專(zhuān)利名稱(chēng)：慢病毒介導(dǎo)的針對(duì)VEGF-C基因siRNA重組體970的構(gòu)建及用途的制作方法
慢病毒介導(dǎo)的針對(duì)VEGF-C基因s i RNA重組體970的構(gòu)建及用途技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種RNAi慢病毒重組表達(dá)載體的構(gòu)建及其腫瘤基因治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入長(zhǎng)的雙鏈 RNA或者細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生一些短片段的雙鏈RNA，這些短片段的雙鏈RNA ( double stand RNA, dsRNA)可以通過(guò)促使特定基因的mRNA降解來(lái)高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)特定基因缺失的表型，siRNA ( small interference RNA)就是這種短片段雙鏈RNA分子，能夠以序列同源互補(bǔ)的mRNA為靶目標(biāo)，降解特定的mRNA，最終使相應(yīng)的基因沉默。由于這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后，故又稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)0
RNAi技術(shù)不僅揭示了細(xì)胞內(nèi)基因沉默的機(jī)制，而且有望成為后基因組時(shí)代基因功能分析的有力工具，是繼酵母雜交系、DNA芯片、基因敲除、反義RNA等技術(shù)之后的又一解讀基因功能的有效研究手段，極大地促進(jìn)了人類(lèi)揭示生命奧秘的進(jìn)程。目前RNAi技術(shù)已經(jīng)廣泛用于基因功能研究和腫瘤基因治療研究領(lǐng)域，其在腫瘤基因治療上與基因替代、 反義寡核苷酸治療、細(xì)胞因子基因治療等傳統(tǒng)基因治療方法相比，具有特異、高效和毒性小的特點(diǎn)，因此可用來(lái)對(duì)一些腫瘤進(jìn)行基因治療。
慢病毒載體(Lentiviral vector)較傳統(tǒng)的質(zhì)粒載體及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細(xì)胞。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達(dá) shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細(xì)胞、干細(xì)胞、受精卵以及分化的后代細(xì)胞中表達(dá)shRNA，實(shí)現(xiàn)在多種類(lèi)型的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)的功能性沉默，為在原代的人和動(dòng)物細(xì)胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達(dá)降低的動(dòng)物提供了可能性。慢病毒作為siRNA的攜帶者，不但具備特異性地使基因表達(dá)沉默的能力，而且充分發(fā)揮了慢病毒載體自身所具備的優(yōu)勢(shì)，如①該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。該載體介導(dǎo)的基因改造后的腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的克隆，并且可以彌散分布于腫瘤實(shí)體；②不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)；③在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類(lèi)型的細(xì)胞，對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，為RNAi、cDNA克隆以及報(bào)告基因的研究提供了一個(gè)有利的途徑，也為基因功能的研究和腫瘤的基因治療研究提供了更強(qiáng)有力的工具。
腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是決定人類(lèi)癌癥惡性表型的關(guān)鍵因素，也是導(dǎo)致死亡的主要原因。腫瘤細(xì)胞通常是通過(guò)表達(dá)某一生長(zhǎng)因子及其特異受體而組成其自身的自分泌信號(hào)通路來(lái)獲得侵襲和遷移能力。有研究顯示許多生長(zhǎng)因子及其受體參與腫瘤的侵犯和轉(zhuǎn)移過(guò)程， 其中就包括VEGF-C/VEGFR-3淋巴管生長(zhǎng)信號(hào)軸，如何中斷這些生長(zhǎng)因子及其受體組成的信號(hào)通路，目前已經(jīng)成為研發(fā)抗癌新藥物的主要策略之一。近年來(lái)，腫瘤的淋巴管生成備受學(xué)者關(guān)注，多種與淋巴管生成的因子被發(fā)現(xiàn)，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGF-C)被認(rèn)為是目前發(fā)現(xiàn)的特異性淋巴管生成因子。VEGF-C可以激活其受體VEGFR-2和VEGFR-3而誘導(dǎo)腫瘤血管、淋巴管生成和促進(jìn)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移，是一種重要的血管、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，與腫瘤的淋巴管生成、淋巴道擴(kuò)散及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。許多研究顯示，VEGF-C在胃癌、 前列腺癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生成正相關(guān)，是理想的腫瘤基因治療靶點(diǎn)。
基于上述研究，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)VEGF-C基因的寡核苷酸序列，應(yīng)用慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建siRNA表達(dá)體系并轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，經(jīng)real time RT-PCR、western blot 檢測(cè)VEGF-C mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，研究其干擾VEGF-C基因表達(dá)的效應(yīng)，為進(jìn)一步研究VEGF-C功能及其作為抗腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)可行性等研究奠定基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供針對(duì)VEGF-C基因RNAi慢病毒重組表達(dá)載體 pSIHl-Hl-copGFP-VEGF-CsiRNA970的構(gòu)建及制備方法，為腫瘤基因治療提供新策略。本發(fā)明的另一目的是提供新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是，慢病毒介導(dǎo)的針對(duì)VEGF-C基因siRNA重組體970，其堿基序列為5’ CCTCAGCAAGACGTTATTT3，。
慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA970的制備方法，它是構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的重組體pSIHl-Hl-copGFP-VEGF-CsiRNA970，應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的該重組體感染腫瘤細(xì)胞后，該重組體可以將VEGF-CsiRNA970整合到腫瘤細(xì)胞及宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)，有效地阻斷腫瘤組織表達(dá)VEGF-C。
本發(fā)明的技術(shù)效果在于，該重組體能夠顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中VEGF-C基因的表達(dá)。包括肺癌在內(nèi)的實(shí)體腫瘤，血管和淋巴管的新生程度是其轉(zhuǎn)移潛能大小的直接影響因素。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族及其受體(VEGFRs)是腫瘤發(fā)展過(guò)程中，參與血管和淋巴管生成的主要因子，已經(jīng)成為以病理性血管和淋巴管生成信號(hào)通路為標(biāo)靶的腫瘤靶向治療的首選靶點(diǎn)！該家族成員VEGF-C作為腫瘤生物治療的靶點(diǎn)，可能優(yōu)于已公認(rèn)而且已經(jīng)應(yīng)用于臨床的生物治療靶點(diǎn)VEGF-A。本發(fā)明提供的重組體可干預(yù)腫瘤細(xì)胞VEGF-C的表達(dá)，可用于制備新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物。
本發(fā)明選定VEGF-C基因作為腫瘤治療靶點(diǎn)，根據(jù)VEGF-C (NM_005429)基因信息，使用不同(主要參考的軟件有dnvitrogen BLOCK-iT RNAi Designer、ambion公司的 siRNA Target Finder 以及 GeMcript 公司的 siRNA Target Finder 等。實(shí)際上，我們根據(jù)多個(gè)軟件算法綜合考慮選擇一條siRNA序列)的在線(xiàn)siRNA序列設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了針對(duì)VEGF-C編碼區(qū)(CDS區(qū))，起始位置為970的siRNA序列VEGF-C siRNA9 70 (序列為 5’ CCTCAGCAAGACGTTATTT3’)。根據(jù)siRNA序列，設(shè)計(jì)兩條互補(bǔ)的DNA模板單鏈，模板鏈包括siRNA的正義鏈和反義鏈，中間以12個(gè)脫氧核苷酸的Loop結(jié)構(gòu)(5’ - CTTCCTGTCAGA -3’)相連，后面接有RNA PolyIII聚合酶轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)(TTTTT)，同時(shí)模板鏈兩端分別添加 BamHI和EcoR I酶切位點(diǎn)，合成相應(yīng)的DNA單鏈(PAGE級(jí)別)。單鏈經(jīng)退火后克隆入慢病毒表達(dá)載體(pSIHl-Hl-copGFP shRNA Vector)，并應(yīng)用酶切鑒定和DNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行篩選鑒定重組質(zhì)粒。


圖 1 慢病毒重組體 pSIHl-Hl-copGFP-VEGF-CsiRNA 結(jié)構(gòu)2慢病毒重組體pSIHl-Hl-copGFP-VEGF-CsiRNA測(cè)序結(jié)果圖3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的熒光表達(dá)檢測(cè)圖4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞VEGF-C基因mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)定量RT-PCR擴(kuò)增曲線(xiàn)圖 5 Western blot 檢測(cè)圖。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，以下實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例一干擾序列的設(shè)計(jì)根據(jù)人VEGF-C (NM_005429)基因信息，使用不同的在線(xiàn)siRNA序列設(shè)計(jì)軟件， 設(shè)計(jì)siRNA970(序列為:5，CCTCAGCAAGACGTTATTT3 ’ )；再設(shè)計(jì)一組無(wú)關(guān)序列(序列為 5，CGTTTAACTCTCCCAACCA 3，)作為陰性對(duì)照。
實(shí)施例二 重組慢病毒表達(dá)體的構(gòu)建根據(jù)siRNA970序列，設(shè)計(jì)兩條互補(bǔ)的DNA模板單鏈，模板鏈包括siRNA的正義鏈和反義鏈，中間以12個(gè)脫氧核苷酸的Loop結(jié)構(gòu)(5’ - CTTCCTGTCAGA -3’ )相連，后面接有RNA PolyIII聚合酶轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)(TTTTT)，同時(shí)模板鏈兩端分別添加BamHI和EcoR I酶切位點(diǎn)，合成相應(yīng)的DNA單鏈(PAGE級(jí)別)。
GATCCCCTCAGCAAGACGTTATTTCTTCCTGTCAGAAAATAACGTCTTGCTGAGGTTTTTG3~ 5、AATTCAAAAACCTCAGCAAGACGTTATTTTCTGACAGGAAGAAATAACGTCTTGCTGAGGG3、相應(yīng)的DNA單鏈送上海hvitrogen公司人工合成后，將兩條鏈退火形成雙鏈。用BamH I內(nèi)切酶與EcoR I內(nèi)切酶雙酶切表達(dá)載體pSIHl-Hl-copGFP shRNA Vector (表達(dá)載體圖譜如圖1)，然后將雙鏈DNA連接至經(jīng)過(guò)線(xiàn)性化處理的載體pSIHl-Hl-copGFP shRNA Vector, 轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞，使用載體多克隆位點(diǎn)兩端的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性菌落，陽(yáng)性重組克隆進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定(測(cè)序圖譜如圖2)。
實(shí)施例三慢病毒顆粒的包裝和生產(chǎn)本實(shí)驗(yàn)米用 Lentivirus Package systerm (System Biosciences,Cat. # LV500A-1) 進(jìn)行慢病毒顆粒的包裝和生產(chǎn)，病毒生產(chǎn)細(xì)胞系為Producer Cell Line (System Biosciences, Cat. # LV900A-1)。使用慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锖蛃iRNA970對(duì)應(yīng)的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞，病毒包裝過(guò)程中共轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞48小時(shí)后拍片觀(guān)察，視野內(nèi)有較強(qiáng)的綠色熒光，即證明慢病毒顆粒包裝成功。
使用梯度稀釋法進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，病毒原液進(jìn)行10次稀釋后，熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少。即在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)以及有熒光表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目，將得到的數(shù)值除以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)就得到了病毒原液的滴度值。
病毒滴度的計(jì)算ifu/ml (感染單位/ml)——具有感染能力的假病毒顆粒的相對(duì)濃度；MOI (感染復(fù)數(shù))——在所有被感染的宿主細(xì)胞中，平均每個(gè)細(xì)胞感染病毒的病毒顆粒數(shù)或基因組數(shù)。即取了體積為ν(μ )的病毒原液進(jìn)行十倍稀釋?zhuān)诩尤肓说贏次十倍稀釋后(即稀釋倍數(shù)為IOa)的病毒稀釋液的空中看到了 B個(gè)帶有熒光的細(xì)胞，則病毒的滴度計(jì)算公式為病毒滴度=(B/V)*10A。
本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的病毒滴度為(126. 33/10) X IO3=L 26*104ifu/ μ L·使用 dPBS (pH7. 8，實(shí)驗(yàn)室配制)將病毒顆粒濃度調(diào)整至1 X 104ifu/ μ 1，按Iml每管濃度調(diào)整后的病毒液進(jìn)行分裝，_70°C保存待用。
實(shí)施例四慢病毒感染A549細(xì)胞，建立VEGF-C RNAi穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株使用標(biāo)準(zhǔn)copGFP標(biāo)記的病毒液(1 X IO4Ifu/μ 1)感染Α549細(xì)胞(分別加入10，20，30， 40，50和100 μ 1病毒液)，熒光倒置顯微鏡下觀(guān)察，綠色熒光表達(dá)比較穩(wěn)定，使用胰酶消化的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得能夠使Α549細(xì)胞達(dá)到100%的最少病毒用量為 6ul，那么慢病毒感染 A549 細(xì)胞的最佳 MOI 值為:M0I=40ul X 104ifu/ μ 1 + [ (125+116+146) + 3Χ104Χ0· 05] ^ 6。
在最佳MOI值條件下進(jìn)行Α549細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)，感染后96小時(shí)，鏡下觀(guān)察，細(xì)胞狀況較好，貼壁密度達(dá)到80%以上。使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)后制備細(xì)胞懸液，放大培養(yǎng)細(xì)胞克隆，挑取最穩(wěn)定的克隆，進(jìn)行傳代培養(yǎng)(建立的VEGF-C RNAi穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞如圖3所示)，提取 total RNA 和總蛋白，進(jìn)行 Real-Time RT-PCR 和 western blot 檢測(cè)。
實(shí)施例五實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)重組體對(duì)VEGF-C基因mRNA水平的影響取A549細(xì)胞、VEGF-C RNAi穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株和VEGF-C RNAi陰性穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，以 Trizol法提取總RNA，并對(duì)提取的RNA樣品進(jìn)行電泳確認(rèn)和OD值測(cè)定。采用STOR Green I熒光染料嵌合法，real time RT-PCR反應(yīng)確認(rèn)引物反應(yīng)性。以樣本Total RNA為模板， 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA溶液，使用2 Step Real Time PCR方法，擴(kuò)增β-actin及 VEGF-C目的基因(擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖4所示)，檢測(cè)其表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢病毒重組表達(dá)載體pSIHl-Hl-copGFP- VEGF-CsiRNA可以顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞VEGF-C基因mRNA表達(dá)，抑制效率為67. 77%。
實(shí)施例六Western blot檢測(cè)重組體對(duì)VEGF-C基因蛋白表達(dá)的抑制取A549細(xì)胞、VEGF-C RNAi穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株和VEGF-C RNAi陰性穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株， 用蛋白提取液分別處理各組細(xì)胞，收集總蛋白，蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，應(yīng)用VEGF-C抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光劑檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參照(檢測(cè)結(jié)果如圖5所示)。使用掃描儀掃描圖像，條帶的灰度分析采用TotalLab軟件處理，以目的基因產(chǎn)物灰度值與GAPDH產(chǎn)物灰度值之比作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢病毒重組表達(dá)載體 pSIHl-Hl-copGFP-VEGF-CsiRNA可以顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞VEGF-C蛋白表達(dá)，抑制效率為 60. 88%ο
在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，新生血管和淋巴管的形成是關(guān)鍵步驟。在實(shí)體腫瘤體積大于1 2mm3時(shí)，補(bǔ)充新生血管和淋巴管以清除代謝廢物和提供充足的氧和養(yǎng)分，對(duì)處于發(fā)生和發(fā)展階段的腫瘤來(lái)說(shuō)，是使其具有無(wú)可控制的增殖能力所必需的關(guān)鍵步驟和過(guò)程。同時(shí)，新生的血管和淋巴管也為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供了新的轉(zhuǎn)移路徑。目前認(rèn)為，實(shí)體腫瘤血管和淋巴管的新生程度是實(shí)體腫瘤轉(zhuǎn)移潛能大小的直接影響因素。
在新血管和新淋巴管形成前，由于處于發(fā)展?fàn)顟B(tài)的實(shí)體腫瘤通常處于氧氣缺乏或氧含量低的狀態(tài)，所以會(huì)隨即促發(fā)了一系列血管生成因子和生長(zhǎng)因子的釋放，進(jìn)而促使局部基底膜的降解、內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤(rùn)、遷移和增殖，最終導(dǎo)致微血管和微淋巴管的形成，如何應(yīng)用新的治療方法控制和阻斷這一復(fù)雜的血管、淋巴管生成路徑，以期達(dá)到阻斷腫瘤細(xì)胞的氧和養(yǎng)分供應(yīng)的目的，進(jìn)而“餓死”腫瘤細(xì)胞，成為研究者努力地焦點(diǎn)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)家族及其受體(VEGFRs)是腫瘤發(fā)展過(guò)程中，參與血管和淋巴管生成的主要因子，已經(jīng)成為以病理性血管和淋巴管生成信號(hào)通路為標(biāo)靶的腫瘤靶向治療的首選靶點(diǎn)！VEGF家族中VEGF-C可以與表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞或成骨細(xì)胞等非內(nèi)皮細(xì)胞，以及多數(shù)腫瘤細(xì)胞的酪氨酸激酶受體VEGFR-3結(jié)合，也具有相對(duì)較弱的與VEGFR-2結(jié)合的能力，而 VEGFR-2則被認(rèn)為是細(xì)胞表面調(diào)控血管生成的酪氨酸激酶受體，還可以與表達(dá)于靜脈和淋巴管的復(fù)合受體如neuropilin-2結(jié)合，因此，普遍認(rèn)為VEGF-C的主要生理功能是誘導(dǎo)淋巴管生成。
最初，人們只是認(rèn)為VEGF-C在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，可以誘導(dǎo)腫瘤組織和局部淋巴結(jié)的淋巴管生成而促使腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴管道轉(zhuǎn)移，然而，越來(lái)越多的研究顯示，VEGF-C參與和影響許多腫瘤的惡性表型，其中包括非小細(xì)胞肺癌、直腸和乳腺癌等多發(fā)腫瘤。然而，近期的研究顯示，VEGF-C/VEGFRs信號(hào)軸可以通過(guò)自分泌途徑調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移，進(jìn)而誘使腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。U) VEGF-C通過(guò)自分泌途徑調(diào)控VEGFR-3/VEGFR-2的表達(dá)，誘使腫瘤血管和淋巴管生成VEGF-C通過(guò)自分泌途徑調(diào)控CXCR4、CCR7等細(xì)胞因子受體的表達(dá)，誘使腫瘤細(xì)胞的定向遷移；(3) VEGF-C可通過(guò)VEGFRs通路直接作用于腫瘤細(xì)胞，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移；(4) VEGF-C可以直接作用于腫瘤細(xì)胞，影響腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，進(jìn)而影響腫瘤增殖。(5) VEGF-C可以調(diào)控VEGF家族中的其他因子如VEGF_A(目前認(rèn)為VEGF-A是最主要的血管生成促進(jìn)因子，因而抑制VEGF-A表達(dá)的抑制劑目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床，但效果并不理想)的表達(dá)，因而研究者認(rèn)為，目前臨床應(yīng)用的抑制腫瘤血管生成的VEGF-A生物制劑療效不顯著的原因，可能是由于VEGF-C未受干預(yù)所造成的。因而，我們認(rèn)為VEGF-C作為腫瘤生物治療的靶點(diǎn)，可能優(yōu)于已公認(rèn)而且已經(jīng)應(yīng)用于臨床的生物治療靶點(diǎn)VEGF-A。本發(fā)明提供的重組體可干預(yù)VEGF-C的表達(dá)，有望為VEGF-C生物制劑的研制提供可靠依據(jù)。
權(quán)利要求
1.慢病毒介導(dǎo)的針對(duì)VEGF-C基因SiRNA重組體970，其特征在于，其堿基序列為 CCTCAGCAAGACGTTATTT3~。
2.慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA970的制備方法，其特征在于，它是構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的重組體pSIHl-Hl-copGFP-VEGF-CsiRNA970，應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的該重組體感染腫瘤細(xì)胞后，該重組體可以將VEGF-CsiRNA970整合到腫瘤細(xì)胞及宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)，有效地阻斷腫瘤組織表達(dá)VEGF-C。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA970的制備方法，其特征在于，所述慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的重組體pSIHl-Hl-cOpGFP-VEGF-CsiRNA970，構(gòu)建所用慢病毒表達(dá)載體和DNA片段包括含RNA PolyIII聚合酶與Hl啟動(dòng)子的載體pSIHl-Hl_copGFP shRNA Vector和編碼特異地抑制VEGF-C基因表達(dá)的siRNA970的DNA片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA970的制備方法，其特征在于，所述的編碼特異地抑制VEGF-C基因表達(dá)的siRNA970的DNA片段，其堿基序列為·5.GATCCCCTCAGCAAGACGTTATTTCTTCCTGTCAGAAAATAACGTCTTGCTGAGGTTTTTG3、·5、AATTCAAAAACCTCAGCAAGACGTTATTTTCTGACAGGAAGAAATAACGTCTTGCTGAGGG3、。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種針對(duì)VEGF-C基因的RNAi慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)的重組體pSIH1-H1-copGFP-VEGF-CsiRNA970的構(gòu)建及其抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞VEGF-C基因表達(dá)的作用。利用RNAi技術(shù)原理，設(shè)計(jì)出以VEGF-C為靶基因的siRNA970，設(shè)計(jì)合成了能轉(zhuǎn)錄出shRNA的模板DNA，并將其克隆到慢病毒表達(dá)載體pSIH1-H1-copGFPshRNAVector，并用酶切鑒定和DNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行篩選，成功構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的針對(duì)VEGF-C基因siRNA重組體pSIH1-H1-copGFP-VEGF-CsiRNA970。該重組體能夠顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中VEGF-C基因的表達(dá)，可用于制備新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102533763SQ20111044003
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者馮克儉, 馮玉寬, 劉貴波, 張雅芳, 曹艷麗, 潘艷明, 胡靜 申請(qǐng)人:馮玉寬