專利名稱：一種多ShRNA高效協(xié)同沉默基因方法及載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種多SiRNA高效協(xié)同沉默基因方法及載 體。
背景技術(shù)：
基因打靶是揭示基因功能分析和病理機制的強有力的工具，然而通過同源重組的 基因打靶正確交換的頻率比DNA的隨機整合效率低1000倍以上，因此在很多情況下甚至需 要篩選成千上萬個克隆才能鑒定出一個發(fā)生正確交換的重組子。盡管近年來，發(fā)展出了很 多改良的基因打靶方法，包括正負標志物的選擇、啟動子捕獲、病毒轉(zhuǎn)運，但這些方法不總 能高效地獲得重組子最近也有人發(fā)現(xiàn)用小鼠的精原干細胞來替代胚胎干細胞來做基因打 靶，通過同源重組獲得敲除occludin基因重組子能達到1. 7%。另外，設(shè)計特異性識別某一 特定基因的鋅指核酸酶(ZFN)采用體外特異有時能達到25-50%以上的頻率，但這些改良的 方法是否設(shè)用于其他基因、其他細胞以及其他種屬還有待于進一步證實。通過S1RNA的方法來實現(xiàn)基因沉默是另一個選擇，然而常規(guī)的SiRNA的基因沉默 效率與傳統(tǒng)的基因敲除相比效率往往不高。因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種多SiRNA高效協(xié)同沉默基 因方法及載體，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種用于多SiRNA介導(dǎo)協(xié)同基因沉默的SiRNA載體，其特征在于，ShRNA載體上裝載有 一段含有多個^iRNA沉默盒的DNA序列；所述S1RNA沉默盒是從多種不同的SiRNA中選擇。所述的SiRNA載體，其中，所述S1RNA載體上裝載有一段含有三個不同的S1RNA沉 默盒的DNA序列。所述的S1RNA載體，其中，每個SiRNA沉默盒上游設(shè)置有一個慶大霉素應(yīng)答的啟 動子元件Pdke ；所述慶大霉素應(yīng)答的啟動子元件Pdke包括一啟動子序列、一慶大霉素應(yīng)答元 件；所述啟動子序列與慶大霉素應(yīng)答元件、ShRNA沉默盒依次相連。所述的S1RNA載體，其中，所述啟動子元件還包括一間隔序列，設(shè)置在一慶大霉素 應(yīng)答元件與SiRNA沉默盒之間。所述的S1RNA載體，其中，所述三個不同的SiRNA沉默盒的慶大霉素應(yīng)答的啟動子 元件Pdre序列如SEQ ID NO. 1-3所示。所述的S1RNA載體，其中，所述裝載有SiRNA沉默盒的DNA序列上游還設(shè)置有一受 四環(huán)素控制的沉默子tTS、一強啟動子，所述強啟動子用于組成型表達沉默子tTS，設(shè)置在 沉默子tTS的上游。所述的SiRNA載體，其中，所述強啟動子為CMV啟動子。
所述的S1RNA載體，其中，所述強啟動子為CAG啟動子或UBC啟動子。所述的SiRNA載體，其中，所述CMV啟動子的上游和受四環(huán)素控制的沉默子tTS的 下游還分別設(shè)置有多聚PolyA ；所述多聚PolyA分別用TKpA和bglobpA，TKpA設(shè)置在CMV 強啟動子的上游，bglobpA設(shè)置在受四環(huán)素控制的沉默子tTS與第一個SiRNA沉默盒的啟 動子元件之間。所述的SiRNA載體，其中，所述S1RNA載體為質(zhì)粒載體，還含有E. coli的復(fù)制子和 ColEl和氨芐抗性基因Amplrtj所述的SiRNA載體，其中，還含有G418抗性基因和強啟動子SV40 ；強啟動子SV40 設(shè)置在G418抗性基因的上游，控制G418抗性基因的表達。所述的S1RNA載體，其中，所述SiRNA載體適用于人類細胞或組織、各種哺乳類動 物細胞或組織以及轉(zhuǎn)基因動物。一種使用上述的SiRNA載體高效協(xié)同基因沉默的方法，其中，根據(jù)需要沉默的靶 基因設(shè)計多個不同的aiRNA，從中選擇不同的aiRNA，構(gòu)建一個裝載有一段含有多個SiRNA 沉默盒的DNA序列的S1RNA載體，將所述S1RNA載體轉(zhuǎn)染到受體細胞后，多個SiRNA協(xié)同沉
默靶基因。有益效果本發(fā)明提供了一項可誘導(dǎo)性的多SiRNA協(xié)同干擾基因表達的SiRNA載 體，SiRNA經(jīng)藥物誘導(dǎo)表達后，在靶基因的表達量降至檢查不到水平，而且本發(fā)明還具有廣 泛的適用性，可取代傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)來實現(xiàn)基因打靶。


圖1為本發(fā)明實施例1中多個SiRNA高效協(xié)同基因沉默的質(zhì)粒pPolyShRNA的調(diào) 控元件排列。圖2為本發(fā)明實施例3中HEK293轉(zhuǎn)基因細胞株中沉默hSIRTl基因的構(gòu)建體的結(jié) 構(gòu)示意圖。圖3為本發(fā)明實施例3中加與不加慶大霉素(Dox)處理后，HEK293細胞或其轉(zhuǎn) 基因細胞株(HEK-hSIRTl-ShRNA123, HEK-hSIRTl-ShRNAl, HEK-hSIRTl-ShRNA2, HEK-hSIRT l-ShRNA3)中 hSIRTl mRNA 水平(平均值 士 SEM)。圖4為本發(fā)明實施例3中加與不加慶大霉素(Dox)處理后HEK293細胞或其轉(zhuǎn)基 因細胞株(HEK-hSIRTl-ShRNA123, HEK-hS I RTl-ShRNAl, HEK-hSIRTl_ShRNA2, HEK-hS I RTl -ShRNA3)中檢測hSIRTl蛋白水平的免疫印跡試驗結(jié)果圖。圖5為本發(fā)明實施例3中HEK293轉(zhuǎn)基因細胞株中沉默hSIRTl基因的構(gòu)建體的結(jié) 構(gòu)示意圖。圖6為本發(fā)明實施例3中加與不加慶大霉素(Dox)處理后，HEK293細胞或其轉(zhuǎn) 基因細胞株(HEK-hSIRTl-3ShRNAl, HEK-hSIRTl_3ShRNA2, HEK_hSIRTl_ShRNA3)中 hSIRTl mRNA水平(平均值士 SEM)。圖7為本發(fā)明實施例3中加與不加慶大霉素(Dox)處理后HEK293細胞或其轉(zhuǎn)基 因細胞株(HEK-hSIRTl-3ShRNAl, HEK-hSIRTl_3ShRNA2, HEK_hSIRTl_3ShRNA3)中檢測 hSIRTl蛋白水平的免疫印跡試驗結(jié)果圖。圖8本發(fā)明實施例5中加與不加慶大霉素(Dox)處理后，hESC細胞或其轉(zhuǎn)基因細胞株(hESC-Sl, hESC-S2, hESC_S3)中 hSIRTl mRNA 水平(平均值士SEM)。圖9本發(fā)明實施例5中加與不加慶大霉素(Dox)處理后hESC細胞或其轉(zhuǎn)基因細 胞株(hESC-Sl，hESC-S2, hESC-S3)中檢測hSIRTl蛋白水平的免疫印跡試驗結(jié)果圖。圖10本發(fā)明實施例5中加與不加慶大霉素(Dox)處理后HESC細胞或其轉(zhuǎn)基因細 胞株(hESC-Sl，hESC-S2, hESC-S3)中檢測hSIRTl蛋白分布的免疫熒光試驗結(jié)果圖。圖11本發(fā)明實施例7中mESC細胞轉(zhuǎn)基因細胞株中沉默mSirtl基因的構(gòu)建體的 結(jié)構(gòu)示意圖。圖12本發(fā)明實施例7中加與不加慶大霉素(Dox)處理后，mESC細胞或其轉(zhuǎn)基因 細胞株(mESC-Sl，mESC-S2, mESC_S3)中 hSIRTl mRNA 水平(平均值士SEM)。圖13本發(fā)明實施例7中加與不加慶大霉素(Dox)處理后mESC細胞或其轉(zhuǎn)基因細 胞株(mESC-Sl，mESC-S2，mESC_S3)中檢測mSirtl蛋白水平的免疫印跡試驗結(jié)果圖。圖14本發(fā)明實施例7中mESC細胞或其轉(zhuǎn)基因細胞株(mESC-Sl，mESC_S2， mESC-S3)中檢測mSirtl蛋白分布的免疫熒光試驗結(jié)果圖15本發(fā)明實施例9中人胚胎細胞分化而來的感光細胞轉(zhuǎn)基因細胞株中沉默hRHO基 因的構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖16本發(fā)明實施例8中人胚胎干細胞向感光細胞分化的流程示意圖。圖17本發(fā)明實施例9中加與不加慶大霉素(Dox)處理后，由人胚胎細胞分化而來 的感光細胞(hESC-RC)或其轉(zhuǎn)基因細胞株(hESC-RCl, hESC-RC2, hESC_RC3)中 hRHO mRNA 水平(平均值士 SEM)。圖18本發(fā)明實施例9中加與不加慶大霉素(Dox)處理后，由人胚胎細胞分化而 來的感光細胞(hESC-RC)或其轉(zhuǎn)基因細胞株(hESC-RCl，hESC-RC2，hESC_RC3)中檢測hRHO 蛋白水平的免疫印跡試驗結(jié)果圖。圖19本發(fā)明實施例9中加與不加慶大霉素(Dox)處理后，由人胚胎細胞分化而 來的感光細胞(hESC-RC)或其轉(zhuǎn)基因細胞株(hESC-RCl，hESC-RC2，hESC_RC3)中檢測hRHO 蛋白分布的免疫染色試驗結(jié)果圖。圖20本發(fā)明實施例11中小鼠胚胎細胞分化而來的感光細胞轉(zhuǎn)基因細胞株沉默 hRHO基因的構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖21本發(fā)明實施例10中小鼠胚胎干細胞向感光細胞分化的流程示意圖22本發(fā)明實施例11中加與不加慶大霉素(Dox)處理后，由小鼠胚胎細胞分化而來 的感光細胞(mESC-RC)或其轉(zhuǎn)基因細胞株(mESC-RCl, mESC-RC2, mESC_RC3)中 mRho mRNA 水平(平均值士 SEM)。圖23本發(fā)明實施例11中加與不加慶大霉素(Dox)處理后，由小鼠胚胎細胞分 化而來的感光細胞(mESC-RC)或其轉(zhuǎn)基因細胞株(mESC-RCl, mESC-RC2, mESC-RC3)中檢測 hRHO蛋白水平的免疫印跡試驗結(jié)果圖。圖M本發(fā)明實施例11中加與不加慶大霉素(Dox)處理后，由小鼠胚胎細胞分 化而來的感光細胞(mESC-RC)或其轉(zhuǎn)基因細胞株(mESC-RCl, mESC-RC2, mESC-RC3)中檢測 hRHO蛋白分布的免疫染色試驗結(jié)果圖。圖25本發(fā)明實施例13中轉(zhuǎn)基因動物視網(wǎng)膜特異蛋白的免疫印跡檢測試驗結(jié)果 圖，樣品為慶大霉素(dox)處理2周后的視網(wǎng)膜蛋白抽提物。
5
圖沈本發(fā)明實施例13中免疫熒光法檢測rhodopsin的分布圖，樣品為慶大霉素 (dox)處理2周后的視網(wǎng)膜冰凍切片。圖27本發(fā)明實施例13中慶大霉素(Dox)處理2周(2w)、一個月(Im)、2個月(2m) 后的視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)分析(HE染色)。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種多SiRNA高效協(xié)同沉默基因方法及載體，為使本發(fā)明的目的、技 術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對本發(fā)明進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具 體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明用裝載有三個或多個SiRNA沉默盒的DNA序列(如=PDREl-XhoI-C istronl-AgeI-PDRE2-SalI-Cistron2-MluI-PDRE3-PstI-Cistron3-HindIII)替換 pSingle-MCS-ShRNA 載體(Clontech)中的！"et-TO-MCS 區(qū)段，獲得的構(gòu)建體 pPolyShRNA 在 慶大霉素存在的情況下可以同時啟動多個SiRNA的協(xié)同表達。慶大霉素應(yīng)答啟動子元件 (PDKE1，PME2，Pdke3)以及用于構(gòu)建載體的各種寡聚多核苷酸見SEQ ID NO. 1-44。慶大霉素應(yīng) 答啟動子元件(PDRE1，PDRE2，PDRE3)中依次包括了啟動子序列、慶大霉素應(yīng)答元件DRE和 間隔序列，序列如SEQ ID N0. 1-3所示。SEQ ID N0. 4_44為實施例中各種用于沉默靶基因 所設(shè)計的SiRNA序列。^if ^j^^7n#(Tetracycline-responsible elements, TREs) jf tr|5 WJ^ 大霉素應(yīng)答元件(Doxycycline-responsive elements, DREs)廣泛用于基因表達可控性 的誘導(dǎo)系統(tǒng)的構(gòu)建。受四環(huán)素控制的沉默子(Tetracycline-controlled silencer, tTS) 是一個融合了轉(zhuǎn)錄阻遏因子kid-1的KRAB-AB結(jié)構(gòu)域的蛋白，在慶大霉素不存在的情況 下tTS能緊密結(jié)合RNA多聚酶的結(jié)合位點，抑制基因的表達，因此本底的表達很低。從慶 大霉素(Doxycyline，Dox)存在的情況下，在tTS從RNA多聚酶的結(jié)合位點上解離下來， 啟動下游基因的表達。本發(fā)明利用這些調(diào)控元件，構(gòu)建了一個多SiRNA高效協(xié)同沉默基 因表達的質(zhì)粒 pPolyShRNAZhu, Z. et al. , Use of the tetracycline-controlled transcriptional silencer (tTS) to eliminate transgene leak in inducible overexpression transgenic mice. J Biol Chem 276 (27), 25222 (2001) 在本發(fā)明 中用CMV強啟動子組成型表達tTS，為克服單個SiRNA可能效率低下的問題，將多個SiRNA 的誘導(dǎo)沉默盒串聯(lián)在一個載體上，每個SiRNA誘導(dǎo)沉默盒均由自己的慶大霉素應(yīng)答元件 (Doxycycline-responsive element, DRE)控制。為排除每個啟動子相互干擾影響RNA多 聚酶的結(jié)合，DRE與DRE之間插入了 100-200 nt的間隔子(spacer)。在這個表達系統(tǒng)中， 慶大霉素的添加能同時啟動多個SiRNA的表達。本發(fā)明實施例中使用慶大霉素誘導(dǎo)系統(tǒng)用于本發(fā)明的SiRNA的表達，其他類似的 誘導(dǎo)系統(tǒng)也能用于本發(fā)明的SiRNA的表達，不僅可以是慶大霉素應(yīng)答元件，也可以是其他 應(yīng)答元件。本發(fā)明實施例中使用的SiRNA含有69個左右的核苷酸，所用的SiRNA種子序列長 度為21個nt，所用的linker序列是TTCAAGAGA。常用的SiRNA種子序列長度有19個、21 個、23個、四個壯，SiRNA會根據(jù)種子的不同，linker的不同其序列的長度也會不同，但是 其他序列長度的SiRNA也能用于高效協(xié)同沉默靶基因。
本發(fā)明實施例中的SiRNA載體上用于表達SiRNA的強啟動子為CMV啟動子，用于 表達S1RNA的強啟動子還可以為CAG，UBC等，或其修飾的啟動子。本發(fā)明S1RNA載體的構(gòu)建操作按標準的克隆方法進行。質(zhì)粒的制備采用QIApr印 Spin Minipr印試劑盒(Qiagen)。HEK293細胞、人胚胎干細胞(H9系)、小鼠胚胎干細胞 (mESC) (129/SV系)用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達細胞株。培養(yǎng)人胚胎干細胞、小鼠胚胎 干細胞、DNA轉(zhuǎn)染以及逐步分化試驗是參考發(fā)表的文獻進行Thomson，J. A. et al., Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282 (5391)， 1145 (1998) ；Wuj H. et al. , Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines. Proc Natl Acad Sci USA 104 (34)，13821 (2007) ；Wernigj Μ. et al.，In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES一cell一like state. Nature 448 (7151)，318 (2007) ；Zwakaj Τ. P. and Thomson, J. A. , Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechno 1 21 (3)， 319 (2003) ；Watanabej K. et al.， Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci 8 (3)，288 (2005) ；Ikedaj H. et al.，Generation of Rx+/Pax6+ neural retinal precursors from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 102 (32)，11331 O005)。在構(gòu)建人胚胎干細胞的轉(zhuǎn)基因系時，需將細胞先用胰蛋白酶消 化成單細胞，在此過程中為提高增加細胞的成活率，在用胰蛋白酶消化前用ROCK抑制物處 理 1 小時Watanabe, K. et al. , A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 25 (6)，681 U007)。按文獻所述提取 總RNA的分離并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用qRT-PCR對mRNA的豐度(mRNA aboundance)進行定量Gazin, C. et al. , An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature 449 (7165)，1073 (2007)，用免疫印跡和免疫熒光測定蛋白水平和 其在細胞內(nèi)的分布。冰凍的組織切片用4%福爾馬林于室溫固定10分鐘。為對轉(zhuǎn)基因小鼠 的視網(wǎng)膜的形態(tài)進行評估，我們制備石蠟組織切片并進行HE染色。以下實施例中，定量實時PCR (qRT-PCR)用的試劑為Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG with Rox anvitrogen)。同時檢測人肌動蛋白(hActin)和小鼠肌動蛋白 (mActin)作為內(nèi)參。用于檢測 hSIRTl, mSirtl, hRHO, mliho 的引物參見 SEQ ID N0. 45-57。免疫熒光染色用于檢測細胞或組織中蛋白的分布，免疫印跡用于蛋白的定 量。用到的一抗及其工作稀釋度如下rabbit anti-hSIRTl (1:500-2000, #1104-1， Epitomics), rabbit anti-Sirtl (1:500-1000, #09—845， Millipore), mouse anti-rhodopsin (1:500-2000, #sc_57433, Santa Cruz), rabbit anti-GNATl (1:200-1000，# sc-389, Santa Cruz), goat anti-hCNGAl (1:100-1000，#sc_13690, Santa Cruz), goat anti-mCNGAl (1:500-1000, #sc_13694, Santa Cruz), goat anti-PDC (1:500-1000, #sc_18413， Santa Cruz), anti-PDE6b (1:200-1000, #sc_30717， Santa Cruz), mouse anti-actin (1:2,000-10, 000, #A5228， Sigma-Aldrich)。二抗為偶聯(lián)有熒光標記或那根過氧化物酶的抗體，分別為=Alexa Fluor dyes (594 or 488) (1 :500, Invitrogen) ；Anti-mouse IgG peroxidase conjugate (1:50,000, #a2304， Sigma-Aldrich), goat anti-rabbit IgG peroxidase conjugate(1:50,000， #a9169, Sigma-Aldrich)及 rabbit anti-goat IgG peroxidase conjugate (1:80, 000, #a5420, Sigma-Aldricti)。實施例1 :多SiRNA基因沉默DNA構(gòu)建體的制備。用裝載有三個或多個SiRNA沉默盒的DNA序列(PDREl-XhoI-ShRNAl-AgeI-PDRE 2-SalI- ShRNA 2-MluI-PDRE3_PstI- ShRNA 3_HindIII)替換 pSingle-MCS-ShRNA 載體 (Clontech)中的！"et-TO-MCS區(qū)段，獲得的構(gòu)建體pPolySiRNA。如圖1所示，多個ShRNA 高效協(xié)同基因沉默的質(zhì)粒PPolyShRNA的調(diào)控元件排列。多個SiRNA沉默盒放在同一載體 上，其表達受慶大霉素應(yīng)答元件(DRE)調(diào)控。在有慶大霉素(D0XyCyCline，D0X)時，才啟動 SiRNA的表達。G418抗性基因受強啟動子SV40 (Psv4tl)控制。tTS受CMV啟動子(Paw)調(diào) 節(jié)，多聚PolyA分別用TKpA和bglobpA，為在E. coli中制備質(zhì)粒，質(zhì)粒還含有E. coli的復(fù) 制子ColEl和氨芐抗性基因(Amplr )。實施例2 :HEK293細胞的培養(yǎng)及其轉(zhuǎn)基因細胞系的構(gòu)建。本實施例培養(yǎng)HEK293細胞用的是在添加有10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基。另外， 為制備沉默hSIRTl基因的轉(zhuǎn)基因細胞系，本實施例將打靶質(zhì)粒經(jīng)BsaI酶處理線性化后，用 磷酸鈣的方法做瞬時轉(zhuǎn)染。為了選擇沉默hSIRTl基因表達的轉(zhuǎn)基因細胞系，在培養(yǎng)基中添 加G418，使其終濃度為400mg/ml。隨機挑選數(shù)個G418抗性的轉(zhuǎn)基因細胞，經(jīng)慶大霉素處 理后進行進一步的qRT-PCR、免疫印跡以及免疫熒光試驗。實施例3 在HEK293細胞中干擾hSIRTl基因表達的沉默效率。為檢測該系統(tǒng)的基因沉默效率，本發(fā)明利用HEK293細胞系研究了三個不同SiRNA 沉默盒(hSIRTI-ShRNA 1，hSIRTl_ShRNA2，hSIRTl_ShRNA3)裝載在同一載體上針對 hSIRTl 基因(GenBank accession #, NM_00114M98)的沉默效應(yīng)。為研究每個SiRNA的沉默效 率，同時也構(gòu)建了將每個SiRNA沉默盒單獨只放一個拷貝在一個載體的質(zhì)粒。質(zhì)粒線性化 后轉(zhuǎn)染HEK293細胞，G418選擇整合有SiRNA沉默盒的陽性細胞，具體步驟參見實施例2。如圖2所示，HEK293轉(zhuǎn)基因細胞株HEK-hSIRTl_aiRNA123中含有在同一載體上 裝有三個不同 ^iRNA ChSIRTl-ShRNAl, hSIRTl-ShRNA2, hSIRTl-ShRNA3)的沉默 hSIRTl 基因的構(gòu)建體al，每個SiRNA —個拷貝；HEK293轉(zhuǎn)基因細胞株HEK-hSIRTl-SiRNAl中為 裝有一個hSIRTl-SiRNAl拷貝的沉默hSIRTl基因的構(gòu)建體bl ；HEK293轉(zhuǎn)基因細胞株 HEK-hSIRTl-ShRNA2中為裝有一個hSIRTl_aiRNA2拷貝的沉默hSIRTl基因的構(gòu)建體cl ； HEK293轉(zhuǎn)基因細胞株HEK-hSIRTl-aiRNA3中含有裝有一個hSIRTl_aiRNA3拷貝的沉默 hSIRTl基因的構(gòu)建體dl。如圖3所示，實時定量PCR (qRT-PCR)的結(jié)果表明，慶大霉素誘導(dǎo)后，每個SiRNA 沉默盒的基因沉默效率能達到88%-93%。當這三個不同SiRNA沉默盒放在同一載體上時，沉 默效率高達98%以上，表達不同的沉默盒有明顯的疊加效應(yīng)。如圖4所示(Control:正常 HEK293細胞對照)，免疫印跡實驗結(jié)果表明，當使用三個相同的SiRNA沉默盒時仍有殘余的 hSIRTl蛋白，其表達仍然有10-30%，但當三個不同的SiRNA沉默盒在同一載體上時，hSIRTl 蛋白水平則降到檢測不到的程度，說明這些SiRNA分子不僅可以降解hSIRTl mRNA,也可以 通過結(jié)合殘余的mRNA分子來阻斷其繼續(xù)作為翻譯模板的作用。本實施例中也構(gòu)建了將在同一載體上將同一 SiRNA放三個拷貝的質(zhì)粒，檢測多個 相同SiRNA拷貝在HEK293細胞中對hSIRTl基因的沉默效率。如圖5所示，HEK293轉(zhuǎn)基因細胞株HEK-hSIRTl-3ShRNAl中含有在同一載體上裝有三個相同hSIRTHhRNAl拷貝的 沉默hSIRTl基因的構(gòu)建體a2 ；HEK293轉(zhuǎn)基因細胞株HEK_hSIRTl_3ShRNA2中含有在同一 載體上裝有三個相同hSIRTl-aiRNA2拷貝的沉默hSIRTl基因的構(gòu)建體M ；HEK293轉(zhuǎn)基因 細胞株HEK-hSIRTl-SiRNA3中含有在同一載體上裝有三個相同hSIRTl_aiRNA3拷貝的沉默 hSIRTl基因的構(gòu)建體c2。如圖6和圖7所示，qRT-PCR和免疫印跡實驗表明，簡單地增加單個SiRNA的拷 貝數(shù)不能明顯地進一步線性提升靶基因的沉默效率，提示既增加SiRNA的拷貝數(shù)又增加 ShRNA的多樣性比單獨只增加每個SiRNA的拷貝數(shù)更有效。圖7中，Control:正常HEK293 細胞對照。實施例4 人胚胎干細胞的培養(yǎng)及其轉(zhuǎn)基因細胞系的構(gòu)建。本實施例采用人胚胎干細胞(HESC)是H9系。培養(yǎng)人胚胎干細胞時用到的飼 養(yǎng)細胞是經(jīng)輻射處理過的來源于SNL小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)。用的DMEM/F12培養(yǎng) 基是添力口有 20% Knockout replacer (Invitrogen) , 10ng/ml bFGF, 1 mM Glutamine, 1% nonessential amino acids (NEAA), 1% penicillin/streptomycin, 0.1 mM 2-mercaptoenthanol。培養(yǎng)基每兩天更換一次，而bFGF則需每天添加。4_6天后傳代，傳代 時用的是 lmg/ml 的 dispase/collagenase IV (Invitrogen)將細胞在 37°C下消化 10-20 分鐘。在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細胞系時，需用胰蛋白酶消化成單細胞，這是為了提高細胞的成活率， 在消化前先用IOmM ROCK抑制物Y-27632 (Calbiochem)處理1小時后，再用lmg/ml的 collagenase IV和含有0. 25%胰蛋白酶、20%的KSR、ImM CaCl2于37°C消化7分鐘。用電 穿孔法將線性化的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入細胞。細胞在用電穿孔導(dǎo)入DNA構(gòu)建體之前，細胞用培養(yǎng) 基淋洗一遍并重新懸浮在新的培養(yǎng)基中，0. 5ml中的細胞數(shù)量約為1.5-3. OxlO7，然后再接 到鋪有新的飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)皿中。電穿孔是在室溫下進行，線性化DNA用量約40mg，脈沖電壓 為320V，電容為200mF。細胞在導(dǎo)入圖2所示的DNA構(gòu)建體后繼續(xù)培養(yǎng)48小時，然后再添加 G418 (50mg/ml)選擇整合有沉默盒的轉(zhuǎn)基因細胞。1個星期后，G418的濃度提高至IOOmg/ ml。隨機挑選數(shù)個G418抗性的轉(zhuǎn)基因細胞經(jīng)慶大霉素處理后進行進一步的qRT-PCR、免疫 印跡以及免疫熒光試驗。實施例5 在人胚胎干細胞中干擾hSIRTl基因表達的沉默效率。為驗證這種基因沉默策略是否適用于其他類型的細胞，本發(fā)明也檢測了圖2所示 的構(gòu)建體在人胚胎干細胞中干擾hSIRTl基因表達的效率。質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染人胚胎干細 胞(hESC)細胞，G418選擇整合有SiRNA沉默盒的陽性細胞，具體步驟參見實施例4。對hESC細胞或其轉(zhuǎn)基因細胞株(hESC-Sl，hESC_S2，hESC_S3)進行進一步的 qRT-PCR、免疫印跡以及免疫熒光試驗。如圖8所示，qRT-PCR的結(jié)果表明，慶大霉素誘 導(dǎo)后，所選的轉(zhuǎn)基因細胞系中hSIRTl mRNA level降低了 93%以上；如圖9所示，其免 疫印跡表明，hSIRTl蛋白降低到檢測不到的水平。圖9中，Control:正常人胚胎干細 胞(hESC)對照。如圖10所示，其免疫熒光的數(shù)據(jù)表明，在正常的細胞中，hSIRTl蛋白的 分布主要在細胞核中，與文獻報道相符Vaquero，A. et al.，SIRTl regulates the histone methyl-transferase SUV39H1 during heterochromatin formation. Nature 450 (7168)，440 (2007) ]0而在這些轉(zhuǎn)基因細胞系中，經(jīng)慶大霉素誘導(dǎo)后hSIRTl蛋白信 號幾乎完全消失。因此，殘余的少量hSIRTl mRNA分子不能再作為蛋白翻譯的有效模板。
9
實施例6 小鼠胚胎干細胞及其轉(zhuǎn)基因細胞系的構(gòu)建的培養(yǎng)。本發(fā)明采用小鼠胚胎干細胞(mESC)屬129/SV系。培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞時用到的 飼養(yǎng)細胞是經(jīng)輻射處理過的來源于SNL小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs )。用的DMEM培養(yǎng)基添加 有 15%FBS, 10ng/ml LIF, 1 mM Glutamine, 1% nonessential amino acids (NEAA), 1% penicillin/streptomycin, 0. 1 mM 2-mercaptoenthanol。培養(yǎng)基每兩天更換一次，而LIF 則需每天添加。為建立整合有沉默盒的細胞系，用蛋白酶將細胞克隆消化單細胞(0. 25%胰 蛋白酶，ImM EDTA，37°C，7*#)。用電穿孔法將線性化的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入細胞。在用電穿 孔導(dǎo)入DNA構(gòu)建體之前，細胞用培養(yǎng)基淋洗一遍并重新懸浮在新的培養(yǎng)基中，0. 5ml中的細 胞數(shù)量約為1.5-3.0 χ 107，然后再接種到鋪有新的飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)皿中。電穿孔是在室溫下 進行，線性化DNA用量約40mg，脈沖電壓為250V，電容為500mF。導(dǎo)入DNA構(gòu)建體培養(yǎng)48小 時后，再添加G418 (400mg/ml)選擇整合有沉默盒的轉(zhuǎn)基因細胞。7_10天后選擇G418抗 性的克隆經(jīng)慶大霉素處理后進行qRT-PCR、免疫印跡、免疫熒光和/或建立轉(zhuǎn)基因小鼠的試 驗。實施例7 在小鼠胚胎干細胞中干擾mSirtl基因表達的沉默效率。為驗證這種基因沉默策略是否適用于其他類型的細胞，本發(fā)明構(gòu)建了類似的沉默 小鼠 Sirtl (mSirtl)基因(GenBank accession #, NM_019812)的載體，是在同一載體上 裝有三個不同 ShRNA (mSirtl-ShRNAl, mSirtl-ShRNA2, mSirtl_aiRNA3)沉默 mSirtl 基因 的構(gòu)建體，每個SiRNA —個拷貝，如圖11所示。質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染mESC細胞，G418選擇整 合有S1RNA沉默盒的陽性細胞，具體步驟參見實施例6。隨機挑選三組整合有SiRNA沉默盒 的轉(zhuǎn)基因細胞株mESC-Sl，mESC-S2, mESC_S3進行檢測。加與不加慶大霉素(Dox)處理后，mESC細胞或其轉(zhuǎn)基因細胞株 (mESC-Sl, mESC-S2, mESC_S3)中 hSIRTl mRNA 水平(平均值士SEM)、檢測 mSirtl 蛋白水 平的免疫印跡試驗、檢測mSirtl蛋白分布的免疫熒光試驗的結(jié)果如圖12、圖13和圖14所 示，qRT-PCR、免疫印跡及免疫熒光實驗均表明mSirtl的表達在這些轉(zhuǎn)基因細胞系中均有 效被抑制。圖14中Control:正常小鼠胚胎干細胞(mESC)對照。實施例8 人胚胎干細胞向感光受體細胞的分化。人胚胎干細胞向感光細胞的分化按圖16所示逐步進行，分化過程是按Oskada 等人的方法分步進行Osakada, F. et al. , Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 26 (2), 215 O008)。具體做法是，用含有 lmg/ml 的 collagenase IV,0. 25% 胰蛋白酶、20%的KSRUmM CaCl2的PBS中37°C下將人胚胎干細胞的克隆部分消化，再結(jié) 合機械法將之解離成5-10個細胞的團塊。通過中在用gelatin包被過的培養(yǎng)皿中溫浴片 刻將飼養(yǎng)細胞除去。細胞團塊轉(zhuǎn)移至含有20% Knockout replacer (Invitrogen) , IOng/ ml bFGF, 1 mM Glutamine, 1% nonessential amino acids (NEAA), 1% penicillin/ streptomycin, 0.1 mM 2-mercaptoenthanol 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基的非粘附性的培養(yǎng)細 菌的培養(yǎng)皿中。兩天后，換成分化培養(yǎng)基(G-MEM) (0.1 % NEAA, ImM Pyruvate, 0. ImM 2-mercaptoenthanol, 15% KSR)。在如圖16所示的時間點，將KSR降為10%。三周后換成 添加lOOng/ml Dkk-I Lefty-A的懸浮培養(yǎng)基。再將細胞團塊按12-15團塊/cm2重的密 度重鋪在經(jīng) poly-D-lysine (BD) /laminin (BD) /fibronectin (GIBCO)包被過的培養(yǎng)皿中，用含有10%KSR的貼壁培養(yǎng)基繼續(xù)分化過程。為將其分化成感光細胞，人胚胎干細胞先 在SFEB/DL的條件下培養(yǎng)3-4個月，再換成RA/T分化培養(yǎng)基(G-MEM，5%KSR，0. ImM NEAA, 1 mM pyruvate, 0. ImM mercaptoethanol, ImM retinoic acid (RA), IOOmM taurine, N2 supplement)培養(yǎng)4周。整個過程中，細胞分成兩組，一組一直添加ang/ml的慶大霉素，另 一組不加慶大霉素。qRT-PCR、免疫印跡以及免疫熒光試驗用于分析rhodopsin (視紫紅質(zhì)) 基因的表達和分布。實施例9 在人胚胎干細胞分化而來的光受體細胞中干擾rhodopsin基因表達的
沉默效率。為進一步驗證這種基因沉默策略適用的普遍性，本發(fā)明測定了由人胚胎干細胞分 化過來的子代細胞中對特定基因表達的沉默效率。本實施例中構(gòu)建了沉默人rhodopsin (hRHO)基因(GenBank accession #’ NM_000539. 3)的 ShRNA 載體，是在同一載體上裝有 三個不同 ShRNA (hRHO-ShRNAl, hRH0-ShRNA2, hRH0_ShRNA3)的沉默 hRHO 基因的構(gòu)建體， 每個S1RNA —個拷貝，其構(gòu)成如圖15所示。Iihodopsin是視網(wǎng)膜桿狀細胞中光傳導(dǎo)系統(tǒng) 及構(gòu)成外節(jié)視盤(outer segment disk)的關(guān)鍵蛋白Lem, J. et al. , Morphological, physiological, and biochemical changes in rhodopsin knockout mice. Proc Natl Acad Sci USA 96 (2)，736 (1999) ；Palczewski, K. , G protein-coupled receptor rhodopsin. Annu Rev Biochem 75，743 (2006) 質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染 mESC 細胞，G418 選 擇整合有SiRNA沉默盒的陽性細胞做體外分化成視網(wǎng)膜桿狀細胞的試驗，具體步驟參見實 施例8。隨機挑選三組整合有ShRNA沉默盒的轉(zhuǎn)基因細胞株hESC-RCl，hESC-RC2, hESC_RC3， 進行檢測。在加與不加慶大霉素(Dox)處理后，由人胚胎細胞分化而來的感光細胞 (hESC-RC)或其轉(zhuǎn)基因細胞株(hESC-RCl, hESC-RC2, hESC_RC3)中 hRHO mRNA 水平(平均值 士 SEM)、檢測hRHO蛋白水平的免疫印跡試驗、檢測hRHO蛋白分布的免疫染色試驗結(jié)果如圖 17、圖18和圖19所示，qRT-PCR表明經(jīng)慶大霉素處理后rhodopsin mRNA水平中降低了 94% 以上；免疫印跡和免疫熒光試驗均證明rhodopsin蛋白降低到檢測不到的水平。圖18中， Control為正常視網(wǎng)膜對照。實施例10 小鼠胚胎干細胞向感光受體細胞的分化。小鼠胚胎干細胞的分化按文獻所述逐步進行，分化過程是按Oskada等人的方法分 步進行Osakada, F. et al. , Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 26 (2), 215 (2008) ]0 在圖 21 所示的時間于分化培養(yǎng)基(G-MEM, 5% KSR (GIBC0)，0. 1 mM NEAA, ImM pyruvate, 0. 1 mM 2-mercaptoethanol)中力口入 DKKl (lOOng/ml, R&D systems) , Lefty A(500ng/ml, R&D systems), 5% FBS (GIBCO)禾口 Activin—A (10ng/ml，R&D systems)。細 胞用胰蛋白酶消化后重新懸浮于含有10%FBS的經(jīng)過包被的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。包被用液 Spoly-D-Iysine (BD)/laminin (BD)/fibronectin。10 天后換成無 FBS 的培養(yǎng)基并添 力口 IOmM g-secretase 抑制物(N_[N_(3，5_difluorophenacetyl)-Lalanyl]-S-phenylgl ycine t-butyl ester)。為將其分化成感光細胞，在如圖21所示的時間點換成視網(wǎng)膜細 胞培養(yǎng)基(66%-E-MEM-HEPES (Sigma), 33% HBSS (GIBCO), 1%FBS, N2 (GIBCO)，5· 75 mg/ ml glucose, 200 mM L-glutamine, 50ng/ml aFGF (R&D systems), 10 ng/ml bFGF (R&DSystems),ImM taurine (Sigma), 3nM Shh(R&D systems), 500nM retinoic acid (RA) (Sigma)0在整個過程中，細胞分成兩組，一組一直添加ang/ml的慶大霉素，另一組不加慶 大霉素。qRT-PCR、免疫印跡以及免疫熒光試驗用于分析rhodopsin的表達和分布。實施例11 在小鼠胚胎干細胞分化而來的光受體細胞中干擾rhodopsin基因表達 的沉默效率。為進一步驗證這種基因沉默策略適用的普遍性，本發(fā)明也測定了由小鼠胚胎干細 胞分化過來的子代細胞中對特定基因表達的沉默效率。本實施例中構(gòu)建了類似的沉默小鼠 rhodopsin 基因(mRho) (GenBank accession #, NM_145383)的 ShRNA 載體，是在同一載體 上裝有三個不同 ShRNA (mRho-ShRNAl, mRho-ShRNA2, mI ho-aiRNA3)沉默 mliho 基因的構(gòu)建 體，每個SiRNA —個拷貝，其構(gòu)成如圖20所示。將上述構(gòu)建體線性化后轉(zhuǎn)染細胞小鼠胚胎干細胞(mESC)，G418選擇整合有SiRNA 沉默盒的陽性細胞做體外分化成視網(wǎng)膜桿狀細胞的試驗，具體步驟如實施例10所示。隨機 挑選含有SiRNA沉默盒的三組轉(zhuǎn)基因細胞株mESC-RCl，mESC-RC2, mESC-RC3進行檢測。在加與不加慶大霉素(Dox)處理后，由小鼠胚胎細胞分化而來的感光細胞 (mESC-RC)或其轉(zhuǎn)基因細胞株(mESC-RCl, mESC-RC2，mESC-RC3)中 mRho mRNA 水平、檢測 hRHO蛋白水平的免疫印跡試驗、檢測hRHO蛋白分布的免疫染色試驗結(jié)果分別如圖22、圖23 和圖M所示，qRT-PCR結(jié)果表明經(jīng)慶大霉素處理后rhodopsin的mRNA豐度水平降低了 91% 以上；免疫印跡和免疫熒光試驗均證明rhodopsin蛋白降低到檢測不到的水平。圖23中， Control:正常視網(wǎng)膜對照。實施例12 轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建。轉(zhuǎn)基因雄性小鼠胚胎干細胞注射到C57BL/6的囊胚后產(chǎn)生的嵌合體小鼠 與雌性C57BL/6小鼠交配獲得的子代小鼠用PCR方法進行基因型分析?；蛐头?析中用于檢查整合有沉默盒的引物N5和N3與G418抗性基因的部分學(xué)列匹配(N5 5'-gctgctctgatgccgccgtgttc ；N3 :5'-gatgtttcgc ttggtggtcgaatg)。注身寸小鼠時慶大霉 素的劑量為2mg/g體重。qRT-PCR、免疫印跡以及免疫熒光試驗用于分析rhodopsin的表達 和分布。石蠟切片經(jīng)HE染色后用于評估視網(wǎng)膜的感光細胞數(shù)量已經(jīng)視網(wǎng)膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)。實施例13 在轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜中干擾rhodopsin基因表達的沉默效率。為進一步驗證該基因沉默策略是否也適用于轉(zhuǎn)基因動物，本發(fā)明利用以上獲得的 一個整合有rhodopsin基因沉默盒的小鼠胚胎干細胞建立了轉(zhuǎn)基因小鼠模型(具體步驟參 見實施例12)。實驗中結(jié)果表明，在沒有慶大霉素的情況下，轉(zhuǎn)基因小鼠的rhodopsin能正 常表達，其視網(wǎng)膜也能正常發(fā)育。在慶大霉素存在的情況下，rhodopsin的表達顯著性地 受到抑制并導(dǎo)致視網(wǎng)膜退化。免疫印跡表明，經(jīng)慶大霉素處理兩周后，rhodopsin蛋白降 低到檢測不到的水平而其他多個視網(wǎng)膜特異的標志蛋白(GNAT1、PDC、PDE6b、CNGAU GRKl 及RD12)在視網(wǎng)膜桿狀細胞中沒有明顯退化前基本不受影響，而rhodopsin蛋白兩周后降 低檢測不到的水平，如圖25和圖沈所示。圖25中，Control:正視網(wǎng)膜對照。圖沈和圖 27中，WT 正常視網(wǎng)膜；IihoKD rhodopsin基因沉默的轉(zhuǎn)基因視網(wǎng)膜。隨著慶大霉素處理繼 續(xù)，感光受體細胞退化越來越明顯。免疫熒光試驗表明，在沒有經(jīng)慶大霉素處理的情況下， rhodopsin蛋白特異性地高度富集在外節(jié)視盤。如圖27所示，組織形態(tài)學(xué)分析表明，對正 常小鼠慶大霉素本身不會影響感光受體細胞的數(shù)量和結(jié)構(gòu)；而對于轉(zhuǎn)基因小鼠，若不經(jīng)慶大霉素處理，其光受體細胞的數(shù)量和結(jié)構(gòu)與正常小鼠相似，無明顯的缺陷；在慶大霉素處理 兩周之后只是視網(wǎng)膜的外節(jié)(OS)長度有些輕微變短；在慶大霉素處理1個月后，盡管光受 體細胞在數(shù)量上能有3/4以上的細胞還存活，但視網(wǎng)膜的外節(jié)明顯變短；在慶大霉素處理2 個月后，只有不到兩排光受體細胞還存活，而視網(wǎng)膜外節(jié)則短得近乎可以忽略。這些表型變 化，與傳統(tǒng)的方法構(gòu)建的rhodopsin基因敲除動物或其突變體的轉(zhuǎn)基因動物相一致。從上述實施例中可以看到，就靶蛋白的表達而言，本發(fā)明設(shè)計的慶大霉素控制下 的多S1RNA協(xié)同沉默基因表達系統(tǒng)在小鼠、人等多種哺乳類細胞或器官中均能實現(xiàn)接近 100%沉默效率，表明本發(fā)明S1RNA表達載體具有廣泛的適用性，適用于人類細胞或組織、各 種哺乳類動物細胞或組織、其他潛在種屬的細胞或組織以及轉(zhuǎn)基因動物。應(yīng)當理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可 以根據(jù)上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保 護范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于多SiRNA介導(dǎo)協(xié)同基因沉默的SiRNA載體，其特征在于，ShRNA載體上裝載 有一段含有多個^iRNA沉默盒的DNA序列；所述S1RNA沉默盒是從多種不同的SiRNA中選擇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SiRNA載體，其特征在于，所述SiRNA載體上裝載有一段含有 三個不同的SiRNA沉默盒的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的S1RNA載體，其特征在于，每個SiRNA沉默盒上游設(shè)置有一個 慶大霉素應(yīng)答的啟動子元件Pdke ；所述慶大霉素應(yīng)答的啟動子元件Pdke包括一啟動子序列、 一慶大霉素應(yīng)答元件；所述啟動子序列與慶大霉素應(yīng)答元件、ShRNA沉默盒依次相連。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的S1RNA載體，其特征在于，所述啟動子元件還包括一間隔序 列，設(shè)置在一慶大霉素應(yīng)答元件與SiRNA沉默盒之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的S1RNA載體，其特征在于，所述三個不同的SiRNA沉默盒的慶 大霉素應(yīng)答的啟動子元件Pdke序列如SEQ ID NO. 1-3所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的S1RNA載體，其特征在于，所述裝載有SiRNA沉默盒的DNA序 列上游還設(shè)置有一受四環(huán)素控制的沉默子tTS、一強啟動子，所述強啟動子用于組成型表達 沉默子tTS，設(shè)置在沉默子tTS的上游。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的S1RNA載體，其特征在于，所述強啟動子為CMV啟動子。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的S1RNA載體，其特征在于，所述強啟動子為CAG啟動子或UBC 啟動子。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的S1RNA載體，其特征在于，所述CMV啟動子的上游和受四 環(huán)素控制的沉默子tTS的下游還分別設(shè)置有多聚PolyA ；所述多聚PolyA分別用TKpA和 bglobpA, TKpA設(shè)置在CMV強啟動子的上游，bglobpA設(shè)置在受四環(huán)素控制的沉默子tTS與 第一個S1RNA沉默盒的啟動子元件之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的S1RNA載體，其特征在于，所述SiRNA載體為質(zhì)粒載體，還含 有E. coli的復(fù)制子和ColEl和氨芐抗性基因Amplrtj
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的SiRNA載體，其特征在于，還含有G418抗性基因和強啟動 子SV40 ；強啟動子SV40設(shè)置在G418抗性基因的上游，控制G418抗性基因的表達。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項所述的SiRNA載體，其特征在于，所述S1RNA載體適用于 人類細胞或組織、各種哺乳類動物細胞或組織以及轉(zhuǎn)基因動物。
13.一種使用權(quán)利要求1所述的SiRNA載體高效協(xié)同基因沉默的方法，其特征在于，根 據(jù)需要沉默的靶基因設(shè)計多個不同的SiRNA，從中選擇不同的SiRNA，構(gòu)建一個裝載有一段 含有多個^iRNA沉默盒的DNA序列的S1RNA載體，將所述S1RNA載體轉(zhuǎn)染到受體細胞后，多 個SiRNA協(xié)同沉默靶基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多ShRNA高效協(xié)同沉默基因方法及載體，提供了一項可誘導(dǎo)性的多ShRNA協(xié)同干擾基因表達的ShRNA載體，ShRNA經(jīng)藥物誘導(dǎo)表達后，在靶基因的表達量降至檢查不到水平，而且本發(fā)明還具有廣泛的適用性，可取代傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)來實現(xiàn)基因打靶。
文檔編號C12N15/63GK102061305SQ20101058801
公開日2011年5月18日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者劉小青, 黃 俊 申請人:深圳市百恩維生物科技有限公司