專(zhuān)利名稱(chēng)：一種豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒三聯(lián)病毒樣顆粒疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒三聯(lián)病毒樣顆粒疫苗及其制備方法，特別涉及一種以含有2-型豬圓環(huán)病毒的核衣殼蛋白、豬細(xì)小病毒VP2蛋白抗原表位、以及豬繁殖與呼吸綜合癥病毒Gp5蛋白組成的三聯(lián)病毒樣顆粒疫苗(Trivalent VLP)及其制備方法。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)將導(dǎo)致豬群免疫力下降，并與豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合癥(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)、豬皮炎及腎病綜合癥(Porcine Dermatitis and ^phropathy Syndrome，PDNS)、豬繁殖障礙 (Porcine reproductive failure)、豬呼吸道疾病綜合征(Porcine Respiratory Disease Syndrome，PRDC)、豬增生性壞死性肺炎(Porcine Necrotizing Pneumonia, PNP)、豬先天性振顫(Porcine Congenital Tremor, CT)等多種疾病有聯(lián)系。豬圓環(huán)病毒(PCV)是 1974年在一種體外培養(yǎng)的豬腎細(xì)胞系H(-15中首次發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)時(shí)認(rèn)為是一種細(xì)胞培養(yǎng)的污染物，因?yàn)槠洳⒉痪哂袑?dǎo)致細(xì)胞病變等典型的病毒樣作用，所以稱(chēng)為小病毒樣核酸污染物。隨后陸續(xù)有報(bào)道指出這種小病毒樣核酸污染物其實(shí)是一種病毒，這種病毒是一種小型無(wú)包膜的12面體病毒，核心包含一個(gè)單股環(huán)狀DNA基因組，不導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)病及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生病變，并正式將其命名為豬圓環(huán)病毒(Procine Circovirus, PCV) 0但1994 年Hines等首先報(bào)道了在患有先天性振顫(Congenital Tremor)的仔豬中發(fā)現(xiàn)了 PCV樣病毒(PCV-like Virus)，1995年Allan等人也在幾例豬的死胎中發(fā)現(xiàn)了 PCV的抗體，這將PCV與各種疾病聯(lián)系到了一起。之后對(duì)PCV的報(bào)道漸漸指向了一種分離自病豬而不是細(xì)胞培養(yǎng)物的“新型豬圓環(huán)病毒(Novel PCV) ”。隨著對(duì)該新型PCV的深入研究，發(fā)現(xiàn)從基因組到血清型都與傳統(tǒng)的PCV存在差異，隨之國(guó)際上將這種新型的、可以致病的豬圓環(huán)病毒命名為2-型豬圓環(huán)病毒(PCV-2)，同時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的非致病性豬圓環(huán)病毒命名為1-型豬圓環(huán)病毒(PCV-I)。 在臨床中，PCV-2主要感染5-12周齡的小豬，病豬表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、被毛粗亂、營(yíng)養(yǎng)不良、呼吸困難、黃膽、粘膜蒼白，可成為僵豬，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡。有證據(jù)表明，PCV-2的致病性主要是由于其對(duì)免疫系統(tǒng)的損傷造成的，研究發(fā)現(xiàn)，感染 PCV-2的病豬淋巴細(xì)胞會(huì)發(fā)生明顯減少。Darwich等報(bào)道，患有豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合癥(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)的病豬出現(xiàn) CD3+、CD4+T 淋巴細(xì)胞減少，CD8+T淋巴細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生明顯變化，而典型的由PCV-2感染而引起PMWS病癥的患豬出現(xiàn)了⑶8+T淋巴細(xì)胞的減少。而且有證據(jù)表明PCV-2在淋巴器官中的數(shù)量與患豬淋巴細(xì)胞的消耗以及外周血中IgM及⑶8+T淋巴細(xì)胞的減少有著直接的關(guān)系。Nielsen等人報(bào)道，患豬在PCV-2感染10天后淋巴細(xì)胞開(kāi)始減少，在第14天時(shí)出現(xiàn)顯著下降，且這種下降會(huì)一直持續(xù)到患豬死亡。而且通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)，所有的T淋巴細(xì)胞亞群都會(huì)由于PCV-2 的感染而出現(xiàn)數(shù)量上的減少。Sarli等人報(bào)道，PCV-2對(duì)淋巴細(xì)胞的消耗還包括樹(shù)突狀細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，同時(shí)Chianini等人根據(jù)B淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞數(shù)量的下降程度，將其分為輕度損傷、中度損傷以及重度損傷，其中重度損傷可致淋巴細(xì)胞徹底消失。這充分說(shuō)明了 PCV-2的感染可導(dǎo)致免疫機(jī)能下降，同時(shí)也為患豬由于PCV-2的感染并與其他病原體的并發(fā)感染而導(dǎo)致諸如PMWS—類(lèi)疾病的發(fā)生提供了理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，PCV-2的感染通常伴隨豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PCV)、 豬瘟病毒(CSFV)、卡氏肺囊蟲(chóng)(Pneumocystis carinii)、衣原體(Chlamydia spp.)、肺 ( ^ (pulmonary aspergillosis)、β 包子蟲(chóng)(Cryptosporidium parvum)等共同感染而引起疾病的發(fā)生。其中PCV-2感染作為主要病因的疾病是豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合癥 (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)，在PCV-2感染的同時(shí)通常伴隨有 PRRSV及PPV的感染，而且在實(shí)驗(yàn)室中PCV-2的單獨(dú)感染也可造成PMWS的典型癥狀。PCV-2是一類(lèi)無(wú)包膜、十二面體、包含一個(gè)單股環(huán)狀DNA基因組的、目前發(fā)現(xiàn)最小的病毒，直徑17nm，與雞貧血病毒(cAV)、鸚鵡喙羽病毒(PBFDAV)等共屬于圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬。有證據(jù)表明PCV與來(lái)自植物的矮小病毒(Nano Virus)親緣關(guān)系非常接近，推測(cè) PCV是植物病毒侵染脊椎動(dòng)物后發(fā)生重組與突變而發(fā)生的宿主遷移。PCV-2在pH3環(huán)境、氯仿處理及56-70°C內(nèi)都有活性。PCV-I基因組全長(zhǎng)1759nt、PCV-2基因組全長(zhǎng)1768nt，PCV_l 編碼7個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，PCV-2有11個(gè)潛在開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼2_36kD的蛋白質(zhì)， 但只有6個(gè)ORF得到證實(shí)。其中主要的ORF有三個(gè)，分別是0RF-1、0RF-2和0RF-3，0RF-1 編碼復(fù)制酶(r印)，0RF-2編碼PCV-2的主要結(jié)構(gòu)蛋白(cap)，同時(shí)也是主要免疫原性蛋白， 0RF-3編碼蛋白與PCV-2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有直接關(guān)系。另外，基于cap蛋白核酸序列的生物信息學(xué)分析，可將PCV-2分為PCV-2a、PCV-2b、PCV-2c三個(gè)亞型。有文獻(xiàn)報(bào)道，在中國(guó)發(fā)生的 PCV-2感染主要集中在PCV-2b亞型，但FangWang等人報(bào)道，在中國(guó)還存在PCV-2a、PCV_2d、 PCV-2e亞型的感染，而且PCV-2d、PCV4e兩個(gè)亞型是2009年FangWang等人首次在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的。豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)是一種引起母豬繁殖障礙的，其主要特征是導(dǎo)致母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、胎兒木乃伊化及新生仔豬的死亡。Mary和Mahnel于1966年進(jìn)行豬瘟病毒組織培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的，并認(rèn)為是培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)潛伏感染的病毒。隨后相繼從一些正常豬腎細(xì)胞培養(yǎng)物和感染豬瘟病毒的豬腎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)直徑為22 23nm的病毒粒子，并認(rèn)為與Kilham(1959)發(fā)現(xiàn)的大鼠細(xì)小病毒相似。通過(guò)核酸鑒定證明為DNA型。Cartwright等 (1967)在對(duì)豬的不孕癥和流產(chǎn)、死產(chǎn)的病原學(xué)研究中，從病料中分離出了豬細(xì)小病毒，從而首次證明了它的致病作用。通過(guò)血清學(xué)鑒定證實(shí)，所有上述分離毒株，包括從一些傳代細(xì)胞系中分離的類(lèi)似病毒均與PPV同屬一型，盡管名稱(chēng)各異。從六十年代中期分離病毒和逐步明確其致病作用以來(lái)，已相繼從歐洲、美洲、亞洲等很多國(guó)家分到病毒或查出抗體。它在豬群中檢出率甚高如美國(guó)一些豬群的血清抗體陽(yáng)性率達(dá)50% 80%，丹麥12% 42%，澳大利亞52%，英國(guó)19% 56(%，德國(guó)討(％。在日本，據(jù)估計(jì)約10%的豬流產(chǎn)是由本病毒引起的。我國(guó)已先后在北京、上海、吉林、黑龍江、四川和淅江等地分離到了 PPV，血清學(xué)調(diào)查的陽(yáng)性率為80%。PPV按照其致病性與組織嗜性大致可以分為4個(gè)類(lèi)型。第1類(lèi)是以NADI-2 株為代表，口服接種不能穿過(guò)胎盤(pán)屏障，不能形成病毒血癥，可以用作弱毒疫苗來(lái)防制PPV 感染；第2類(lèi)是以NADL 8株為代表的強(qiáng)毒株，口服接種能夠穿過(guò)胎盤(pán)屏障，造成胎兒感染， 形成病毒血癥；第3類(lèi)是以Kresse株為代表的皮炎型強(qiáng)毒株，有報(bào)道稱(chēng)其毒力比NADL-8株還要強(qiáng)；第4類(lèi)為腸炎型毒株，其主要引起腸道的病變。雖然已經(jīng)分離出了多株P(guān)PV，但是目前認(rèn)為PPV只有一個(gè)血清型。PPV病毒外觀(guān)呈六角形或圓形，無(wú)囊膜，直徑20 23nm，二十面體等軸立體對(duì)稱(chēng)， 衣殼由32個(gè)殼粒組成。PPV為細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬的成員。與多數(shù)細(xì)小病毒一樣，PPV 對(duì)加熱具有強(qiáng)大的抵抗力。據(jù)Cartwright等的試驗(yàn)資料(1967)，當(dāng)56°C 30分鐘加熱處理時(shí)，無(wú)論病毒的傳染性還是凝集紅細(xì)胞的能力，都無(wú)明顯改變。在70°C經(jīng)2小時(shí)加熱處理后，其感染力雖有所下降，但并不喪失。但80°C經(jīng)5分鐘加熱即可使其失去活性。病毒對(duì)酸有較強(qiáng)的抵抗性，在PH3 9間穩(wěn)定。病毒對(duì)乙醚、氯仿等脂溶劑有抵抗力。短時(shí)間的(如 1小時(shí))胰酶處理對(duì)病毒懸液感染性不僅沒(méi)有影響，而且能提高其感染效價(jià)，這可能是由于胰酶使病毒粒子在懸液中進(jìn)一步分散的緣故。組織培養(yǎng)的病毒懸液或保存在PH9甘油緩沖鹽水中的病毒，在-20°C和-70°C下，經(jīng)一年以上的保存，無(wú)論其感染效價(jià)和血凝性都不減弱。PPV基因組為單股負(fù)鏈DNA，大小約為5000bp，成熟的病毒粒子僅含有負(fù)鏈DNA基因組 [9]。PPV基因組有兩個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框架，3端編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP)，5端編碼非結(jié)構(gòu)蛋白 (NS)，即調(diào)節(jié)蛋白?；蚪M共編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白和兩種非結(jié)構(gòu)蛋白，即VPl、VP2、VP3、NSl 和NS2。整個(gè)編碼區(qū)基因相互重疊，結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白有各自獨(dú)立的啟動(dòng)子區(qū)域，具有真核啟動(dòng)子的一般特征。結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的mRNAs共同終止于94 96bp。PPV基因組編碼兩條結(jié)構(gòu)多肽，即VPl和VP2。另有一條結(jié)構(gòu)多肽VP3由VP2水解而產(chǎn)生。結(jié)構(gòu)多肽形成后，裝配成病毒粒子。編碼PPV結(jié)構(gòu)多肽和非結(jié)構(gòu)多肽的基因幾乎貫穿整個(gè)DNA序列，這樣，就使形成的病毒粒子能以極小的空問(wèn)存在。VPl蛋白C端氨基酸與VP2的N端氨基酸序列相互重疊，其N(xiāo)端富含堿性殘基。其中VP2蛋白既是主要的結(jié)構(gòu)蛋白也是主要的免疫原蛋白，Soren等發(fā)現(xiàn)其N(xiāo)末端19個(gè)氨基酸是其中和表位，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的中和抗體。豬繁歹直與呼吸綜合癥病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，是導(dǎo)致母豬流產(chǎn)和小豬呼吸系統(tǒng)疾病的一種病毒，1991年在荷蘭被分離出來(lái)并命名為萊利斯塔德病毒(Lelystad Virus)，1992年在美國(guó)也分離出一株能造成相同癥狀的病毒，隨后該病毒被正式命名為豬繁殖與呼吸綜合癥病毒，并確立了以L(fǎng)elystad Virus (LV) 為代表的歐洲株、和以ATCC VR2332株為代表的美洲株。在1995年末在中國(guó)大陸也出現(xiàn)了一種臨床表現(xiàn)為體溫升高、皮膚發(fā)紅，并伴隨高致病率和死亡率的疫情，當(dāng)時(shí)被稱(chēng)作“豬高熱病”。當(dāng)1996年該病毒被分離出來(lái)后證實(shí)該疫情是由變異的美洲株P(guān)RRSV引起的，遂確定為豬繁殖與呼吸綜合癥，又稱(chēng)“藍(lán)耳病”。在2006-2007年，在中國(guó)大陸爆發(fā)的大規(guī)模藍(lán)耳病疫情，致病率與死亡率遠(yuǎn)高于以往疫情，這導(dǎo)致了當(dāng)時(shí)中國(guó)豬肉價(jià)格的飛漲，并對(duì)生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重打擊。當(dāng)該高致病性藍(lán)耳病病毒被分離出來(lái)，并利用分子生物學(xué)方法研究后，發(fā)現(xiàn)造成這次疫情的PRRSV在Nsp2編碼區(qū)缺少90個(gè)核苷酸，相應(yīng)編碼蛋白有30個(gè)氨基酸的卻失，并且有證據(jù)表明這是在中國(guó)大陸發(fā)生突變的一類(lèi)毒株，其30個(gè)氨基酸的缺失雖然與其高致病性沒(méi)有關(guān)系，卻是高致病性毒株的一個(gè)明顯標(biāo)志。同時(shí)在中國(guó)爆發(fā)的高致病性藍(lán)耳病的另一個(gè)特征是多種病原體的共同感染與繼發(fā)感染，有證據(jù)表明，在PRRSV感染的同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了豬瘟、豬偽狂犬病、豬流感、豬細(xì)小病毒、豬鏈球菌的共同感染，以及繼發(fā)的豬霍亂沙門(mén)氏菌、豬胸膜肺炎放線(xiàn)菌肺炎、副豬嗜血桿菌感染。其中最重要的一點(diǎn)是高致病性PRRSV與可以造成仔豬多系統(tǒng)綜合癥的豬2型圓環(huán)病毒(PCV-2)的雙重感染，這些共同感染和繼發(fā)感染造成了病豬的主要臨床癥狀與疫情的大規(guī)模傳播。PRRSV是一類(lèi)小型有包膜病毒，直徑45nm-65nm。屬于單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)15Kb,除去5，端和3，端兩個(gè)非轉(zhuǎn)錄區(qū)(5，UTR,3' UTR)，共有8個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。 其中ORFl占基因組全長(zhǎng)80%，分為ORFla和ORFlb兩個(gè)部分，共編碼12個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 (NSP)，包括RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)以及其他未知蛋白?；蚪M余下的20%包含0RF2-0RF7六個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中0RF2編碼糖基化結(jié)構(gòu)蛋白GP2、0RF3編碼糖基化結(jié)構(gòu)蛋白GP3、0RF4編碼糖基化結(jié)構(gòu)蛋白GP4、0RF5編碼糖基化結(jié)構(gòu)蛋白GP5、0RF6編碼非糖基化結(jié)構(gòu)蛋白M、0RF7編碼核蛋白N。其中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白為GP5、M、N三種。其中N蛋白長(zhǎng)15kD，至少有5個(gè)抗原決定簇，其中包括兩型的共同決定簇和特異性決定簇，具有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，但它不是糖基化蛋白。N蛋白的C端在維持蛋白構(gòu)象上起重要作用。其N(xiāo)端半段是由Arg、Lys和His 3種堿性氨基酸組成，可能和RNA基因組間的相互作用有關(guān)。N蛋白之間形成同源二聚體，對(duì)病毒的組裝至關(guān)重要。M蛋白約18kD，在PRRSV中非常保守，在病毒包膜表面三次跨膜，并且N末端的16個(gè)氨基酸殘基暴露在膜外，雖然M蛋白的功能還沒(méi)有完全研究清楚，但已有研究推測(cè)，M蛋白在PRRSV的組裝和出芽時(shí)扮演重要角色。同時(shí) M蛋白能刺激T淋巴細(xì)胞的增生，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體具有中和作用。GP5蛋白約25kD，是一個(gè)糖基化蛋白，含有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，且非常不保守，三次跨膜，并有一個(gè)70個(gè)氨基酸殘基的胞外區(qū)。有6個(gè)抗原決定簇，有證據(jù)表明GP5與PRRSV的抗體識(shí)別過(guò)程中起關(guān)鍵作用，是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，病毒中和作用與抗GP5抗體效價(jià)呈顯著相關(guān)性，同時(shí)GP5 還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是公認(rèn)的PRRSV的主要保護(hù)性抗原。疫苗是防治病毒感染的有效手段，目前已經(jīng)面世的針對(duì)PCV_2、PPV、PRRSV的疫苗主要包括滅活疫苗、重組病毒疫苗、亞單位疫苗。這些單價(jià)疫苗僅能誘導(dǎo)抵抗相應(yīng)病毒的抗體，未能達(dá)到交叉保護(hù)的目的。由于一般情況下，引起豬患病的不僅僅是感染上述病毒的一種，而是由多種病毒或主或次的協(xié)同感染，最后誘發(fā)豬發(fā)病。比如豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合癥(PMWS)，PCV-2是PMWS的主要病原。但研究發(fā)現(xiàn)PCV-2經(jīng)常與其它病原協(xié)同作用。這些病原包括豬生殖-呼吸綜合征病毒(PRRSV)、細(xì)小病毒、肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌、沙門(mén)氏菌、鏈球菌和巴氏桿菌等，使疾病復(fù)雜化，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此克服目前活苗、滅活苗、以及基因工程疫苗的低安全性、低保護(hù)力等缺點(diǎn)，尋求研發(fā)一種安全、高效、非復(fù)制的病毒疫苗，在能較好地保護(hù)病毒攻擊的同時(shí)，并能較好地避免共同感染和繼發(fā)感染的發(fā)生，是安全、有效免疫防控PCV-2、PPV、PRRSV的重大科學(xué)課題。病毒樣顆粒(Virus-like particle，VLP)是由病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白組成不含病毒核酸的病毒粒子空殼。由于VLP大小、結(jié)構(gòu)及表面抗原和多肽表位與真正的病毒幾乎沒(méi)有區(qū)別，因此能被宿主抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別，引起免疫應(yīng)答和效應(yīng)，且無(wú)潛在的副作用。首先， 與活苗及滅活苗相比，病毒樣顆粒疫苗沒(méi)有不安全因素；與亞單位疫苗相比，VLP是多個(gè)抗原蛋白組成，具有很強(qiáng)的免疫原性；與有良好口碑的病毒體(Virosome)相比，VLP既不是由活病毒制備而來(lái)，沒(méi)有潛在的危險(xiǎn)性、也不需要大量的繁殖病毒，沒(méi)有安全性低、成本高以及制備周期長(zhǎng)等不足；由此VLP疫苗被當(dāng)今譽(yù)為病毒類(lèi)疫苗發(fā)展的新里程碑。目前的乙肝 VLP 疫苗(Recombivax HB，Merck)、乳頭瘤 VLP 疫苗(Gardisil，Merck)和流感 VLP 疫苗已上市，戊型VLP疫苗等多個(gè)品種在臨床研究中。另外VLP疫苗是由病毒蛋白自組裝成天然結(jié)構(gòu)，由于其特殊的三維結(jié)構(gòu)可作為一個(gè)藥物傳遞系統(tǒng)或抗原表位錨定位點(diǎn)，目前研究最多的是PPV VLP，其內(nèi)部可以包埋一些小分子的核酸，表面可以錨定一些抗原表位。雖然目前對(duì)這些重組VLP形成的機(jī)制與效率問(wèn)題還不明確，但已有證據(jù)表明病毒的結(jié)構(gòu)蛋白可以獨(dú)立包裝成病毒空殼的同時(shí)，也能夠?qū)⑦m宜的抗原表位富集在其表面。同時(shí)在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中以證明利用動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的PCV-2的CAP蛋白，PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP5的表位，PPV 結(jié)構(gòu)蛋白VP2的表位可以組裝VLP，并能誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物良好的免疫應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種豬圓環(huán)病毒(PCV-2)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)三聯(lián)病毒樣顆粒疫苗(Triple VLP疫苗)及其制備方法。本發(fā)明目的是通過(guò)如下方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明Triple VLP疫苗含有2型豬圓環(huán)病毒(PCV-2)主要結(jié)構(gòu)蛋白CAP蛋白，豬細(xì)小病毒(PPV)結(jié)構(gòu)蛋白VP2的表位，與B亞群豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)結(jié)構(gòu)蛋白GP5的表位。本發(fā)明Triple VLP疫苗涉及以下核酸序列①PCV_2 CAP蛋白的核酸序列；②PPV VP2蛋白的1-57核酸序列；③PRRSV GP5蛋白的88-156核酸序列；其中，所述CAP蛋白核酸序列包括來(lái)自PCV-2a的HR、HB0603、HB0604、BJ0602、SZ、亞型的CAP蛋白核酸序列， 以及來(lái)自PCV-2b的BJ-HB、⑶、⑶-TS、BJ0401、BJ0402、亞型的CAP蛋白核酸序列，以及來(lái)自PCV-2d的GS04、SD、TJ、TJ06亞型的CAP蛋白核酸序列，以及來(lái)自PCV_2e的GX0602、 JX0602、HB0602、LN06、HN0601亞型的CAP蛋白核酸序列；其中，所述PPV VP2蛋白的1_57核酸序列包括來(lái)自PPV的NADL-2、Kresse、P0VG、Challenge、VRI-l亞型VP2蛋白的1-57核酸序列；其中所述PRRSVGP5蛋白88-156核酸序列包括來(lái)自PRRSV的CH-la、BJ-4、HB_l (SH)、 Em2007、JXAl亞型GP5蛋白的88-156核酸序列。本發(fā)明Triple VLP疫苗涉及以下氨基酸序列①PCV-2CAP蛋白的氨基酸序列； ②PPV VP2蛋白的1-19氨基酸序列；③PRRSV GP5蛋白的30-52氨基酸序列；其中，所述 CAP蛋白氨基酸序列包括來(lái)自PCV-2a的PCV_2a的HR、HB0603、HB0604、BJ0602、SZ、亞型的 CAP蛋白氨基酸序列，以及來(lái)自PCV-2b的BJ-HB、⑶、⑶_TS、BJ0401、BJ0402亞型的CAP蛋白氨基酸序列，以及來(lái)自PCV-2d的GS04、SD、TJ、TJ06亞型的CAP蛋白氨基酸序列，以及來(lái)自PCV-加的GX0602、JX0602、HB0602、LN06、HN0601亞型的CAP蛋白氨基酸序列；其中，所述 PPV VP2 蛋白的 1-19 氨基酸序列包括來(lái)自 PPV 的 NADL-2、Kresse、P0VG、Challenge、VRI_l 亞型VP2蛋白1-19蛋白氨基酸序列；其中所述PRRSV GP5蛋白的30-52氨基酸序列包括來(lái)自 PRRSV CH-la、BJ-4、HB-I (SH)、Em2007、JXAl 亞型 GP5 蛋白的 30-52 氨基酸序列。本發(fā)明Triple VLP疫苗含有PCV-2的主要結(jié)構(gòu)蛋白CAP蛋白，并攜帶有PPV VP2 蛋白的表位肽，以及PRRSV GP5蛋白的表位肽。①其中所述CAP蛋白包括來(lái)自PCV-加的HR、 HB0603、HB0604、BJ0602、SZ 亞型的 CAP 蛋白，以及來(lái)自 PCV_2b 的 BJ-HB、GD、ffl)-TS、BJ0401、 BJ0402亞型的CAP蛋白，以及來(lái)自PCV-2d的GS04、SD、TJ、TJ06亞型的CAP蛋白，以及來(lái)自 PCV-2e 的 GX0602、JX0602、HB0602、LN06、HN0601 亞型的 CAP 蛋白；其中，所述 PPV VP2 蛋白的表位肽包括來(lái)自 PPV 的 NADL-2、Kresse, POVG, Challenge、VRI-I 亞型 VP2 蛋白 1-19 表位肽；其中，所述PRRSV GP5蛋白的30-52表位肽包括來(lái)自PRRSV CH-la, BJ-4、HB-I (SH)、 Em2007、JXAl亞型GP5蛋白的30-52表位肽。6/12 頁(yè)本發(fā)明Triple VLP疫苗包含一個(gè)攜帶有PCV-2主要結(jié)構(gòu)蛋白CAP蛋白，PPV VP2 蛋白抗原表位，PRRSV GP5蛋白抗原表位的重組真核表達(dá)載體、雞成纖維細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞；其中，所述真核表達(dá)載體選自①PHWD2000 ’②p0PI3CAT ；③pCAGGS ； ④pcDNA6/TR ；⑤pCMV-HA ；所述雞成纖維細(xì)胞選自①UMNSAH/DF-1細(xì)胞；②分離9-10齡禽成纖維細(xì)胞；所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自①PK-15細(xì)胞；②VERO細(xì)胞；③COS細(xì)胞 ’④人二倍體細(xì)胞；⑤；BHK細(xì)胞；⑥CHO細(xì)胞；⑦M(jìn)DCK細(xì)胞；⑧H印-G2細(xì)胞；所述昆蟲(chóng)細(xì)胞選自 ①Tn5細(xì)胞；②SF9 Cell細(xì)胞。其中，本發(fā)明pHWD2000載體是由pHW2000載體改造得到，包括去掉pHW2000載體上游的PCMV啟動(dòng)子，并用雞β-actin蛋白啟動(dòng)子替換，同時(shí)在雞β-actin蛋白啟動(dòng)子上游插入hCMV-IE增強(qiáng)子，改造后的PCWD2000可以在真核系統(tǒng)中高效表達(dá)外源基因，同時(shí) PCWD2000有著較小的分子量，可以攜帶較大的外源基因片段。其中，本發(fā)明Triple VLP疫苗可不含有佐劑，也可以含有如下佐劑中的一種或幾種①新型納米鋁佐劑；②氫氧化鋁或磷酸鋁；③水凝膠佐劑季胺化的殼聚糖。④rLT(重組不耐熱性腸毒素)等。本發(fā)明Triple VLP疫苗可制成多種臨床適用的劑型，包含但不限于注射劑型、滴鼻劑型、飲水劑型。本發(fā)明Triple VLP疫苗的制備方法包括如下步驟以構(gòu)建重組pHWD2000真核表達(dá)載體為例①構(gòu)建pHWD2000真核表達(dá)載體；②含有編碼PCV-2CAP蛋白核酸序列、PPV VP2蛋白表位核酸序列、PRRSV GP5蛋白表位核酸序列的重組真核表達(dá)載體；③提供一種用于表達(dá)的細(xì)胞系，將含有編碼PCV-2CAP蛋白核酸序列、PPV VP2蛋白表位核酸序列、PRRSV GP5蛋白表位核酸序列的重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化用于表達(dá)的細(xì)胞系，經(jīng)轉(zhuǎn)染后可以釋放Triple VLP ；④提供用于純化Triple VLP的方法，方法包括蔗糖梯度離心純化方法以及柱層析純化方法。其中該方法所述Triple VLP可激發(fā)體液與細(xì)胞雙重的免疫應(yīng)答；其中，所述 Triple VLP 所包含 CAP 蛋白包括來(lái)自 PCV_2a 的 HR、HB0603、HB0604、BJ0602、SZ 亞型的 CAP蛋白，以及來(lái)自PCV-2b的BJ-HB、⑶、⑶-TS、BJ0401、BJ0402亞型的CAP蛋白，以及來(lái)自 PCV-2d 的 GS04、SD、TJ、TJ06 亞型的 CAP 蛋白，以及來(lái)自 PCV-2e 的 GX0602、JX0602、HB0602、 LN06.HN0601亞型的CAP蛋白；其中，所述PPV VP2蛋白的表位肽包括來(lái)自PPV的NADL-2、 Kresse、P0VG、Challenge、VRI-I 亞型 VP2 蛋白 1-19 表位肽；其中，所述 PRRSV GP5 蛋白的 30-52 表位肽包括來(lái)自 PRRSV CH-la、BJ-4、HB_l (SH)、Em2007、JXAl 亞型 GP5 蛋白的 30-52 表位肽。其中，本發(fā)明方法涉及一個(gè)Triple VLP表達(dá)宿主細(xì)胞系，其中，所指細(xì)胞為雞成纖維細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，雞成纖維細(xì)胞有①UMNSAH/DF-1細(xì)胞；②分離9_10齡禽成纖維細(xì)胞；哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自①PK-15細(xì)胞；②VERO細(xì)胞；③COS細(xì)胞；④人二倍體細(xì)胞；⑤； BHK細(xì)胞；⑥CHO細(xì)胞；⑦M(jìn)DCK細(xì)胞；⑧H印-G2細(xì)胞；⑨Tn5細(xì)胞；⑩SF9 Cell細(xì)胞。其中，本發(fā)明制備Triple VLP細(xì)胞培養(yǎng)方法包括如下步驟在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入濃度為2-100μ g/mL的糖胺聚糖，優(yōu)選 ομ g/mL ；其中，所指糖胺聚糖為硫酸肝素、硫酸軟骨素B、硫酸透明質(zhì)酸或肝素，優(yōu)選硫酸肝素或硫酸軟骨素B。其中，本發(fā)明制備Triple VLP時(shí)的純化方法包括如下步驟①蔗糖梯度離心法，所述蔗糖梯度離心法選用最佳蔗糖濃度為1.37g/mL;②柱層析純化方法，用Sepharose6FFTM分子篩并進(jìn)行DEAE-S印haroseFFTM離子交換。其中，蔗糖梯度離心的步驟為①收集規(guī)?；a(chǎn)的Triple VLP細(xì)胞培養(yǎng)液， 40C 5000rmp離心lOmin，去除細(xì)胞及雜質(zhì)；②取上清液IOOOOOg 4°C離心濁，沉淀用HNE buffer 懸浮，HNE buffer 的組成為 25mM Tris-HCl pH7. 4，150mM NaCl,5mM EDTA ；③將懸液進(jìn)行蔗糖梯度離心，蔗糖采用HNEbufTer配制，體系采用0. 3g/mL蔗糖3mL ；0. 45g/mL蔗糖3mL ；1. 37g/mL蔗糖ImL ；4°C IOOOOOg離心池；④收集中間層，并用折射儀測(cè)量密度；⑤ 用pH6. 5-7. 5的PBS平衡kphar0Se6FFTM介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析純化，收集外水體積流穿峰； 雜蛋白去除可達(dá)95%以上；⑥采用DEAE-kpharoseFFTM介質(zhì)進(jìn)行離子交換層析，平衡液為ρΗ6· 5-7. 5、含有0. 05-0. 15Μ氯化鈉的PBS，洗脫液為含0. 2-0. 5Μ氯化鈉、ρΗ6. 5-7. 5的 PBS ；雜蛋白去除可達(dá)99%以上，純化后的Triple VLP原液為疫苗原液。本發(fā)明產(chǎn)品及方法中所述的百分含量均為質(zhì)量體積百分含量。本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒(PCV-2)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)三聯(lián)病毒樣顆粒疫苗(Triple VLP疫苗)。該VLP疫苗包含有PCV-2的主要結(jié)構(gòu)蛋白也是主要表面抗原CAP蛋白、PPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白也是主要表面抗原VP2蛋白的表位肽，PRRSV主要結(jié)構(gòu)蛋白也是主要表面抗原GP5蛋白的表位肽。該VLP疫苗可以激發(fā)良好雙重的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答。經(jīng)此形成的VLP蛋白抗原加入或不加入佐劑后制備的注射劑型、滴鼻劑型、飲水劑型免疫接種不同動(dòng)物群體后，可安全、有效預(yù)防PCV-2，PPV, PRRSV感染，為不同種群母豬、小豬、育肥豬安全、有效免疫防控PCV-2，PPV, PRRSV感染提供了理想疫苗。本發(fā)明進(jìn)行了藥效實(shí)驗(yàn)，分別通過(guò)注射、滴鼻、飲水等途徑免疫小豬與懷孕母豬產(chǎn)生好的體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答及天然免疫與獲得性免疫應(yīng)答以及黏膜免疫應(yīng)答效果，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)免疫損傷或由疫苗接種而導(dǎo)致的發(fā)病跡象，具有安全性。本發(fā)明Triple VLP疫苗免疫無(wú)PCV-2，PPV，PRRSV免疫背景的小豬、母豬與育肥豬兩次，進(jìn)一步通過(guò)PCV-2，PPV，PRRSV疫苗用毒株以及我國(guó)不同地區(qū)臨床分離的PCV-2，PPV, PRRSV野毒株攻毒，有95 %以上的免疫保護(hù)效果。用本發(fā)明Triple VLP疫苗接種不同地區(qū)、種群的母豬、小豬，0，21天免疫兩次， 分別采用注射、滴鼻、飲水劑型疫苗免疫，均顯示各地區(qū)、各種群母豬、小豬沒(méi)有出現(xiàn)由疫苗接種引發(fā)的發(fā)病現(xiàn)象，具有安全性。并能產(chǎn)生好的雙重免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)力，其保護(hù)率達(dá) 90%以上。由此表明研發(fā)的Triple VLP疫苗在含有或不含有佐劑的情況下，對(duì)不同地區(qū)、 種群的豬群都具有較好的免疫保護(hù)效果。下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明但不限于本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)例1 本發(fā)明Triple VLP疫苗檢定實(shí)驗(yàn)本發(fā)明實(shí)施例8制備的Triple VLP疫苗注射劑、滴鼻劑、飲水劑型外觀(guān)見(jiàn)均一，無(wú)異味和染菌；通過(guò)豚鼠、家兔試驗(yàn)無(wú)熱原、異常毒性和急性毒性反應(yīng)；通過(guò)3日齡乳鼠腦內(nèi)接種，以及3日齡小豬頸部肌肉注射試驗(yàn)無(wú)發(fā)病現(xiàn)象；通過(guò)Lorry法測(cè)定蛋白含量均在劑量范圍；通過(guò)電鏡觀(guān)察VLP直徑約17nm，與天然病毒一致；ELISA測(cè)定DNA含量均在50EU以下；通過(guò)SDS-PAGE和WB檢測(cè)抗原蛋白成分存在；通過(guò)免疫Balb/C小鼠1次血清中和抗體效價(jià)在3200以上。實(shí)驗(yàn)例2 本發(fā)明Triple VLP疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)豬體內(nèi)的免疫應(yīng)答效果實(shí)驗(yàn)本發(fā)明實(shí)施例8制備的Triple VLP疫苗加入或不加入相應(yīng)佐劑制備的注射、滴鼻、飲水疫苗劑型，并用PBS、鋁鹽、納米鋁、rLT、為對(duì)照組，分別按各自途徑免疫3日齡小豬，以及后備母豬其免疫劑量按實(shí)施例8疫苗低劑量組，免疫兩次(0，21天)；末次免疫后 14天采集各組小豬及母豬的外周血、分離血清和免疫細(xì)胞，采集脾淋巴細(xì)胞、肺和鼻腔灌洗液；通過(guò)ELISA法測(cè)定血清抗體效價(jià)在6400以上，采用MTT法測(cè)定中和抗體效價(jià)在3200以上，采用流失細(xì)胞儀、ELISP0T儀測(cè)定免疫細(xì)胞與血清重要細(xì)胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等動(dòng)態(tài)變化使得TH2/Thl應(yīng)答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗體效價(jià)在160以上。結(jié)果顯示，本發(fā)明Triple VLP疫苗不管是加入佐劑與沒(méi)有佐劑均都能產(chǎn)生滿(mǎn)意的雙重免疫應(yīng)答，且試驗(yàn)組有佐劑組好于無(wú)佐劑組、高劑量好于低劑量組免疫應(yīng)答效果，而對(duì)照組沒(méi)有產(chǎn)生雙重免疫應(yīng)答；制備的Triple VLP疫苗不管是注射還是滴鼻、飲水劑型均都能產(chǎn)生滿(mǎn)意的雙重免疫應(yīng)答，且注射劑型血清抗體效價(jià)高于滴鼻、 飲水劑型，滴鼻、飲水劑型黏膜和細(xì)胞免疫效應(yīng)好于注射劑型。實(shí)驗(yàn)例3 本發(fā)明Triple VLP疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)豬體內(nèi)的免疫保護(hù)效果實(shí)驗(yàn)本發(fā)明實(shí)施例8制備的Triple VLP疫苗加入或不加入相應(yīng)佐劑制備的注射、滴鼻、飲水劑型為實(shí)驗(yàn)組，并用PBS、鋁鹽、納米鋁、rLT、及PCV-2，PPV, PRRSV甲醛滅活病毒為對(duì)照組，分別按各自途徑免疫3日齡小豬、后備母豬，其免疫劑量按實(shí)施例8疫苗低劑量組，免疫兩次(0，21天)，末次免疫后14天各試驗(yàn)組、對(duì)照組實(shí)驗(yàn)豬用IO5 tlTCID5ci臨床分離 PCV-2，PPV，PRRSV毒株分別頸部肌肉注射攻毒觀(guān)察保護(hù)效果。結(jié)果顯示，本發(fā)明Triple VLP 疫苗均都能產(chǎn)生高水平的保護(hù)效果，免疫保護(hù)率在90%以上，而對(duì)照組PCV-2，PPV, PRRSV 甲醛滅活病毒疫苗保護(hù)率達(dá)60%、其他各對(duì)照組保護(hù)率達(dá)為0%。由此制備的Triple VLP 疫苗在小豬和母豬體內(nèi)具有高效的免疫保護(hù)效果。實(shí)驗(yàn)例4 本發(fā)明Triple VLP疫苗對(duì)懷孕母豬的免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)效果實(shí)驗(yàn)本發(fā)明實(shí)施例8制備的Triple VLP疫苗加入或不加入相應(yīng)佐劑制備的注射、滴鼻、飲水劑型，并用PBS、鋁鹽、納米鋁、rLT和PCV-2，PPV, PRRSV甲醛滅活病毒疫苗為對(duì)照組，分別按各自途徑免疫懷孕60天母豬，其免疫劑量按實(shí)施例8疫苗高劑量組，免疫兩次 (0，21天)；末次免疫后14天采集各組母豬的外周血、分離血清和免疫細(xì)胞。一部分母豬處死后采集脾淋巴細(xì)胞、肺和鼻腔灌洗液；通過(guò)ELISA法測(cè)定血清抗體效價(jià)在12800以上， 采用MTT法測(cè)定中和抗體效價(jià)在6400以上，采用流失細(xì)胞儀、ELISP0T儀測(cè)定免疫細(xì)胞與血清重要細(xì)胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等動(dòng)態(tài)變化使得TH2/ Thl應(yīng)答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗體效價(jià)在200以上。另一部分母豬繼續(xù)飼養(yǎng)，當(dāng)母豬分娩后觀(guān)察沒(méi)有早產(chǎn)、流產(chǎn)、弱仔情況。結(jié)果顯示，本發(fā)明Triple VLP疫苗不管是加入佐劑與沒(méi)有佐劑均都能產(chǎn)生滿(mǎn)意的雙重免疫應(yīng)答，且試驗(yàn)組有佐劑組好于無(wú)佐劑組、高劑量高于低劑量組免疫應(yīng)答效果，而對(duì)照組沒(méi)有產(chǎn)生雙重免疫應(yīng)答；本發(fā)明Triple VLP疫苗不管是注射還是滴鼻、飲水劑型均都能產(chǎn)生滿(mǎn)意的雙重免疫應(yīng)答，且注射劑血清抗體效價(jià)高于滴鼻、飲水劑型，滴鼻、飲水劑型黏膜和細(xì)胞免疫效應(yīng)好于注射劑型。由此制備的Triple VLP疫苗在懷孕母豬體內(nèi)具有好的免疫應(yīng)答效果。上述Triple VLP疫苗通過(guò)各自方法免疫配種前母豬，配種后21天進(jìn)行2次免疫， 在懷孕80天各試驗(yàn)組、對(duì)照組懷孕母豬用IO5 tlTCID5ci臨床分離PCV-2毒株分別頸部肌肉注射攻毒，待母豬自然生產(chǎn)后觀(guān)察保護(hù)效果。結(jié)果顯示，本發(fā)明Triple VLP疫苗均都能產(chǎn)生高水平的保護(hù)效果，免疫保護(hù)率在90%以上，而對(duì)照組PCV-2，PPV, PRRSV甲醛滅活病毒疫苗保護(hù)率達(dá)78%、其他各對(duì)照組保護(hù)率達(dá)為0%。由此制備的Triple VLP疫苗對(duì)懷孕母住具有高效的免疫保護(hù)效果。實(shí)驗(yàn)例5 本發(fā)明Triple VLP疫苗的安全性實(shí)驗(yàn)(1)無(wú)菌、支原體試驗(yàn)將實(shí)施例8制備的Triple VLP疫苗接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)14d，并以無(wú)菌生理鹽水做陰性對(duì)照，培養(yǎng)溫度為25°C、35°C。結(jié)果顯示，Triple VLP疫苗都未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。將"Triple VLP疫苗用半流體和肉湯培養(yǎng)基，37°C初代培養(yǎng)21天，次代培養(yǎng)21天，無(wú)菌生理鹽水做陰性對(duì)照，結(jié)果顯示Triple VLP疫苗無(wú)支原體生長(zhǎng)；用DNA染色法將毒種接種Vero細(xì)胞培養(yǎng)3天，傳代一次，用二苯甲酰胺熒光染料染色。結(jié)果顯示Triple VLP疫苗無(wú)支原體生長(zhǎng)。(2)溶血性試驗(yàn)選取體重為350g左右的豚鼠，采集新鮮豚鼠血1ml，用PBS洗滌 3次，再將血細(xì)胞體積恢復(fù)并稀釋10倍。PBS稀釋Triple VLP疫苗(由實(shí)施例8制備)，分別為2倍、4倍、8倍，將豚鼠血細(xì)胞加入到稀釋的待檢佐劑中，8小時(shí)后，評(píng)價(jià)血球溶解以目測(cè)或者上清濃度檢測(cè)為準(zhǔn)，并在570nm處檢測(cè)吸光度。結(jié)果顯示，沒(méi)有發(fā)生血球破裂，無(wú)溶血現(xiàn)象。說(shuō)明Triple VLP疫苗中的成分不能使紅細(xì)胞裂解。因此，Triple VLP疫苗無(wú)溶血反應(yīng)。(3)急性毒性試驗(yàn)取實(shí)施例8制備的Triple VLP疫苗0. 5ml腹腔注射體重為 12 18g Balb/C小鼠，每組10只，同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組，連續(xù)2周觀(guān)察小鼠的活動(dòng)狀態(tài)、 體重變化和存活率。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)小鼠全部存活，沒(méi)有出現(xiàn)豎毛、精神萎靡、行動(dòng)遲緩等不良癥狀，而體重呈現(xiàn)增加，由此證明Triple VLP疫苗在試驗(yàn)的濃度下對(duì)動(dòng)物是安全的，且 14天后處死進(jìn)行大體解剖檢查，未見(jiàn)臟器有病理改變。在體重為8 IOkg的Beagle狗體內(nèi)的急性毒性結(jié)果取實(shí)施例8制備的Triple VLP疫苗肌肉注射15mL，每組10只，同時(shí)設(shè) PBS陰性對(duì)照組，連續(xù)2周觀(guān)察行為、體重和存活率變化。結(jié)果可見(jiàn)，Beagle狗未見(jiàn)毒性反應(yīng)，行為正常，沒(méi)有死亡，與對(duì)照組狗比較無(wú)差異，各狗體重有所增加，并處死大體解剖未見(jiàn)臟器有明顯的病理改變。因此，Triple VLP疫苗無(wú)急性毒性反應(yīng)，使用是安全的。(4)過(guò)敏試驗(yàn)研究取實(shí)施例8制備的Triple VLP疫苗皮下接種體重為250 350g Hartley豚鼠，每個(gè)樣品接種豚鼠5只，每只接種0.5ml，隔日一次，共3次。第3次注射后21天，耳靜脈分別給予相同Triple VLP疫苗0. 5ml，并用人血白蛋白和生理鹽水以同樣的方法分別接種3只豚鼠作為陽(yáng)性、陰性對(duì)照。注射后30分鐘及3天觀(guān)察動(dòng)物，陽(yáng)性、陰性對(duì)照均成立，Triple VLP疫苗組豚鼠無(wú)死亡，且無(wú)鼻癢、噴嚏、煩躁不安、呼吸困難、休克、 痙攣等過(guò)敏癥狀。因此，Triple VLP疫苗在動(dòng)物體內(nèi)無(wú)過(guò)敏反應(yīng)。(5)兔熱源質(zhì)試驗(yàn)取預(yù)檢合格的體重為2 3kg家兔3只固定，30分鐘后測(cè)量體溫，共測(cè)2次，間隔30分鐘，要求2次溫差不大于0. 2 °C，各家兔2次平均溫度在 38. 6-39. 5°C。將實(shí)施例8制備的Triple VLP疫苗預(yù)熱至38°C，于第2次測(cè)溫后15分鐘內(nèi)，自家兔耳邊靜脈分別緩緩注入0. 5ml/只。注射后每隔30分鐘測(cè)量體溫1次，連測(cè)6 次。結(jié)果顯示Triple VLP疫苗給予家兔個(gè)體升溫均未超過(guò)0.2°C，3只家兔升溫總和未超過(guò)0.4°C，沒(méi)有引起家兔的發(fā)熱反應(yīng)。因此，制備的Triple VLP疫苗無(wú)熱源質(zhì)。(6)免疫病理?yè)p傷試驗(yàn)由實(shí)施例8制備的Triple VLP疫苗通過(guò)小豬、母豬、種豬及育肥豬外周血抗體亞型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞及氣管、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，Triple VLP疫苗免疫接種在實(shí)驗(yàn)乳豬、 母豬、種豬及育肥豬體內(nèi)Th2/Thl免疫應(yīng)答趨于平衡，沒(méi)有免疫器官損傷的跡象，因此具有安全性。實(shí)驗(yàn)例6 本發(fā)明Triple VLP疫苗穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)由實(shí)施例8制備的"Triple VLP疫苗，分別置于2_8°C、室溫O0_25°C )、37°C環(huán)境， 分別放置1周、2周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月和M個(gè)月，取樣觀(guān)察外觀(guān)、測(cè)pH 值；無(wú)菌、電鏡觀(guān)察粒徑；免疫動(dòng)物觀(guān)察安全性。結(jié)果顯示Triple VLP疫苗放置2-8°C下 M個(gè)月內(nèi)均無(wú)變色分層等現(xiàn)象，PH值在7. 0-7. 2之間無(wú)變化，電鏡觀(guān)察粒徑大小保持一致， 且注射或滴鼻給小鼠或?qū)嶒?yàn)豬表現(xiàn)正常；Triple VLP疫苗放置室溫25°C下3個(gè)月內(nèi)均有好的穩(wěn)定性；Triple VLP疫苗放置室溫37°C下1個(gè)月內(nèi)均有好的穩(wěn)定性效果。由結(jié)果說(shuō)明， Triple VLP疫苗放置2_8°C理化性質(zhì)、生物學(xué)性能穩(wěn)定，有效期至少M(fèi)個(gè)月。下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例所述的效果。實(shí)施例1 本發(fā)明Triple VLP三聯(lián)疫苗的基因及蛋白構(gòu)成以來(lái)自①PCV-2a的HR、HB0603、HB0604、BJ0602、SZ亞型的CAP蛋白，以及來(lái)自 PCV-2b 的 BJ-HB、GD、⑶-TS、BJ0401、BJ0402 亞型的 CAP 蛋白，以及來(lái)自 PCV_2d 的 GS04、SD、 TJ、TJ06 亞型的 CAP 蛋白，以及來(lái)自 PCV-2e 的 GX0602、JX0602、HB0602、LN06、HN0601 亞型的CAP蛋白的核酸與蛋白序列。②來(lái)自PPV的NADL-2、Kresse、P0VG、Challenge、VRI-l亞型VP2蛋白1-57核酸序列與1-19位氨基酸序列。③來(lái)自PRRSV CH-la, BJ-4、HB-I (SH)、 Em2007、JXAl亞型GP5蛋白的88-156核酸序列與30-52氨基酸序列見(jiàn)表所示。實(shí)施例2.本發(fā)明Triple VLP疫苗的表達(dá)載體構(gòu)建以構(gòu)建重組pHWD2000表達(dá)載體為例利用PCR的方法擴(kuò)增PCV-2 CAP蛋白基因片段、PPV VP2蛋白表位肽基因片段、PRRSV GP5蛋白表位基因片段插入到pHWD2000載體中， 構(gòu)成重組PHWD2000-CA-印itope (VP2) -epitope (GP5)表達(dá)載體，并包含BsmB I酶切位點(diǎn)。實(shí)施例3.細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞批庫(kù)建立以UMNSAH/DF-1細(xì)胞培養(yǎng)并建庫(kù)為例UMNSAH/DF_1細(xì)胞來(lái)源于American Type Culture Collection(ATCC)。培養(yǎng)基采用 Dulbecco' s modified Eagle medium(DMEM)， 添加青霉素及鏈霉素，不加或加入一定量胎牛血清(10-2% )在細(xì)胞工廠(chǎng)或細(xì)胞發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)，建立細(xì)胞工作種子批庫(kù)，并對(duì)傳代后的外源因子、致瘤性及穩(wěn)定性等全面檢定，細(xì)胞使用代數(shù)控制在60代以?xún)?nèi)，均符合疫苗生產(chǎn)介質(zhì)的要求。所述細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞批庫(kù)建立包括但不限于①UMNSAH/DF-1細(xì)胞；②PK-15細(xì)胞；③VERO細(xì)胞；④COS細(xì)胞；⑤人二倍體細(xì)胞；⑥BHK細(xì)胞；⑦CHO細(xì)胞；⑧MDCK細(xì)胞； ⑨H印-G2細(xì)胞。實(shí)施例4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞系篩選與建庫(kù)Triple VLP疫苗選用實(shí)施例3細(xì)胞庫(kù)中UMNSAH/DF-1細(xì)胞，采用脂質(zhì)體法將實(shí)施例2構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染UMNSAH/DF-1細(xì)胞，并篩選穩(wěn)定高表達(dá)Triple VLP的細(xì)胞系，具體是①在；35讓孔中，加入 pHWD2000-CA-印 itope (VP2)-印 itope (GP5) 1. 5μ g ；②加入5 μ L OptiMEM配置的脂質(zhì)體，室溫孵育45min。然后加入到被OptiMEM潤(rùn)洗過(guò)的宿主細(xì)胞中，孵育證；③離心去除載體-脂質(zhì)體混合物，并向細(xì)胞中加入DMEM進(jìn)行培養(yǎng)；④pHWD2000-CA-e pitope(VP2)-epitope (GP5)重組載體在細(xì)胞系中表達(dá)，可自組裝Triple VLP ；⑤通過(guò)加壓篩選表達(dá)^Triple VLP的UMNSAH/DF-1細(xì)胞株。結(jié)果顯示，在UMNSAH/DF-1細(xì)胞10代內(nèi)篩選到穩(wěn)定高表達(dá)Triple VLP的細(xì)胞株，經(jīng)細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)與產(chǎn)量、VLP大小與結(jié)構(gòu)、外源因子與致瘤性、染色體完整性等傳代至40代沒(méi)有表型改變。由此，建立了穩(wěn)定高表達(dá)Triple VLP的UMNSAH/DF-1細(xì)胞系。進(jìn)一步建立具有Triple VLP的三級(jí)細(xì)胞種子批庫(kù)，經(jīng)對(duì)全面檢定符合疫苗生產(chǎn)要求，放置液氮中保存?zhèn)溆?。所述穩(wěn)定高表Triple VLP的細(xì)胞系包括但不限于①UMNSAH/DF-1細(xì)胞； ②H(-15細(xì)胞；③VERO細(xì)胞；④COS細(xì)胞；⑤人二倍體細(xì)胞；⑥BHK細(xì)胞；⑦CHO細(xì)胞； ⑧MDCK細(xì)胞；⑨H印-G2細(xì)胞。實(shí)施例5. Triple VLP規(guī)?；a(chǎn)以UMNSAH/DF-1細(xì)胞培養(yǎng)并規(guī)模化生產(chǎn)Triple VLP為例取穩(wěn)定表達(dá)Triple VLP 的UMNSAH/DF-1工作批庫(kù)細(xì)胞，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(不加入或加入10-2%胎牛血清、加入 10 μ g/mL的肝素)通過(guò)20L細(xì)胞工廠(chǎng)或加入微載體30L細(xì)胞發(fā)酵罐放大培養(yǎng)生產(chǎn)使得細(xì)胞密度達(dá)到1X107-8以上時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)Triple VLP疫苗原液。所述可規(guī)模化生產(chǎn)的Triple VLP細(xì)胞系包括但不限于①UMNSAH/DF-1細(xì)胞； ②H(-15細(xì)胞；③VERO細(xì)胞；④COS細(xì)胞；⑤人二倍體細(xì)胞；⑥BHK細(xì)胞；⑦CHO細(xì)胞； ⑧MDCK細(xì)胞；⑨H印-G2細(xì)胞。實(shí)施例6. Triple VLP疫苗的純化①收集規(guī)?；a(chǎn)的Triple VLP細(xì)胞培養(yǎng)液，4°C 5000rmp離心lOmin，去除細(xì)胞及雜質(zhì)；②取上清液IOOOOOg 4°C離心濁，沉淀用少量HNE buffer (25mM Tris-HCl pH 7. 4,150mM NaCl,5mM EDTA)懸浮。③將懸液進(jìn)行蔗糖梯度離心，蔗糖采用HNE buffer配制，體系采用 0. 3g/mL 蔗糖 3mL ；0. 45g/mL 蔗糖 3mL ；1. 37g/mL 蔗糖 ImL ；4 °C IOOOOOg 離心；④收集中間層，并用折射儀測(cè)量密度；⑤用PH6. 5-7. 5的PBS平衡kphar0Se6FFTM 介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析純化，收集外水體積流穿峰。雜蛋白去除可達(dá)95%以上；⑥采用 DEAE-SepharoseFFTM介質(zhì)進(jìn)行離子交換層析，平衡液為pH6. 5-7. 5、含有0. 05-0. 15M氯化鈉的PBS，洗脫液為含0. 2-0. 5M氯化鈉、pH6. 5-7. 5的PBS。雜蛋白去除可達(dá)99%以上，純化后的VLP原液為疫苗原液。實(shí)施例7. Triple VLP疫苗原液的檢定Triple VLP原液的外觀(guān)為澄清液體；pH值為7. 0-7. 2 ；通過(guò)血平板進(jìn)行雜菌鑒定結(jié)果為陰性；通過(guò)半流體和肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行支原體鑒定結(jié)果為陰性；通過(guò)PAGE-SDS電泳檢測(cè)結(jié)果顯示目的條帶清晰、無(wú)其他雜帶；采用Reed&Muench法計(jì)算抗血清中和效價(jià)均高于 1 2800。實(shí)施例8. Triple VLP疫苗劑型配制①注射劑型配制將純化Triple VLP不加佐劑，配制10 μ g/0. 5ml的低劑量、 20 μ g/1. Oml高劑量的無(wú)佐劑Triple VLP注射劑型；將純化Triple VLP蛋白加入氫氧化鋁或磷酸鋁配置7. 5 μ g(蛋白)/0. 5mg(鋁鹽)/0. 5ml低劑量、15 μ g(蛋白)/1. Omg(鋁鹽)/0. 5ml高劑量的有佐劑Triple VLP疫苗注射劑型；將純化Triple VLP蛋白加入納米鋁佐劑，分別配制5. 0 μ g/0. 5ml低劑量、10 μ g/1. Oml高劑量的有佐劑Triple VLP注射劑型。以上注射疫苗溶液裝入吸頂瓶，放2-8°C備用。②噴鼻劑型配制將純化Triple VLP不加佐劑吸附，配制7. 5 μ g/0. 2ml低劑量、 15 μ g/0. 2ml高劑量的無(wú)佐劑Triple VLP噴鼻劑型；將純化的Triple VLP加入等體積季胺化殼聚糖水凝膠黏膜佐劑與傳遞系統(tǒng)，配制5. 0 μ g/0. 2ml低劑量、10 μ g/0. 2ml高劑量的有佐劑Triple VLP噴鼻劑型；將純化Triple VLP蛋白加入等體積季胺化殼聚糖水凝膠與10 μ g rLT黏膜佐劑及傳遞系統(tǒng)，配制4. 0 μ g/0. 2ml低劑量、8 μ g/0. 2ml高劑量的有佐劑Triple VLP噴鼻劑型。以上噴鼻疫苗溶液裝入定量噴鼻裝置，放2_8°C備用。
③飲水劑型配制將純化Triple VLP 10 μ g、20 μ g分別加入5%蔗糖、0. 2%維生素C、0. 谷維素和0. 脫脂奶粉，用磷酸鹽緩沖液調(diào)PH7. 2，噴霧干燥，配制IOyg/劑低劑量、20 μ g/劑高劑量的無(wú)佐劑Triple VLP飲水劑型；將純化Triple VLP蛋白7. 5 μ g、 15yg%15yg rLT分別加入5%蔗糖、0. 2%維生素C、0. 谷維素和0. 脫脂奶粉，用磷酸鹽緩沖液調(diào)PH7. 2，噴霧干燥，配制7. 5 μ g/劑低劑量、15 μ g/劑高劑量的有佐劑Triple VLP飲水劑型；以上飲水劑型疫苗裝入密封塑料袋內(nèi)，放2-8°C備用。
權(quán)利要求
1.一種豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒三聯(lián)病毒樣顆粒疫苗，(簡(jiǎn)稱(chēng)Triple VLP疫苗)，其特征在于該疫苗含有2-型豬圓環(huán)病毒(PCV-2)主要結(jié)構(gòu)蛋白 CAP蛋白，豬細(xì)小病毒(PPV)結(jié)構(gòu)蛋白VP2的抗原表位，與B亞群豬繁殖與呼吸綜合癥病毒 (PRRSV)結(jié)構(gòu)蛋白GP5的抗原表位組成的VLP。
2.如權(quán)利要求1所述的TripleVLP疫苗，其特征在于該疫苗涉及PCV-2主要結(jié)構(gòu)蛋白 CAP蛋白，PPV結(jié)構(gòu)蛋白VP2的表位的1-57核酸序列，PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP5的表位的88-156 核酸序列；其中，所述CAP蛋白核酸序列包括來(lái)自PCV-2a的HR、HB0603、HB0604、BJ0602、 SZ亞型的CAP蛋白核酸序列，以及來(lái)自PCV-2b的BJ-HB、⑶、⑶-TS、BJ0401、BJ0402亞型的 CAP蛋白核酸序列，以及來(lái)自PCV-2d的GS04、SD、TJ、TJ06亞型的CAP蛋白核酸序列，以及來(lái)自PCV-2e的GX0602、JX0602、HB0602、LN06、HN0601亞型的CAP蛋白核酸序列；其中，所述 PPV VP2 蛋白的 1-57 核酸序列包括來(lái)自 PPV 的 NADL-2、Kresse、P0VG、Challenge、VRI_l 亞型VP2蛋白的1-57核酸序列；其中所述PRRSV GP5蛋白88-156核酸序列包括來(lái)自PRRSV 的 CH-la、BJ-4、HB-I (SH)、Em2007、JXAl 亞型 GP5 蛋白的 88-156 核酸序列。
3.如權(quán)利要求1-2任一所述的TripleVLP疫苗，其特征在于該疫苗含有涉及PCV-2的 CAP蛋白，并攜帶有PPV的VP2蛋白抗原表位、以及PRRSV的Gp5蛋白抗原表位，所述CAP蛋白包括來(lái)自PCV-加的HR、HB0603、HB0604、BJ0602、SZ、亞型的CAP蛋白，以及來(lái)自PCV-2b的 BJ-HB、GD、GD-TS、BJ0401、BJ0402、亞型的 CAP 蛋白，以及來(lái)自 PCV_2d 的 GS04、SD、TJ、TJ06 亞型的 CAP 蛋白，以及來(lái)自 PCV-2e 的 GX0602、JX0602、HB0602、LN06、HN0601 亞型的 CAP 蛋白；其中，所述PPV VP2蛋白的抗原表位包括來(lái)自PPV的NADL-2、Kresse、P0VG、Challenge、 VRI-I亞型VP2蛋白1-19位肽段；其中所述PRRSV GP5蛋白的抗原表位包括來(lái)自PRRSV CH-la、BJ-4、HB-I (SH)、Em2007、JXAl 亞型 GP5 蛋白的 30-52 位肽段。
4.如權(quán)利要求3所述的TripleVLP疫苗，其特征在于該疫苗包含一個(gè)攜帶有PCV-2CAP 蛋白、PPV VP2蛋白抗原表位、PRRSV GP5蛋白抗原表位的重組真核表達(dá)載體、雞成纖維細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞；其中，所述真核表達(dá)載體選自①PHWD2000 ；②p0PI3CAT ； ③pCAGGS ；④pcDNA6/TR ；⑤pCMV-HA。所述雞成纖維細(xì)胞選自①UMNSAH/DF-1細(xì)胞；②分離9-10齡禽成纖維細(xì)胞。所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自①PK-15細(xì)胞；②VERO細(xì)胞；③COS細(xì)胞；④人二倍體細(xì)胞；⑤BHK細(xì)胞；⑥CHO細(xì)胞；⑦M(jìn)DCK細(xì)胞；⑧H印-G2細(xì)胞；所述昆蟲(chóng)細(xì)胞選自①Tn5細(xì)胞；②SF9 Cell細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的TripleVLP疫苗，其特征在于其中所述的pHWD2000載體是由 PHW2000載體改造得到，包括去掉pHW2000載體上游的pCMV啟動(dòng)子，并用雞β -actin蛋白啟動(dòng)子替換，同時(shí)在雞β -actin蛋白啟動(dòng)字上游插入hCMV-IE增強(qiáng)子，改造后的pCWD2000 可以在真核系統(tǒng)中高效表達(dá)外源基因，同時(shí)PCWD2000有著較小的分子量，可以攜帶較大的外源基因片段。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述的TripleVLP疫苗，其特征在于該疫苗不含有佐劑，或含有如下佐劑中的一種或幾種①新型納米鋁佐劑；②鋁鹽氫氧化鋁或磷酸鋁；③水凝膠佐劑季胺化的殼聚糖、④rLT 重組不耐熱性腸毒素。其特征在于該疫苗制成多種臨床適用的劑型注射劑型、滴鼻劑型、飲水劑型。
7.如權(quán)利要求6所述的TripleVLP疫苗的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟①構(gòu)建pHWD2000真核表達(dá)載體；②含有編碼CAP-印itope (VP》-印itope (GPQ的串聯(lián)表達(dá)載體，并包含BsmB I酶切位點(diǎn)；③提供一種用于表達(dá)的細(xì)胞系，經(jīng)轉(zhuǎn)染后可以釋放 Triple VLP;④提供用于純化Triple VLP的方法，方法包括蔗糖梯度離心純化方法以及柱層析純化方法。
8.如權(quán)利要求7所述的TripleVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中所述的表達(dá)宿主細(xì)胞系中所指細(xì)胞為雞成纖維細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述雞成纖維細(xì)胞選自①UMNSAH/ DF-I細(xì)胞；②分離9-10齡禽成纖維細(xì)胞；所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自①H(-15細(xì)胞 ’②VERO 細(xì)胞 ’③COS細(xì)胞；④人二倍體細(xì)胞；⑤BHK細(xì)胞；⑥CHO細(xì)胞；⑦M(jìn)DCK細(xì)胞；⑧Hep_G2細(xì)胞；所述昆蟲(chóng)細(xì)胞選自①Tn5細(xì)胞；②SF9 Cell細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求7所述的TripleVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中細(xì)胞培養(yǎng)方法包括如下步驟在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入濃度為2-100 μ g/mL的糖胺聚糖；其中，所指糖胺聚糖為硫酸肝素、硫酸軟骨素B、硫酸透明質(zhì)酸或肝素。
10.如權(quán)利要求9所述的TripleVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中所述的蔗糖梯度離心的步驟為①收集規(guī)?；a(chǎn)的Triple VLP細(xì)胞培養(yǎng)液，4°C 5000rmp離心lOmin， 去除細(xì)胞及雜質(zhì)；②取上清液IOOOOOg 4°C離心濁，沉淀用HNE buffer懸浮，HNE buffer 的組成為25mM Tris-HCl pH 7. 4,150mMNaCl, 5mM EDTA ；③將懸液進(jìn)行蔗糖梯度離心，蔗糖采用HNE buffer配制，體系采用0. 3g/mL蔗糖3mL ；0. 45g/mL蔗糖3mL ；1. 37g/mL蔗糖 ImL ；4°C IOOOOOg離心2h ；④收集中間層，并用折射儀測(cè)量密度；⑤用ρΗ6· 5-7. 5的PBS平衡kphar0Se6FFTM介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析純化，收集外水體積流穿峰；雜蛋白去除可達(dá)95% 以上；⑥采用DEAE-kpharoseFFTM介質(zhì)進(jìn)行離子交換層析，平衡液為pH6. 5-7. 5、含有 0. 05-0. 15M氯化鈉的PBS，洗脫液為含0. 2-0. 5M氯化鈉、pH6. 5-7. 5的PBS ；雜蛋白去除可達(dá)99%以上，純化后的VLP原液為疫苗原液。
全文摘要
本發(fā)明目的在于公開(kāi)一種豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒三聯(lián)病毒樣顆粒疫苗及其制備方法。本發(fā)明所述的三聯(lián)病毒樣顆粒疫苗(Triple VLP疫苗)含有PCV-2的主要結(jié)構(gòu)蛋白CAP蛋白、PPV VP2蛋白抗原表位、以及PRRSV Gp5蛋白抗原表位組成的VLP。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，該疫苗可以激發(fā)良好的雙重的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答。藥效試驗(yàn)表明，經(jīng)此形成的VLP抗原加入或不加佐劑，制備的注射劑型、滴鼻劑型、飲水劑型免疫不同動(dòng)物群體后，可安全、有效的防治PCV-2、PPV、PRRSV感染，為不同種群的母豬、小豬、育肥豬安全、有效免疫防控PCV-2、PPV、PRRSV混合感染提供了理想的疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/23GK102488895SQ20111045201
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者呂鳳林, 曹政, 潘玉竹 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)