專利名稱：一種防治自身免疫疾病的黃杞提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥制藥領(lǐng)域，涉及黃杞提取物的醫(yī)藥用途，確切說是涉及黃杞提取物的制備工藝及其作為免疫抑制藥物的用途，用于防治自身免疫疾病。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)是機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答和免疫功能的組織系統(tǒng)，由免疫器官和組織、免疫細(xì)胞和免疫分子組成。免疫系統(tǒng)是機(jī)體防衛(wèi)病原體入侵最有效的武器，它能發(fā)現(xiàn)并清除異物、外來病原微生物等引起內(nèi)環(huán)境波動的因素。免疫系統(tǒng)功能降低時會發(fā)生免疫不全疾病，導(dǎo)致病菌的重復(fù)感染而危及個體的生存。相反地，原本是針對外來的抗原或體內(nèi)不正常的細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)進(jìn)行攻擊與清除的免疫生理機(jī)制，在一些情形下，可能會對自身正常細(xì)胞、組織發(fā)生免疫反應(yīng)，造成不正常的過度發(fā)炎或是組織、器官傷害，進(jìn)而影響身體健康造成疾病。常見的自身免疫疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)、多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis, MS)、I 型糖尿病(Type IDiabetes mellitus,T 1DM/Insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM)、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡(System LupusErythematosus, SLE)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto ' s Thyroiditis, HT)、普通牛皮癖(Psoriasis Vulgaris, PV)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary Biliary Cirrhosis, PBC)、自身免疫性肝炎(Autoimmune Hepatitis, AH)、Wegner 肉芽腫病(Wegner’s Granulomatosis,WG)、重癥肌無力(Myasthenia Gravis, MG)等。自身免疫系統(tǒng)疾病的形成是一個非常復(fù)雜的過程，但許多實驗證據(jù)表明自身反應(yīng)性T細(xì)胞直接參與自身免疫疾病的發(fā)生。例如，多種器官特異性自身免疫病都是由T細(xì)胞介導(dǎo)的，如T1DM、Hashimoto' s thyroiditis、MS等。即使在抗體介導(dǎo)的自身免疫病中，B細(xì)胞的活化也依賴于Th細(xì)胞的輔助。自身免疫疾病與組織局部T細(xì)胞浸潤直接相關(guān)，例如早期活動期典型胰島炎癥病變局部可檢出大量CD4T、CD8T細(xì)胞浸潤，存活胰島細(xì)胞表面常異常表達(dá)MHC II類分子，局部尚有大量Μφ細(xì)胞浸潤，這些變化都后繼于局部T細(xì)胞釋放的各種淋巴因子的作用。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者炎癥滑膜局部的浸潤細(xì)胞中除了激活的B細(xì)胞、漿細(xì)胞外，尚有CD4T細(xì)胞。慢性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)者局部、多發(fā)性硬化癥患者腦脊液及血液中、重癥肌無力患者血液中、牛皮癬皮損局部等均能查見自身抗原特異性的T細(xì)胞。自身反應(yīng)性T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞可識別與攻擊帶有特異自身抗原的靶細(xì)胞。CD4T細(xì)胞識別自身抗原后可釋放多種多樣的具有不同效應(yīng)功能的淋巴因子，從而輔助體液(抗體生成)免疫或介導(dǎo)細(xì)胞免疫。CD8T細(xì)胞能夠識別、殺傷和裂解帶有相應(yīng)MHC I類抗原-特異抗原肽復(fù)合物的靶細(xì)胞。T細(xì)胞分化為Thl細(xì)胞，產(chǎn)生干擾素，加速Μφ活化，Th2細(xì)胞則產(chǎn)生IL-4等細(xì)胞因子參與和調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)。很多自身免疫性疾病，如RA、MS、TlDM等均存在Thl/Th2失衡，并通過Thl細(xì)胞免疫反應(yīng)造成組織損傷。此外，Thl細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子對某些自身免疫病的發(fā)病有重要作用。例如，RA是一種主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，T細(xì)胞受體與HLAII類抗原HLA-DR4/DR1提呈的抗原肽或超抗原結(jié)合，激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞,引起對自身抗原的免疫反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞因子 的釋放及其他免疫細(xì)胞的活化，免疫球蛋白、趨化因子、氧自由基及白三烯等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生增多，進(jìn)而引起血管炎、滑膜增生、軟骨及骨破壞等RA的特征性病理變化。T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病缺少特異的選擇性抑制劑。以臨床上常用的環(huán)孢素A為例，由于其對于不同狀態(tài)的T細(xì)胞(活化和非活化的)以及T細(xì)胞介導(dǎo)的所有相關(guān)免疫反應(yīng)的抑制作用無選擇性，T細(xì)胞所擔(dān)負(fù)的機(jī)體正常免疫功能也受到影響，在長期使用環(huán)孢素A的病人身上，?？捎^察到藥物對腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)的毒性，且發(fā)生感染性疾病和腫瘤的風(fēng)險增高。對于免疫性疾病的防治來說，選擇性免疫調(diào)控是真正有效且可行的途徑，即抑制引起免疫疾病的過剩應(yīng)答而不影響正常的免疫功能。目前防治自身免疫疾病多為化學(xué)藥物，且均不具備免疫抑制選擇性，因此有必要開發(fā)出具備免疫抑制選擇性的防治自身免疫疾病的有效藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于從中藥中制備具有免疫抑制選擇性的、低副作用的防治自身免疫疾病的藥物。更為具體的，本發(fā)明提供一種從中藥黃杞中制備的提取物，該提取物具有選擇性的免疫·抑制活性，可以應(yīng)用于T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病的防治。中藥黃杞(Engelhardtia roxburghiana),又名黃櫸、土厚樸，胡桃科植物，分布于福建、臺灣、湖南、廣東、海南、廣西、四川、貴州、云南等地。黃杞以莖皮、葉入藥，黃杞葉具有清熱、止痛的功效。本發(fā)明提供的黃杞提取物由黃杞葉中經(jīng)提取、大孔樹脂純化制得。具體過程為:黃杞葉通過低級醇或含水低級醇提取(低級醇的碳數(shù)為C1-C4，濃度為X，0 < X < 100%，優(yōu)選為60 80% )、過濾、提取液濃縮至無醇味，經(jīng)大孔吸附樹脂吸附，水及含水低級醇除雜(低級醇碳數(shù)為C1-C4，濃度為X，0彡X彡30%，優(yōu)選為10彡X彡20% )，含水低級醇洗脫(低級醇碳數(shù)為C1-C4，濃度為X，40彡X彡95%，優(yōu)選為40彡X彡70% );洗脫液減壓濃縮、干燥后制得。黃杞提取物具有選擇性抑制活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的作用，可通過遲發(fā)型超敏反應(yīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞模型加以證實。IV型或遲發(fā)型超敏反應(yīng)(Delayed TypeHypersensitivity, DTH)是由特異性致敏效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的一種類型,包括三個連續(xù)的過程:識別相(cognitive phase),⑶4+T和某些⑶8+Τ細(xì)胞識別存在于抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面上的外來蛋白質(zhì)抗原；激活相(activation phase), T細(xì)胞被APCs激活后細(xì)胞分泌細(xì)胞因子并增殖，通過分泌細(xì)胞因子介導(dǎo)DTH反應(yīng)的發(fā)生；效應(yīng)相(effectorphase)，包括形成炎癥和消退兩步。炎癥指的是血管內(nèi)皮細(xì)胞被細(xì)胞因子激活，血管中的白細(xì)胞聚集于抗原進(jìn)入的局部組織中。消退是由于抗原被細(xì)胞因子活化的Μφ所消除，由于自身抗原的持續(xù)存在，T細(xì)胞被持續(xù)激活，造成炎癥無法消退，引發(fā)各種自身免疫疾病。體外實驗證實，本發(fā)明的黃杞提取物具有誘導(dǎo)從小鼠中分離的被遲發(fā)型超敏反應(yīng)活化的T細(xì)胞凋亡的作用，并且選擇性的抑制被激活的T細(xì)胞。另外，動物實驗表明，本發(fā)明的黃杞提取物對自身免疫疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有防治作用。本發(fā)明制備的黃杞提取物對于防治自身免疫疾病尤其是由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病有積極意義。
具體實施例方式通過以下實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但應(yīng)注意本發(fā)明的范圍并不受這些實施例的任何限制。實施例1I公斤黃杞葉藥材，以70%乙醇回流提取3次，每次2小時，溶劑倍量(V/W)分別為10、8和7，合并提取液，濃縮至無醇味。吸附于AB-8大孔吸附樹脂，以水及20%乙醇洗去雜質(zhì)，再以50%乙醇洗脫，濃縮洗脫液至稠浸膏，減壓干燥得到黃杞提取物，液相檢測總黃酮含量約不低于20%。實施例22公斤黃杞葉藥材，以60%乙醇回流提取3次，每次2小時，溶劑倍量(V/W)分別為12、10和8，合并提取液，濃縮至無醇味，吸附于NKA9大孔吸附樹脂，以水及10%乙醇洗去雜質(zhì)，再以40%乙醇洗脫，濃縮洗脫液至稠浸膏，減壓干燥得到黃杞提取物，液相檢測總黃酮含量約不低于20%。實施例35公斤黃杞葉藥材，以80%乙醇回流提取3次，每次2小時，溶劑倍量(V/W)分別為10、10和8，合并提取液，濃縮至無醇味，吸附于HPD400大孔吸附樹脂，以水及30%乙醇洗去雜質(zhì)，再以60 %乙醇洗脫，濃縮洗脫液至稠浸膏，減壓干燥得到黃杞提取物，液相檢測總黃酮含量約不低于20%。實施例410公斤黃杞葉藥材，以水回流提取2次，每次2小時，總?cè)軇┝繛?00L，合并提取液，濃縮至相當(dāng)于Ig藥材/mL的濃縮液，吸附于HPD100大孔吸附樹脂，以水洗去雜質(zhì)，再以70 %乙醇洗脫，濃縮洗脫液至稠浸膏，減壓干燥得到黃杞提取物，液相檢測總黃酮含量約不低于20%。實施例510公斤黃杞葉藥材，以乙醇回流提取3次，每次2小時，每次溶劑量分別為100L，合并提取液，濃縮至稠膏，再以水復(fù)溶，吸附于DlOl大孔吸附樹脂，以水洗去雜質(zhì)，再以95%乙醇洗脫，濃縮洗脫液至稠浸膏，減壓干燥得到黃杞提取物，液相檢測總黃酮含量約不低于20%。實施例6延遲型超敏反應(yīng)誘導(dǎo)肝臟損傷小鼠模型及T細(xì)胞凋亡分析將6-8周齡BALB/c小鼠(雄性及雌性，25+2g)。通過以5天的間隔在其腹部皮膚多次涂抹0.1mol 1 %的苦基氯乙醇溶液致敏2次。第二次致敏后5天，從每只小鼠中收集血樣，然后將小鼠注射以IOyl 0.2%的苦基氯橄欖油用于誘導(dǎo)損傷。誘導(dǎo)后0、6、12、18及24小時后，收集血樣，并分離肝細(xì)胞及非附著的肝非實質(zhì)細(xì)胞。血樣用于測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性。將非附著的肝非實質(zhì)細(xì)胞與抗-小鼠LFA-1 (淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1)抗體反應(yīng)，將肝細(xì)胞與抗小鼠ICAM-1 (細(xì)胞間粘附分子-1)抗體反應(yīng)。PBS沖洗后，將這些細(xì)胞與FITC-標(biāo)記的羊抗-大鼠IgG反應(yīng)。之后用PBS沖洗細(xì)胞并再次懸浮測定細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。根據(jù)測定結(jié)果，非附著的肝非實質(zhì)細(xì)胞含有70%以上LFA-1陽性細(xì)胞，其中包括⑶4+與⑶8+T細(xì)胞的比例接近2: 1，因此非附著的肝非實質(zhì)細(xì)胞主要為T淋巴細(xì)胞群。將肝細(xì)胞與非附著的非實質(zhì)細(xì)胞或從正常小鼠及肝臟損傷小鼠分離的脾細(xì)胞共培養(yǎng)，分析上清液中ALT的釋放。LFA-1在脾細(xì)胞上的表達(dá)在誘導(dǎo)肝臟損傷5小時后達(dá)到峰值。與此相比，非實質(zhì)細(xì)胞上LFA-1的表達(dá)和肝細(xì)胞上ICAM-1的表達(dá)在誘導(dǎo)肝臟損傷后10小時達(dá)到峰值，血清ALT活性在16小時后達(dá)到峰值，證實此肝臟損傷由于免疫應(yīng)答而出現(xiàn)。在誘導(dǎo)肝臟損傷后6小時有輕度炎癥浸入，10小時后有顯著的炎癥浸入，16小時后有大量肝細(xì)胞壞死。故證實此肝損傷由于免疫應(yīng)答而出現(xiàn)。從正常小鼠和誘導(dǎo)10小時后肝臟損傷小鼠中分離非實質(zhì)細(xì)胞，用黃杞提取物處理細(xì)胞。孵育I小時后，裂解細(xì)胞，提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA片段分析，EB染色。結(jié)果表明，當(dāng)用黃杞提取物處理細(xì)胞時，在分離自肝臟損傷小鼠的非實質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn)DNA梯度帶型。從正常小鼠中分離的以這些藥物處理的非實質(zhì)細(xì)胞中，沒有DNA梯度帶型出現(xiàn)，即沒有觀察到正常小鼠非實質(zhì)細(xì)胞的凋亡。凋亡試驗結(jié)果證實，黃杞提取物選擇性抑制活化的免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡。實施例7II型膠原蛋白誘導(dǎo) 的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠模型及黃杞提取物對CIA的防治作用以0.2% (w/v)醋酸溶液溶解牛II型膠原蛋白，加入等量完全Freund氏佐劑制成乳劑。DBA/1J小鼠72只，隨機(jī)分為6組，每組12只。將上述制備的乳劑于小鼠尾根部皮內(nèi)多點注射(100μ I/只)，第21天再次同劑量追加免疫一次，建立CIA模型。各組小鼠于第二次增強(qiáng)免疫同時，造模成功后分別進(jìn)行如下處理，空白組:小鼠腹腔注射生理鹽水100 μ I/只；陽性對照組:鼠腹腔注射環(huán)孢素A5mg/kg ;黃杞提取物處理組，小鼠腹腔分別注射黃杞提取物(高劑量50mg/kg,中劑量25mg/kg,低劑量10mg/kg),每天注射I次,連續(xù)注射7天。觀測發(fā)病率和關(guān)節(jié)評分；二次增強(qiáng)免疫及腹腔注射藥物同時，隔日對小鼠發(fā)病率及關(guān)節(jié)腫脹程度進(jìn)行觀測。關(guān)節(jié)腫脹程度用臨床關(guān)節(jié)評分法表示:0無紅腫；I足趾關(guān)節(jié)紅腫；2趾關(guān)節(jié)、足跖均紅腫；3踝關(guān)節(jié)以下均紅腫。黃杞提取物對小鼠膠原蛋白誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用如下表所示:
權(quán)利要求
1.一種黃杞提取物，其特征在于該提取物中黃酮類成分的總含量不低于20%。
2.一種如權(quán)利要求1所述的黃杞提取物的制備方法，其特征在于包括如下步驟:以黃杞葉為提取原料；經(jīng)水、低級醇或含水低級醇提??；提取液經(jīng)大孔吸附樹脂吸附、水洗及含水低級醇洗除雜；含水低級醇洗脫；洗脫液濃縮干燥制得黃杞提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃杞提取物制備方法，其特征在于所述的提取過程使用的低級醇為碳數(shù)C1-C4的醇；濃度優(yōu)選為60% -80%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃杞提取物制備方法，其特征在于所述的大孔吸附樹脂為苯乙烯、二乙烯苯、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯中任意一種或幾種的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃杞提取物制備方法，其特征在于所述的除雜過程使用低級醇為碳數(shù)C1-C4的醇；濃度為0-30%，優(yōu)選為10% -20%。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃杞提取物制備方法，其特征在于所述的大孔吸附樹脂洗脫過程，使用的含水低級醇，其中低級醇為碳數(shù)為C1-C4的醇；濃度優(yōu)選為40% -70%。
7.權(quán)利要求1所述的黃杞提取物在制備防治自身免疫抑制疾病藥物中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的自身免疫疾病，其特征在于:包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、普通牛皮癬、多發(fā)性硬化癥、I型糖尿病、橋本氏甲狀腺炎或慢性淋巴性甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬化、 自身免疫性肝炎、Wegener肉芽腫病、重癥肌無力。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可應(yīng)用于自身免疫疾病防治的中藥提取物，該提取物從黃杞葉中經(jīng)提取、大孔樹脂純化制備，可用于防治自身免疫疾病，尤其是防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病。
文檔編號A61K36/52GK103181952SQ201110460050
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者單淇, 于冰, 侯文彬, 張新鑫, 周福軍, 華潔 申請人:天津藥物研究院