi)培植牛黃的實(shí)驗(yàn)研究獲得了成功。但需對(duì)牛體進(jìn)行剖腹手術(shù)并且該手術(shù)比較復(fù)雜，而且2 3年才能剖腹取出尼龍絲網(wǎng)，刮下棕黃色附著物。成石率低，產(chǎn)量小，膽紅素含量低，質(zhì)量不穩(wěn)定。而且，此產(chǎn)品并不是牛膽結(jié)石，而是沉積在尼龍絲網(wǎng)上的棕黃色膽色素鈣顆粒及粘液。 刮下干燥后所形成的粉末。因此，不可能規(guī)?；a(chǎn)。
上世紀(jì)70年代初，武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院肝膽外科蔡紅嬌醫(yī)師在對(duì)人類膽結(jié)石形成的原因和機(jī)理進(jìn)行研究，并獲得成功的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用此原理進(jìn)行牛膽囊膽汁內(nèi)培育牛膽結(jié)石的研究，取得了成功并于1989年申報(bào)了 “一種人工體外制作牛膽結(jié)石的方法”的發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?9100505. 6)。利用該方法制作的牛膽結(jié)石，其外觀、結(jié)構(gòu)、成份、含量與天然牛黃基本相同。但是限于當(dāng)時(shí)的條件，特別是1985版《中國(guó)藥典》對(duì)牛黃的膽酸、膽紅素含量未作規(guī)定，因此，其制成的牛膽結(jié)石的膽紅素、膽酸等含量較低。不僅如此，上述方法除配方的牛膽汁之外，制備膽紅素鈣，多用豬膽汁代替，膽汁未經(jīng)細(xì)菌發(fā)酵即可以成石。因此，其制成的牛膽結(jié)石卻含有豬去氧膽酸。中國(guó)藥典1990年版一部明確規(guī)定 牛黃是牛膽結(jié)石，含膽紅素35%以上，膽酸6%以上，并規(guī)定了相應(yīng)的鑒別和檢測(cè)方法。因此用上述方法制成的牛膽結(jié)石不能滿足新的《中國(guó)藥典》對(duì)牛膽結(jié)石規(guī)定的藥用要求。
2000年，由武漢大鵬藥業(yè)有限公司組織科研人員在ZL89100505. 6發(fā)明專利的基礎(chǔ)上，根據(jù)1990年版《中國(guó)藥典》要求，研制了一種新的在牛體外制備牛膽結(jié)石(即體外培育牛黃)的方法。該方法既適應(yīng)規(guī)?；a(chǎn)要求，生產(chǎn)出的產(chǎn)品又能滿足新的《中國(guó)藥典》 要求。并于2001年申報(bào)了專利(申請(qǐng)?zhí)?1133550. 5)。該方法是在牛膽汁加入一定量的大腸桿菌、腸球菌、變形桿菌的單一菌液或其組合菌液，對(duì)牛膽汁進(jìn)行細(xì)菌發(fā)酵處理。再利用發(fā)酵牛膽汁和澄清飽和鈣鹽溶液制取有效成份的沉淀物，然后根據(jù)藥用要求加入適量的膽紅素、膽酸、去氧膽酸和無(wú)機(jī)鹽后，制作復(fù)合膽紅素鈣。再利用復(fù)合膽紅素鈣和發(fā)酵牛膽汁在體外培育牛膽結(jié)石。由于現(xiàn)在生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，原方法中的有效成份容易分解，外形不均一，自然干燥方式周期太長(zhǎng)，已不能適應(yīng)更大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)要求。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是在ZL01133550. 5發(fā)明專利的基礎(chǔ)上，根據(jù)更大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)要求和成本控制原則而研制的一種生產(chǎn)周期更短，成本更低的在牛體外制作牛膽結(jié)石(即體外培育牛黃)的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下1、制備成石膽汁在15 37°C下，每千克干燥的復(fù)合膽紅素鈣混合發(fā)酵牛膽汁50(Tl500ml、0. 4g 1. 2g 焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉或硫代硫酸鈉的單一組份或其混合物作為抗氧劑，再按發(fā)酵牛膽汁純化水(廣3) 1的體積比例加入純化水，充分?jǐn)嚢韬?，靜置，制成成石膽汁；2、培育牛膽結(jié)石對(duì)成石膽汁用酸液調(diào)節(jié)PH值在6. 8以下，然后對(duì)成石膽汁進(jìn)行偏軸定向旋轉(zhuǎn)，待形成類球形結(jié)石后，停止旋轉(zhuǎn)，靜置培育，取出結(jié)石；3、牛膽結(jié)石的整形取出結(jié)石，放入整形機(jī)中，在轉(zhuǎn)速300 500轉(zhuǎn)/分鐘，溫度18l6°C的條件下整形15 30 分鐘，4、牛膽結(jié)石的低溫真空干燥將整形后的牛膽結(jié)石放入低溫真空干燥箱中，在溫度2(T40 °C，真空度 0. 015 0. 045MPa的條件下干燥18 30小時(shí)。
抗氧劑是一類能夠有效阻止或延緩自動(dòng)氧化的物質(zhì)，主要用于防止藥物的氧化變質(zhì)。藥物的氧化反應(yīng)是引起藥物不穩(wěn)定的主要因素之一。膽紅素的氧化分解是含有自由基的自氧化過(guò)程，在這一過(guò)程中僅有很少的氧就能引起反應(yīng)。而空氣中的氧氣占21% (ν/ν), 在如此多氧的存在下，膽紅素不需要其他氧化劑的參與，室溫就能自發(fā)引起“自氧化反應(yīng)”。 這種反應(yīng)的過(guò)程很復(fù)雜，屬于游離基誘發(fā)的“鏈反應(yīng)”，光和熱能加速這種反應(yīng)的進(jìn)行，微量的金屬離子或過(guò)氧化物也會(huì)催化這種反應(yīng)。在自氧化過(guò)程中，抗氧劑的作用是提供電子或有效氫離子，供給自由基接受，使自氧化鏈反應(yīng)中斷。膽紅素氧化的結(jié)果，使有效成份的含量降低，影響了產(chǎn)品療效?？寡鮿┍旧硎且环N還原劑，與有效成份同時(shí)存在時(shí)，抗氧劑遇氧后首先被氧化，對(duì)易氧化的有效成份起到保護(hù)作用，從而保證有效成份的穩(wěn)定性。因此，為了抑制氧分子對(duì)氧化反應(yīng)的作用，就有必要加入抗氧劑。
成形后的牛膽結(jié)石在整形機(jī)中不斷地、連續(xù)地、重復(fù)地做出復(fù)雜的多軌跡運(yùn)動(dòng)，從而使牛膽結(jié)石表面堅(jiān)固、致密、平整、光滑，有效地改善了產(chǎn)品的均一性，提高了成品率，杜絕了表面物料的脫落，減少了有效成份的損耗，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。
根據(jù)2010版《中國(guó)藥典》的規(guī)定，體外培育牛黃的水分應(yīng)控制在9%以下。牛膽結(jié)石中的水分子在負(fù)壓的環(huán)境下，沸點(diǎn)降低，從而能夠在較低的溫度下迅速?gòu)漠a(chǎn)品的孔隙中變成氣態(tài)并被抽走，最終能夠在較短的周期內(nèi)達(dá)到干燥的目的，符合2010版《中國(guó)藥典》的要求。而且，始終保持低溫環(huán)境，也最大程度地避免了膽紅素等有效成份的降解。
本發(fā)明方法中的發(fā)酵牛膽汁按照現(xiàn)有技術(shù)中方法制備，一般包括如下步驟(1)調(diào)節(jié)天然牛膽汁中的?；撬岷浚蛊溥_(dá)到藥用要求39Γ7%，(2)將大腸桿菌、變形桿菌或腸球菌的單一菌液或其組合菌液接種到牛膽汁中，進(jìn)行發(fā)酵處理。
本發(fā)明方法中的復(fù)合膽紅素鈣按照現(xiàn)有技術(shù)中方法制備，一般包括如下步驟(1)取出一定量的發(fā)酵牛膽汁，加入廣4倍體積的澄清飽和氧化鈣溶液，對(duì)其進(jìn)行攪拌，加熱至沸騰，濾取棕紅色沉淀物；(2)在棕紅色沉淀物中，加入適量水對(duì)其攪拌、洗滌，靜置后濾去上清液，再依據(jù)藥用要求加入適量的膽紅素、膽酸、去氧膽酸和無(wú)機(jī)鹽，攪拌混勻。
根據(jù)本發(fā)明制備的牛膽結(jié)石各項(xiàng)指標(biāo)均符合2010版《中國(guó)藥典》關(guān)于體外培育牛黃的要求，而且生產(chǎn)周期大大縮短，有效減少了能源耗用，成本明顯下降。具有較好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1利用發(fā)酵牛膽汁和復(fù)合膽紅素鈣制備牛膽結(jié)石的工藝流程圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1(1)制備發(fā)酵牛膽汁①取出新鮮牛膽汁，按優(yōu)質(zhì)牛黃的要求，調(diào)節(jié)?；撬岷渴蛊溥_(dá)到7%(g/ml)，置于消毒罐內(nèi)，低溫保存?zhèn)溆谩?br> ②將牛膽汁置于發(fā)酵罐，按每10000ml牛膽汁接種IOOml菌體溶液的比例，將大腸桿菌和變形桿菌的組合菌液接種至牛膽汁中，發(fā)酵80小時(shí)，即得。
(2)制備復(fù)合膽紅素鈣①取發(fā)酵牛膽汁10000ml加入11000ml澄清飽和氧化鈣溶液，攪拌、煮沸，冷卻后，取出棕紅色沉淀物。
②棕紅色沉淀物加純化水10000 ml，充分?jǐn)嚢?，靜置后傾去上清液，每569g沉淀 (干重)加入膽紅素350g，再加入膽酸50g、去氧膽酸25g、硫酸鋅3g、硫酸鎂3g，攪拌、混勻。
(3)取500ml的發(fā)酵牛膽汁，在37°C下加入到IKg的復(fù)合膽紅素鈣中(復(fù)合膽紅素按干燥后的重量計(jì)算)，再加入0. 4g焦亞硫酸鈉，再加入500ml純化水，充分?jǐn)嚢韬螅o置， 制成成石膽汁。成石膽汁用酸液進(jìn)行PH調(diào)節(jié)，使其PH值在6.0以下。然后對(duì)成石膽汁進(jìn)行偏軸定向旋轉(zhuǎn)，待其形成類球形結(jié)石后，停止旋轉(zhuǎn)，靜置培育，取出結(jié)石。
(4)取出結(jié)石，放入整形機(jī)中，調(diào)整轉(zhuǎn)速至300轉(zhuǎn)/分鐘，在溫度18°C、相對(duì)濕度 60%的條件下整形15分鐘，取出結(jié)石。
(5)將整形后的結(jié)石放入低溫真空干燥箱中，在溫度20°C，真空度0. 015MPa的條件下干燥30小時(shí)。即得牛膽結(jié)石成品。
上述成品呈均一的球形，直徑0. 5-3cm，表面光滑，呈黃紅色至棕黃色。體輕，質(zhì)松脆，斷面有同心層紋。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)膽紅素含量，薄層掃描儀檢測(cè)膽酸含量，符合 《中國(guó)藥典》2010版P162中體外培育牛黃的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。
實(shí)施例2(1)制備發(fā)酵牛膽汁①殺牛時(shí)，在無(wú)菌操作重要條件下，摘取膽囊，先用無(wú)雜質(zhì)、未受污染、金黃色者，傾出膽汁于消毒罐內(nèi)，按優(yōu)質(zhì)牛黃的要求，調(diào)節(jié)?；撬岷渴蛊溥_(dá)到6% (g/ml)，低溫保存?zhèn)溆谩?br> ②將牛膽汁置于發(fā)酵罐，按每10000ml牛膽汁接種200ml菌體溶液的比例，將大腸桿菌接種至牛膽汁中，發(fā)酵96小時(shí)，即得。
(2)制備復(fù)合膽紅素鈣①取發(fā)酵牛膽汁10000ml加入30000ml澄清飽和氧化鈣溶液，攪拌、煮沸，冷卻至50°C， 取出棕紅色沉淀物。
②棕紅色沉淀物加冷開(kāi)水10000 ml，充分?jǐn)嚢瑁o置后傾去上清液，每390g沉淀物(干重)加入膽紅素450g，再加入膽酸100g、去氧膽酸50g、硫酸鋅5g、硫酸鎂5g，攪拌、混勻，即得。
(3)取IOOOml的發(fā)酵牛膽汁，在下加入到IKg的復(fù)合膽紅素鈣中(復(fù)合膽紅素按干燥后的重量計(jì)算)，再加入0. Sg亞硫酸氫鈉，再加入500ml純化水，充分?jǐn)嚢韬?，靜置， 制成成石膽汁。成石膽汁用酸液進(jìn)行PH調(diào)節(jié)，使其PH值在6. 4以下。然后對(duì)成石膽汁進(jìn)行偏軸定向旋轉(zhuǎn)，待其形成類球形結(jié)石后，停止旋轉(zhuǎn)，靜置培育，取出結(jié)石。
(4)取出結(jié)石，放入整形機(jī)中，調(diào)整轉(zhuǎn)速至400轉(zhuǎn)/分鐘，在溫度22°C、相對(duì)濕度 65%的條件下整形15分鐘，取出結(jié)石。
(5)將整形后的結(jié)石放入低溫真空干燥箱中，在溫度30°C，真空度0. 03MPa的條件下干燥M小時(shí)。即得牛膽結(jié)石成品。
上述成品呈均一的球形，直徑0. 5-3cm，表面光滑，呈黃紅色至棕黃色。體輕，質(zhì)松脆，斷面有同心層紋。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)膽紅素含量，薄層掃描儀檢測(cè)膽酸含量，符合 《中國(guó)藥典》2010版P162中體外培育牛黃的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。
實(shí)施例3(1)制備發(fā)酵牛膽汁①取出新鮮牛膽汁，置于消毒罐內(nèi)，低溫保存?zhèn)溆谩?br> ②將牛膽汁置于發(fā)酵罐，按每10000ml牛膽汁接種300ml菌體溶液的比例，將腸球菌接種至牛膽汁中，發(fā)酵92小時(shí)，即得。
(2)制備復(fù)合膽紅素鈣①取發(fā)酵牛膽汁10000ml，濾過(guò)加入40000ml澄清飽和氧化鈣溶液，攪拌、煮沸，冷卻后取出棕紅色沉淀物。
②棕紅色沉淀物加水充分?jǐn)嚢瑁o置后傾去上清液，每213g沉淀物(干重)加入膽紅素550g，加入膽酸150g、去氧膽酸75g、硫酸鋅6g、硫酸鎂6g，攪拌、混勻，即得。
(3)取1500ml的發(fā)酵牛膽汁，在15°C下加入到IKg的復(fù)合膽紅素鈣中(復(fù)合膽紅素按干燥后的重量計(jì)算)，再加入1. 2g硫代硫酸鈉，再加入500ml純化水，充分?jǐn)嚢韬?，靜置， 制成成石膽汁。成石膽汁用酸液進(jìn)行PH調(diào)節(jié)，使其PH值在6. 8以下。然后對(duì)成石膽汁進(jìn)行偏軸定向旋轉(zhuǎn)，待其形成類球形結(jié)石后，停止旋轉(zhuǎn)，靜置培育，取出結(jié)石。
(4)取出結(jié)石，放入整形機(jī)中，調(diào)整轉(zhuǎn)速至500轉(zhuǎn)/分鐘，在溫度^°C、相對(duì)濕度 70%的條件下整形15分鐘，取出結(jié)石。
(5)將整形后的結(jié)石放入低溫真空干燥箱中，在溫度40°C，真空度0. 045MPa的條件下干燥18小時(shí)。即得牛膽結(jié)石成品。
上述成品呈均一的球形，直徑0. 5-3cm，表面光滑，呈黃紅色至棕黃色。體輕，質(zhì)松脆，斷面有同心層紋。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)膽紅素含量，薄層掃描儀檢測(cè)膽酸含量，符合 《中國(guó)藥典》2010版P162中體外培育牛黃的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。
權(quán)利要求
1.一種利用發(fā)酵牛膽汁和復(fù)合膽紅素鈣制備牛膽結(jié)石的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)制備成石膽汁在15 37°C下，每千克干燥的復(fù)合膽紅素鈣混合發(fā)酵牛膽汁50(Tl500ml、0. 4g^l. 2g 焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉或硫代硫酸鈉的單一組份或其混合物作為抗氧劑，再按發(fā)酵牛膽汁純化水(廣3) 1的體積比例加入純化水，充分?jǐn)嚢韬螅o置，制成成石膽汁；(2)培育牛膽結(jié)石對(duì)成石膽汁用酸液調(diào)節(jié)PH值在6. 8以下，然后對(duì)成石膽汁進(jìn)行偏軸定向旋轉(zhuǎn)，待形成類球形結(jié)石后，停止旋轉(zhuǎn)，靜置培育，取出結(jié)石；(3)牛膽結(jié)石的整形取出結(jié)石，放入整形機(jī)中，在轉(zhuǎn)速300 500轉(zhuǎn)/分鐘，溫度18l6°C的條件下整形15 30 分鐘，(4)牛膽結(jié)石的低溫真空干燥將整形后的牛膽結(jié)石放入低溫真空干燥箱中，在溫度2(T40 °C，真空度 0. 015 0. 045MPa的條件下干燥18 30小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的發(fā)酵牛膽汁的制備，包括調(diào)節(jié)天然牛膽汁中的?；撬岷?，使其達(dá)到藥用要求；將大腸桿菌、變形桿菌或腸球菌的單一菌液或其組合菌液接種到牛膽汁中，進(jìn)行發(fā)酵處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述的復(fù)合膽紅素鈣的制備，包括如下步驟(1)取出一定量的發(fā)酵牛膽汁，加入廣4倍體積的澄清飽和氧化鈣溶液，對(duì)其進(jìn)行攪拌，加熱至沸騰，濾取棕紅色沉淀物；(2)在棕紅色沉淀物中，加入適量水對(duì)其攪拌、洗滌，靜置后濾去上清液，再依據(jù)藥用要求加入適量的膽紅素、膽酸、去氧膽酸和無(wú)機(jī)鹽，攪拌混勻。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用發(fā)酵牛膽汁和復(fù)合膽紅素鈣制備牛膽結(jié)石的方法。在15~37℃下，每千克干燥的復(fù)合膽紅素鈣混合發(fā)酵牛膽汁500~1500ml、0.4g~1.2g焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉或硫代硫酸鈉的單一組份或其混合物作為抗氧劑，再按發(fā)酵牛膽汁純化水(1~3)1的體積比例加入純化水，充分?jǐn)嚢韬螅o置，制成成石膽汁；對(duì)成石膽汁用酸液調(diào)節(jié)pH值在6.8以下，然后對(duì)成石膽汁進(jìn)行偏軸定向旋轉(zhuǎn)，待形成類球形結(jié)石后，停止旋轉(zhuǎn)，靜置培育，取出結(jié)石；對(duì)結(jié)石進(jìn)行整形和干燥，得到成品牛膽結(jié)石。該方法添加抗氧劑，對(duì)易氧化的有效成份起到保護(hù)作用。
文檔編號(hào)A61K35/413GK102512451SQ201110430840
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者石聿新, 羅張龍, 蔡紅嬌 申請(qǐng)人:武漢健民大鵬藥業(yè)有限公司