專利名稱：木犀草素的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木犀草素，具體涉及一種木犀草素的新用途。
背景技術(shù)：
脂肪肝現(xiàn)已成為我國發(fā)病率上升最快的慢性疾病。近年來查出脂肪肝的比例逐年上升，人群中發(fā)病率為5%，并且還有年輕化的趨勢。專家指出，40%以上肥胖人都患有脂肪肝，營養(yǎng)過剩、酗酒、糖尿病是致病主要因素，其他疾病也可導致脂肪肝，比如結(jié)核病、嚴重貧血、肺心病等；另外，某些藥物或毒物也可致脂肪肝。脂肪肝的危害很多，主要包括(1) 形成肝纖維化、肝硬化。肝細胞中脂滴增多，使肝細胞脂肪變性，長期的肝細胞變性會導致肝細胞再生障礙和壞死，進而形成肝纖維化、肝硬化。(2)誘發(fā)或加重高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化。脂肪肝的病情進展研究表明，酒精性脂肪肝患者多合并高血壓、冠心病，容易導致心肌梗死。(3)腦病脂肪肝綜合征。一些發(fā)生脂肪肝的肥胖者常常表現(xiàn)為惡性肥胖，這類病人極易并發(fā)致命性心腦血管疾病。(4)誘發(fā)或加重糖尿病。據(jù)調(diào)查，糖尿病患者中合并脂肪肝的約50%，脂肪肝患者中合并糖尿病的為30% 40%。(5)誘發(fā)肝癌。脂肪肝與原發(fā)性肝癌的發(fā)生雖無直接關(guān)系，但是脂肪肝的病因，如飲酒、營養(yǎng)不良、藥物作用及有毒物質(zhì)損害等，可誘發(fā)肝癌。因此，脂肪肝也可增加肝癌的發(fā)病幾率。脂肪肝屬于肝臟代謝障礙性疾病，故是可逆的，經(jīng)合理治療后完全可以恢復正常。 現(xiàn)除飲食、運動療法外，多使用藥物治療，主要的治療藥物包括(1)保肝類藥物。保肝治療是大多數(shù)脂肪肝患者所不可缺少的治療措施，一經(jīng)確診脂肪肝，在病因治療及飲食療法的同時都應輔以保肝藥物，以利于肝功能的盡快恢復。常用的保肝藥有肝太樂、維生素C、肌苷等。(2)降脂類藥物。脂肪肝患者因脂肪代謝障礙，體內(nèi)甘油三酯及膽固醇均有不同程度升高，且常伴有高脂血癥。故不可避免地需要降脂藥物，如多烯康、絞股蘭總甙、降脂靈、煙酸肌醇酯和蛋氨酸等。也可以服一些祛脂中草藥。(3)其它輔助藥物。脂肪肝患者常伴有維生素缺乏，故還應服用維生素C、維生素B12、葉酸等，維生素C可以促進膽固醇的分解、轉(zhuǎn)化，能加強肝臟去除膽固醇的作用。核黃素、吡哆酸等也有去脂作用。當患者伴有消化道不適癥狀如惡心、食欲不振、腹脹、便秘或稀便時，可以給予對癥治療，口服酵母片等相應的對癥藥物。目前，臨床常用降脂類藥物主要包括(1)他汀類。三甲基戊二酰輔酶A (HMG -CoA)還原酶抑制劑，即膽固醇生物合成酶抑制劑(他汀類藥物)，是細胞內(nèi)膽固醇合成限速酶，即HMG - CoA還原酶的抑制劑，為目前臨床上應用最廣泛的一類調(diào)脂藥物。由于這類藥物的英文名稱均含有“statin”，故常簡稱為他汀類。近年來，他汀類藥物常被被發(fā)現(xiàn)有嚴重的毒副作用。2001年曾發(fā)生轟動一時的“拜斯亭”事件。我國國家藥品監(jiān)督管理局與2001 年8月9日發(fā)出緊急通知，禁止使用西立伐他汀鈉(拜斯亭)。據(jù)悉，他汀類藥上市以來，全世界僅有600萬人用過它；而拜斯亭作為他汀類藥之一，因毒副作用過大導致30多個美國人失去生命。最近一段時期，國外媒體紛紛報道他汀類藥在降脂的同時，也帶來了肝功下降、肌肉疼痛等毒副作用。(2)貝特類。貝特類藥物的主要適應癥為高甘油三酯血癥或以甘油三酯升高為主的混合型高脂血癥。目前臨床應用的貝特類藥物，主要有環(huán)丙貝特、苯扎貝特、非諾貝特及吉非貝齊。據(jù)臨床實踐，這些藥物可有效降低甘油三酯22% 43%，而降低TC僅為6% 15%，且有不同程度升高高密度脂蛋白的作用。該藥的不良反應為胃腸反應、惡心、腹瀉，有報道長期使用可導致肝損害。(3)煙酸類。煙酸類藥物屬B族維生素，當用量超過其作為維生素作用的劑量時，可有明顯的降脂作用。該類藥物的適用范圍較廣，可用于除純合子型家族性高膽固醇血癥，及I型高脂蛋白血癥以外的任何類型高脂血癥。但是，該藥的速釋制劑不良反應大，一般不單獨應用。(4)膽酸螯合劑。這類藥物也稱為膽酸隔置劑。有考來烯胺(Cholestyramine)，常用藥物有降膽寧。該藥常見的不良反應為胃腸反應、惡心、便秘或腹瀉，腸梗阻或頭痛等。(5)膽固醇吸收抑制劑。此類藥物主要通過抑制腸道內(nèi)飲食和膽汁中膽固醇的吸收，來達到降低血脂的目的。目前，該類藥物上市很少。木犀草素(luteolin)是一種天然黃酮類化合物，存在于多種植物中。具有多種藥理活性，如消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等，臨床主要用于止咳、祛痰、消炎、治療心血管疾病、治療“肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥”，SARS，肝炎等。但在治療脂肪肝疾病中，沒有任何研究和報道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種木犀草素的新用途，以實現(xiàn)使其在制備治療脂肪肝藥物中有廣泛的應用。技術(shù)方案為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下 一種木犀草素的新用途，為在制備用于治療脂肪肝藥物中的應用。一種用于治療脂肪肝的藥物，有效成分為木犀草素。木犀草素，化學名3’，4’，5，7-四羥黃酮，別名黃色黃素、黃示靈， CasNo 491-70-3，化學式=C15H10O6,分子量286. 23。物理性狀黃色針狀結(jié)晶，熔點 3^-330°C。微溶于水，具弱酸性，可溶于堿性溶液中，正常條件下穩(wěn)定。木犀草素多以糖苷的形式存在于多種植物中，這些植物以全葉青蘭、辣椒、野菊花、金銀花、紫蘇含量較高，具有鎮(zhèn)咳和祛痰作用。研究表明，木犀草素抑制巨噬細胞磷酸化，抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的活性，能夠抑制脂多糖(LPS)誘導的巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子IL-6、TNF-a。木犀草素還能提高 IFN- γ，降低特異性Ig-E，減少嗜酸性粒細胞的浸潤。另外，木犀草素除了抗炎、抗過敏作用以外，還具有抑制PDE、抗SARS、HIV病毒特性。本發(fā)明，通過動物實驗表明，木犀草素可以降低血液中膽固醇和甘油三酯的增加， 減少肝臟中甘油三酯的合成，從而阻斷了肝臟中脂質(zhì)堆積的來源，在制備用于治療脂肪肝藥物中將有廣泛的用途。有益效果與現(xiàn)有的用于治療脂肪肝藥物相比，本發(fā)明的木犀草素類治療脂肪肝藥物具有的突出優(yōu)點包括通過動物實驗表明，木犀草素可以降低血液中膽固醇和甘油三酯的含量，減少肝臟中甘油三酯的合成，從而阻斷了肝臟中脂質(zhì)堆積的來源，在制備用于治療脂肪肝藥物中將有廣泛的用途；具有很好的實用性，能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟效益和社會效


圖1是小鼠給藥干預8周后的血脂含量圖2是小鼠給藥干預8周后的肝臟中的甘油三酯含量圖； 圖3是各組小鼠的隨機血糖含量圖； 圖4是各組小鼠禁食1 后的糖耐量結(jié)果圖； 圖5是給藥干預8周后各組小鼠肝臟的特征圖6是給藥干預8周后各組小鼠肝臟的超聲影像圖(A)、肝臟中的脂質(zhì)圖(B)、肝臟中糖原圖(C)和脂肪組織圖(D);
圖7是通過western blot方法檢測脂肪酸合成的限速酶的表達結(jié)果圖； 圖8是木犀草素對人肝癌細胞系HepG2和小鼠原代肝細胞的脂質(zhì)合成中的影響結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。實施例1
(1)木犀草素購自中國藥品生物制品檢定所，非酒精性脂肪性肝自發(fā)性動物模型db/db 小鼠購自南京大學模式動物所。(2)實驗組db/db小鼠雄性，6周齡，體重^ 33g/只；分組共18只，隨機分成 3組，每組6只。同窩陰性小鼠(C57BL/KsJ)雄性，6周齡，體重18 22g/只；分組共6只， 作為對照組。(3)給藥處理腹腔注射給藥，20mg/kg/只或100mg/kg/只，每兩天給藥一次，持續(xù)給藥6、周。(4)血樣的采集眼眥取血，置于肝素鈉抗凝的干燥0. 5ml EP管中，3000r/min，離心5min，每只小鼠每次取血清20ul，用于小鼠血脂的檢測。結(jié)果血脂含量如圖1所示，甘油三酯含量如圖2所示。db/db小鼠作為一個自發(fā)肥胖的動物模型，血液中的膽固醇和甘油三酯是顯著性增加的。在db/db小鼠連續(xù)給藥干預后，進行的血脂的常規(guī)檢測中，發(fā)現(xiàn)木犀草素可以減少血液中膽固醇和甘油三酯的增加，同時也阻斷了肝臟中脂質(zhì)堆積的來源。(5)血糖的測定通過尾靜脈微創(chuàng)采血，采用雅培安妥血糖儀進行小鼠血糖的檢測。測量隨機血糖結(jié)果如圖3所示。由于db/db小鼠是自發(fā)高血糖模型，過度攝取含糖量較高的食物也會導致肥胖。通過檢測木犀草素對db/db小鼠血糖的作用實驗，結(jié)果表明木犀草素可以增加葡萄糖的攝取，而這部分攝入體內(nèi)的葡萄糖以糖原的形式貯存在肝臟內(nèi)， 并沒有大量的轉(zhuǎn)化為脂肪，而對照組小鼠結(jié)果相反。(6)腹腔葡萄糖耐量實驗采用經(jīng)腹腔注射2g/kg葡萄糖的方法，分別監(jiān)測注射后 0、15、30、60和120min時的小鼠血糖的變化情況。糖耐量結(jié)果如圖4所示。在持續(xù)給藥過程中，通過小動物B超儀也多次觀測活體內(nèi)脂肪肝的發(fā)展情況，同時在給藥8周時，取出小鼠的肝臟和脂肪進行了切片檢測和肝臟蛋白western檢測。(7)小鼠肝臟的B型超聲成像選用VEV02100小動物超聲儀進行活體脂肪肝的實時診斷與監(jiān)測；
(8)肝臟的油紅0和蘇木素的復合染色先用D-hanks將樣本細胞或者組織切片沖洗充分，然后加入油紅稀釋染色1(Γ15分鐘，接下來用75%的乙醇溶液將樣本分化至間質(zhì)清
5晰，然后蒸餾水沖，最后再用蘇木素對細胞核部分進行復染，并于100倍鏡下觀察拍照。以每組樣本隨機選取5 10視野進行拍照觀察以考察脂質(zhì)積累的效果。(9)肝臟的糖原顏色肝臟標本切片，以過碘酸-Schiff氏法(PAS)行肝糖原染色， 鏡下觀察切片，以每組樣本隨機選取5 10視野進行拍照觀察以考察肝臟中糖原的含量。(10)脂肪組織的蘇木素-伊紅(HE)染色將脂肪組織切片至于60°C烘箱4 ，95% 酒精固定，蘇木素染色15min后，進行鹽酸酒精分化，室溫返藍lOmin，伊紅染色5min，脫水， 封片。(Il)Western bolt 將取出的新鮮肝臟標本，放人液氮中，轉(zhuǎn)至_80°C保存。用組織裂解法提取蛋白后-20°C保存，用考馬斯亮藍法測量蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳采用 39 g/L濃縮膠、100 g/L分離膠，上樣量50 μ g，蛋白Marker 5 μ L，電壓60 V待蛋白跑出濃縮膠后調(diào)至120 V，電泳結(jié)束后取出凝膠，用Quantity One軟件分析光密度值。在持續(xù)給藥過程中，通過小動物B超儀多次觀測活體內(nèi)脂肪肝的發(fā)展情況，同時在給藥8周時，取出小鼠的肝臟和脂肪進行了切片檢測和肝臟蛋白western檢測。給藥干預8周后各組小鼠肝臟的特征圖如圖5所示，給藥干預8周后各組小鼠肝臟各項檢測指標如圖6所示，其中A圖為超聲影像，B圖為肝臟中的脂質(zhì)，C圖為肝臟中糖原，D圖為脂肪組織；通過western blot方法檢測小鼠肝臟中脂肪合成相關(guān)蛋白的表達情況，結(jié)果如圖7所示；各實驗結(jié)果表明木犀草素可以減少db/db小鼠肝臟中的脂肪酸合成相關(guān)基因的表達和脂肪堆積，顯著性的改善自發(fā)性的脂肪肝。實施例2
原代肝細胞的分離與培養(yǎng)將C57BL/KsJ小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉進行麻醉處理，從小鼠的門靜脈插管并且間斷下腔靜脈后，以2ml/min流速灌入Kreb溶液，待肝臟內(nèi)的血液沖洗干凈后，繼續(xù)以anl/min流速灌入膠原酶IV 30ml。待肝臟充分消化后，將組織塊剪碎，加入DMEM完全培養(yǎng)液50ml終止消化并且充分混勻，以200目篩子過濾。以50G/min 離心5min，濃縮肝細胞。為了在細胞水平觀察到較為明顯的脂肪積累，預先采用了肝臟X受體激動劑 T0901317對H印G2細胞和小鼠原代肝細胞進行處理，在處理4 后，進行了蘇木素-油紅染色。實驗結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明，激動劑T1317可以激活肝臟X受體的活性，上調(diào)下游的脂肪酸合成相關(guān)基因，從而使細胞內(nèi)的脂肪酸和甘油三酯的含量增加。但在觀察過程中， 經(jīng)過木犀草素和激動劑T1317共同處理的細胞內(nèi)的脂質(zhì)含量明顯少于T1317處理組。說明了木犀草素可以減少肝臟細胞中的脂質(zhì)合成。與現(xiàn)有的預防與治療脂肪肝的藥物相比，天然化合物木犀草素具有明顯的優(yōu)勢， 藥效明顯、毒副作用小。
權(quán)利要求
1.木犀草素在制備用于治療脂肪肝藥物中的應用。
2.一種用于治療脂肪肝的藥物，其特征在于有效成分為木犀草素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種木犀草素的新用途，該新用途為在制備用于治療脂肪肝藥物中的應用。通過動物實驗表明，木犀草素可以降低血液中膽固醇和甘油三酯的含量，減少肝臟中甘油三酯的合成，從而阻斷了肝臟中脂質(zhì)堆積的來源，在制備用于治療脂肪肝藥物中將有廣泛的用途；具有很好的實用性，能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟效益和社會效應。
文檔編號A61P1/16GK102552238SQ20111043087
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者吳越, 孫玉潔, 朱云霞, 韓曉, 高璐 申請人:南京醫(yī)科大學