專利名稱：一種預測多發(fā)性硬化癥接受治療者的治療反應的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于預測多發(fā)性硬化癥(MS)接受治療者的治療反應的方法，尤其涉及根據(jù)差別化表達的遺傳標記物預測MS受治療者對于IFN-P治療反應的方法。
背景技術：
多發(fā)性硬化(MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種炎性疾病。全基因組關聯(lián)分析(Genome-Wide Association Study)已證實了免疫系統(tǒng)基因與MS疾病易感性相關,該結論與MS發(fā)病機理中免疫機制的作用吻合。業(yè)已證實I型干擾素(IFN)生物利用率的增強與各種自身免疫疾病的易感性或嚴重性相關。業(yè)已在大約50%未治療的MS受治療者體內檢測到I型IFN-調控基因(IRGs)的增強表達，并且，這一現(xiàn)象曾被解釋為一類先天性免疫增強的受治療者的特征。I和II型IFNs調控重疊類型的IRGs。盡管I型IFN是先天性免疫的主要介體，而II型IFN同時參與了先天性和獲得性免疫。盡管用IFN-Y作為MS的治療劑的臨床試驗沒有取得成功，但是I型IFN的臨床試驗仍在繼續(xù)，并且若干重組干擾素-P (IFN-^ )產(chǎn)品已被批準用于MS治療。在上述試驗中，IFN-P可降低復發(fā)率30%，并且通過磁共振成像目測觀察發(fā)現(xiàn)，IFN-^抑制了腦損傷形成。然而，不同個體的臨床反應不同，并且，其作用機理尚不清楚。隨后對所述階段的三次試驗之一的post-hoc數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，大約20%的IFN-^受體被確定為不敏感者(Poor Responder, PR)。不敏感狀態(tài)已被劃分為藥理學類型(SP，與IFN-P中和抗體的生成相關)或藥物基因組學(即，與IFN-P受體或信號傳導成分中的遺傳學變體相關)類型。所述受治療者普遍具有較低的IFN-3生物利用率。盡管該機理明確，但這樣的受治療者僅占PRs受治療者的少數(shù)。在第三類也是最大的類型中，IFN-3的PR群體可能與IFN-P反應的性質相關，這提供了有關一類MS受治療者發(fā)病機理的信息。個體候選基因的基于微陣列的斷面表達分析(Microarray-based Cross-sectionalExpression Analyses)和研究支持上述觀點。不過，上述所有臨床和放射學可變因素都受限于其預測疾病后果的能力，特別是在MS的早期階段。這種對疾病后果預測的不確定性，意味著某些需要侵入性治療的MS受治療者不會接受這種治療，而其他不必要治療的受治療者可能在沒有合理根據(jù)的前提下因接受侵入性治療而承受各種副作用所帶來的風險
發(fā)明內容
本發(fā)明總體上涉及用于預測多發(fā)性硬化癥(MS)接受治療者的治療反應的方法，尤其涉及一種根據(jù)差別化表達的遺傳標記物(Differentially Expressed GeneticMarkers),預測MS受治療者對干擾素-P (IFN- ^ )治療的反應的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種用于測定所述IFN-P治療MS受治療者的效力的方法。所述方法的一個步驟可以包括從所述受治療者體內獲得生物學樣品。在獲得所述生物學樣品之后，可以測定所述至少一種干擾素-調控基因(IRG)或其變體的表達水平。與對照試驗相比，所述至少一種IRG或其變體的表達的增強或減弱，可以表明所述受治療者對于IFN-P治療的不敏感(respond poorly)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種篩選可用于治療MS的藥劑的方法。所述方法的一個步驟，可以包括提供有關來自對IFN-P治療不敏感的MS受治療者的外周血單核細胞(PBMCs)種群。隨后，給所述PBMCs—種藥劑。然后，可以測定所述PBMCs的一個或多個中至少一種IRG或其變體的表達水平。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種治療MS受治療者的方法。所述方法的一個步驟可以包括從所述受治療者體內獲得生物學樣品。在獲得所述生物學樣品之后，可以測定其所述至少一種IRG或其變體的表達水平。如果所述至少一種IRG或其變體中一種或多種的表達與對照相比增強或減弱，就可以給所述受治療者服用治療上有效量的除IFN-P之外的至少一種藥劑。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于治療MS受治療者的方法。所述方法的一個步驟可以包括從所述受治療者體內獲得生物學樣品。在獲得所述生物學樣品之后，可以測定所述至少一種IRG或其變體的表達水平。如果所述至少一種IRG或其變體的表達與對照相比增強或減弱，就可以給所述受治療者服用治療上有效量的那他珠單抗(natalizumab)。


在結合附圖閱讀以下說明書內容之后，本發(fā)明所屬領域的技術人員可以理解本發(fā)明的上述和其他特征，其中 :圖1是說明本發(fā)明的一個方面關于測定干擾素( IFN-^ )治療多發(fā)性硬化癥(MS)的受治療者其效力的方法的流程圖；圖2是說明根據(jù)本發(fā)明的另一方面關于一種篩選可用于治療MS的藥劑的方法的流程圖；圖3是說明根據(jù)本發(fā)明的另一方面關于一種用于治療MS受治療者的方法的流程圖；圖4是表示通過實時定量PCR計算的OASL的誘導比(IRs)與宏陣列之間的相關性的散布圖(示出了 X軸和Y軸的log2標尺)；圖5是表不第一次注射IFN-0時干擾素-調控基因(IRGs)數(shù)量圖；各柱表不初次注射IFN- ^時的各個體受治療者，柱的高度表示IRs > 2.0的IRGs的數(shù)量，治療反應弱的受治療者加上陰影；圖6表示85個受治療者在初始時間(X-軸)和6個月(y-軸)時的IFN-P分子反應的一系列散布圖；對每一個受治療者來說，示出了 166個基因中每一個基因在兩個時間點的IR，兩個時間點之間的分子反應可變性從每一個圖中對角線的偏差看出；
圖7是10個受治療者的一系列散布圖，表示在24個月時間內具有一致性反應。10個MS受治療者(5個敏感者，5個不敏感者)在初始時間，6個月，和24個月的宏陣列數(shù)據(jù)是隨機挑選的，以便測試兩年時間的反應一致性，前三個柱表示具有弱治療反應的受治療者，而后三個柱表示具有良好治療反應的受治療者，柱I和4比較初始時間和6個月時的反應，柱2和5比較6和24個月時的反應，柱3和6比較初始時間和24個月時的反應；圖8A-B是一系列柱狀圖，表示反應低下的受治療者在初次注射IFN-P (圖8A)和6個月注射IFN-P (圖8B)時的放大的IRG反應(柱狀圖繪制了反應良好組所有受治療者和反應低下組所有受治療者的所有基因的IR);和圖9是表示初始時間T2損傷體積(LV)、初始時間的最佳25IRGs、和初始時間T2損傷體積+最佳25IRGs的ROC曲線的圖。所述ROC曲線檢驗了在初始時間測定的25IRGs的能力，預測在隨后6個月測定的不敏感性，并且比較用初始時間T2損傷體積進行預測的能力。
具體實施例方式除非另有說明，本申請所使用的所有科技術語均具有常用的含義。本文所提供的定義是為了便于理解本文常用的一些術語，而不是要限定本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明的上下文中，術語〃對照〃或〃對照樣品〃可以表示用作參照物的任何受試樣品或分離的樣品。在本文中，術語〃mRNA〃表示基因的轉錄物。轉錄物可以包括RNA，如已準備好翻譯的和/或處于轉錄加工的各個階段(例如，剪接和降解階段)的成熟的mRNA。在本文中，術語 〃核酸〃或〃核酸分子〃表示單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鏈，并且可以包括以與天然存在的核苷酸類似的方式起作用的天然核苷酸的已知類似物。在本文中，術語〃多肽〃和〃蛋白〃包括有一個以上氨基酸亞基的分子。多肽可以是完整的蛋白或可以是蛋白片段，如寡肽或寡肽。所述多肽還可以包括氨基酸亞基的改變，如甲基化或乙?；?。在本文中，術語〃探針〃表示可以通過一種或多種類型的化學鍵，通常通過互補堿基配對與具有互補序列的靶核酸結合的寡核苷酸。例如，寡核苷酸探針可以包括天然堿基(即，A，G，C或T)或修飾過的堿基(例如，7-脫氮鳥嘌呤核苷，次黃嘌呤核苷等)。另外，寡核苷酸探針上的堿基可以通過除了磷酸二酯鍵以外的鍵結合，只要其不妨礙雜交便可。在本文中，術語〃定量〃在用于基因定量轉錄水平的場合時，可以表示絕對或相對定量。絕對定量可以通過包含已知濃度的一種或多種靶核酸(例如，對照核酸)并且參照未知和已知靶核酸的雜交強度(例如，通過生成標準曲線)實現(xiàn)。另外，相對定量可以通過比較兩個或多個基因之間，或兩個或多個處理之間的雜交信號，以便對雜交強度的變化進行定量，并且通過轉錄水平推斷而實現(xiàn)。在本文中，與基因相關的術語〃相對基因表達〃或〃相對表達〃可以表示相同基因表達產(chǎn)物的相對豐度，通常是指不同細胞或組織類型中的mRNA的相對豐度。在本文中，術語"受治療者"可以表示任何動物，包括，但不局限于，人和非人動物(例如，嚙齒類動物，節(jié)肢動物，昆蟲，魚類)，非人靈長類，綿羊，牛，反芻動物，兔類動物，豬，公山羊，馬，犬，貓，鳥類等)，它們將被用作特定診斷和/或治療用途的受體。在本文中，術語〃生物學樣品〃可以表示從受治療者或其組成部分獲得的身體樣品。例如，所述身體樣品可以包括"臨床樣品"，即，來自受治療者的樣品。所述樣品可以包括，但不局限于:外周體液，它可以含有或不含有細胞，例如，血液，尿液，血漿，粘液，膽胰液，上清液和血清；組織或細針活組織檢查樣品(fine needle biopsy samples);以及具有已知診斷、治療和/或預后病史的存檔樣品。身體樣品還可以包括組織切片，如來自組織學目的的冷凍切片。術語〃生物學樣品〃還可以包括通過處理身體樣品衍生的任何材料。衍生的材料可以包括，但不局限于從所述生物學樣品中分離的細胞(或其后代)，從所述樣品中提取的蛋白，和/或核酸分子。所述生物學樣品的處理可能涉及過濾、蒸餾、萃取、濃縮、固定化、干擾組分的滅活和添加各種試劑等措施中的一種或多種。在本文中，術語〃干擾素-調控基因〃或"1RG〃可以表示在用至少一種干擾素，如IFN-P處理時其表達與對照相比增強或減弱的任何基因或其變體。IRGs的例子可以包括在表I中所列出的，以及本領域公知的其他基因(例如，參見，Samarajiwa, S.A.et al.,Nucleic Acids Res.37:D852_D857, Jan.2009)。在本文中，術語“變體”在用于描述IRG時可以表示IRG核苷酸序列上的任何變化，并且包括出現(xiàn)在編碼和非編碼區(qū)的改變，包括外顯子，內含子和非翻譯序列。變化可以包括單個核苷酸取代，一個或多個核苷酸缺失，以及一個或多個核苷酸插入。IRG變體的例子為本領域所公知(例如，參見，Vosslamber, S.et al.，"Interferon regulatory factor5genevariants and pharmacological and clinical outcome of Interferon 旦 therapy inmultiple sclerosis' 基因 and Immunity,在線
公開日
2011 年 4 月 7 日 jPBaranzini etal., Hum.Mol.Genet.15:767, 2009)。本發(fā)明總體上 涉及用于預測多發(fā)性硬化癥(MS)接受治療者的治療反應的方法，尤其涉及根據(jù)差別化表達的遺傳標記物預測MS受治療者對干擾素-P (IFN- ^ )治療的反應的方法。本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn):在MS受治療者群體內，干擾素-調控基因(IRGs)的表達會出現(xiàn)定性差異(即，受調控IRGs的身份)和定量差異(即，受調控IRGs的數(shù)量和誘導或抑制的程度)。具體講，意外地發(fā)現(xiàn)被歸類為不敏感者的MS受治療者在第一次和6個月的IFN- ^注射之后，表現(xiàn)出明顯放大了的分子反應(即增強和減弱的基因表達)。基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種用于測定所述IFN- ^治療的MS受治療者效力的方法，一種確定MS受治療者是否需要用除了 IFN-P之外的其他治療劑進行治療的方法，一種篩選可用于治療MS的藥劑的方法，和用于治療MS受治療者的方法。有關MS發(fā)病機理的機械論學說的看法一直集中在獲得性免疫方面，特別是針對髓磷脂成分的免疫反應。如上文所述，業(yè)已意外地發(fā)現(xiàn)，被確定為不敏感者狀態(tài)的IFN-3受體已經(jīng)具有較高的疾病活性和疾病負擔。不希望受理論的約束，相信對I型IFN的反應增強伴隨著先天性免疫過程，該過程引發(fā)一類MS受治療者(S卩，不敏感者)的自身免疫發(fā)病機理。因此，據(jù)信先天性免疫的差異，無論是I型IFN途徑上的或間接影響IRGs的表達水平方面的差異，都是不敏感者增強疾病嚴重性的決定因素。圖1是說明根據(jù)本發(fā)明一個方面的用于測定所述IFN-P治療MS受治療者的效力的方法10的流程圖。方法10可以包括以下步驟:從MS受治療者體內獲得生物學樣品(步驟12);從所述生物學樣品中分離至少一種核酸(步驟14);確定至少一種IRG和/或其變體的表達水平(步驟16);和分析所述測定基因的表達水平，確定所述受治療者是否對IFN-3治療不敏感(步驟18)。方法10可選擇性包括在獲得所述生物學樣品之前給MS受治療者服用一定劑量的IFN-P (步驟20)。在本文中，術語〃多發(fā)性硬化癥〃或"MS"可以包括這樣的疾病:其中，大腦和脊髓軸突周圍的脂肪髓鞘受損，導致脫髓鞘和瘢疤形成。MS可能包括多種亞型，受治療者可能受到其中任何一種的困擾。MS亞型的例子可以包括良性MS，靜息復發(fā)緩和MS，活動復發(fā)緩和MS,原發(fā)性MS,和繼發(fā)性MS。復發(fā)緩和MS可以包括以完全或部分恢復的急性發(fā)作和在兩次發(fā)作之間無疾病發(fā)展的明確定義為特征的MS的臨床發(fā)病病程。原發(fā)性MS可以包括最初以無緩和的發(fā)展形式出現(xiàn)的MS的臨床發(fā)病病程。繼發(fā)性MS可以包括起初復發(fā)緩和，繼而以各種速度發(fā)展，可能伴隨偶爾復發(fā)和輕微緩和的MS的臨床發(fā)病病程。發(fā)展性復發(fā)MS可以包括從發(fā)作開始就發(fā)展，間或復發(fā)的MS的臨床發(fā)病病程。一般來說，在復發(fā)之后馬上出現(xiàn)明顯恢復，但在兩次復發(fā)之間可能出現(xiàn)疾病發(fā)作的逐漸惡化。參見圖1，在步驟12，可以從MS受治療者的體內獲得至少一種生物學樣品。在本文中，術語"生物學樣品"以其最廣義的含義使用，并且可以包括來自所述受治療者的任何臨床樣品。生物學樣品的例子可以包括，但不局限于，外周體液，組織或細針活組織檢查樣品，以及具有已知診斷、治療和/或預后病史的存檔樣品。生物學樣品還可以包括組織切片，如來自組織學目的的冷凍切片，以及通過處理所述樣品衍生的任何材料。在本發(fā)明的一個例子中，所述生物學樣品可以包括用注射器針頭從MS受治療者的靜脈中獲得的全血樣品。在步驟14，可以從所述生物學樣品中分離至少一種核酸?？梢园凑斩喾N公知方法中的任一種從所述生物學樣品中分離核酸。本領域技術人員可以理解的是，一旦檢測到一個基因拷貝數(shù)的改變，就可以分離基因組DNA。相反，一旦檢測到理想的基因表達水平，就可以分離RNA (即mRNA)。分離核酸，如mRNA的方法為本領域技術人員所熟知，(例如，參見，Chapter3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology !Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part1.Theory of Nucleic AcidPreparation.P.Ti jssen，ed.Elsevier, N.Y.(1993))。在本發(fā)明的一個例子中，RNA可以使用商業(yè)化試劑盒，如PAXGENE RNA血液提取試劑盒(PREANALYTIX，Switzerland)在體外從全血樣品中分離。簡言之，可以從MS受治療者的體內獲得至少一種全血樣品，然后收集在試管中(例如，無RNase試管)。純化可始于離心步驟，使細胞在試管中沉淀。然后可以洗滌所述沉淀物，重新懸浮，并且在優(yōu)化緩沖液中(與蛋白酶K 一起)溫育，以促進蛋白消化?？梢詫嵤┝硪粋€離心步驟，以便使細胞裂解液均勻化，并且除去剩余的細胞碎片。然后，可以將流出的上清液部分轉移到新的微量離心機管中。然后可以添加乙醇，以便調整結合條件，接著將所述裂解液加樣到核酸純化柱上。在短暫離心之后，RNA能夠選擇性地結合在純化柱的膜上，而污染物從柱中通過。隨后可以通過若干有效的洗滌步驟除去其余污染物。例如，在第一和第二個洗滌步驟之間，可以用DNase I處理所述膜，以便除去微量的結合DNA。在所述洗滌步驟之后，可以用洗脫緩沖液洗脫RNA，并且進行熱變性。然后，通過額外的瓊脂糖凝膠電泳觀察可以評估RNA的質量和數(shù)量(例如，通過光譜學分析)。

在步驟16，從所述生物學樣品中分離的核酸中測定所述至少一種IRQ和/或其變體的表達水平。在本發(fā)明的一個例子中，可以根據(jù)從所述生物學樣品中分離的核酸測定表I中所列舉的至少一種IRG和/或其變體(例如，大約4個IRGs和/或其變體)的表達水平。在本發(fā)明的另一個例子中，可以根據(jù)從所述生物學樣品中分離的核酸測定表3中所列舉的至少一種IRG和/或其變體(例如，大約4個IRGs和/或其變體)的表達水平。本領域技術人員可以理解的是，為了測定基因的表達水平(以及轉錄水平)，需要提供包含所述基因的mRNA轉錄物的核酸樣品，或源于所述mRNA轉錄物的核酸。在本文中，源于mRNA轉錄物的核酸可以包括這樣的核酸:在它的合成中所述mRNA轉錄物(或其亞序列)最終被用作模板。因此，由mRNA逆轉錄得到的cDNA，由所述cDNA轉錄得到的RNA，由所述cDNA擴增的DNA，由擴增的DNA轉錄得到的RNA等，均可源于所述mRNA轉錄物，并且對所述衍生產(chǎn)物的檢測可以作為所述樣品中原始轉錄物存在和/或豐度的指標。檢測基因表達水平和/或活性的方法為本領域所公知。例如，所述用于檢測RNA方法的非限定性例子，可以包括Northern印跡分析，RT-PCR, RNA原位雜交(例如，使用DNA或RNA探針與樣品中的RNA分子雜交)，原位RT-PCR，和寡核苷酸微陣列(例如，通過源于樣品的多核苷酸序列與結合在底物上的寡核苷酸雜交)。在本發(fā)明的一個例子中，宏陣列可用于檢測所述至少一種IRG和/或其變體的表達水平。本領域技術人員可以理解的是，所述宏陣列可以包括能夠與要檢測的表達核酸特異性雜交的多種試驗探針，并且選擇性地包括一種或多種對照探針。試驗探針可以包括大小在一定范圍(例如，大約5-50個核苷酸)，并且有與特定基因的亞序列互補的序列的寡核苷酸，所述特定的基因的亞序列其表達是被設計成準備進行檢測的。因此，所述試驗探針能夠與靶核酸特異性雜交?？梢宰鳛樗龊觋嚵幸徊糠职渲械膶φ仗结樀睦?，可以包括標準化對照，表達水平對照和錯配對照。在本發(fā)明的另一個例子中，在例2 (參見下文)中所披露的宏陣列可用于檢測表I所列基因中至少大約4個基因的表達水平。因為若干原因，檢測所述至少大約4個基因(例如，4個基因)的表達水平可能是有利的。為了進行定量檢測(例如，qPCR)，例如，出于實用考慮(例如，所需試劑的體積和數(shù)量等)，在多元陣列中選擇有限數(shù)量的基因可能是有用的。另外，可以選擇至少大約4個基因以便利用本發(fā)明的隨機森林模型(random forest model)優(yōu)化其甄別能力(即，位于RO C曲線下面的面積)。包括所述宏陣列的IRGs可以由大約166種人類cDNAs來代表。簡單講，將DNA點在宏陣列膜上、進行探針標記、和雜交的方案，可以從在體外從全血中分離大約g總RNA開始。然后可以通過使用 SUPERSCRIPT II，在存在 2PdCTP (FNVITROGEN，Carlsbad，CA)的條件下逆轉錄生成cDNA探針。殘余RNA可以通過在大約70° C下堿處理大約20分鐘水解，此后可以用G50柱(GE Healthcare, Buckingham-shire, UK)純化cDNA。然后探針可以在大約10毫升雜交緩沖液中與所述宏陣列膜雜交過夜，隨后用低和高強度緩沖液洗滌。接著，用增感熒光屏對所述宏陣列曝光大約兩天，隨后用ST0R1MAGER (MOLE⑶LAR DYNAMICS,Sunnyvale, CA)掃描?，F(xiàn)有技術的方法通常采用高密度寡核苷酸微陣列(microarrays)表征通過IFN-^調控的基因。所述方法可用于鑒定新型IFN-P調控基因，但結果不便于定量，因此，該技術不太適合分析縱向的、差異化的IRG調控。與現(xiàn)有技術的高密度微陣列不同，本發(fā)明的宏陣列可以包括從先前的微陣列實驗中選擇的大約166個IRGs (例如，參見，Schlaak,J.F.et al, J.Biol.Chem.277 =49428-49437,2002 ；和 Rani，M.R.S.et al, Ann.N.YAcadSc1.1182:58-68, 2009)，所述實驗證實所述微陣列可以作為其他疾病的指標(例如，IFN_a治療丙肝病毒)并且證實，所述微陣列是可再生的，靈敏的，和定量的。有利的是，通過本發(fā)明的宏陣列(macroarrays)可檢測較小數(shù)量的基因，提供了用于評估IFN-^-調控的基因表達聚集和定量的測定方法。在步驟18，可以分析所述測定的基因表達水平，以便確定所述IFN-P治療的效力，例如，所述測定的基因表達可以與對照的基因表達水平(例如，沒有MS的一個或多個受試者)進行比較。在本發(fā)明的一個例子中，與所述對照相比，表I所列基因中至少大約4個基因和/或其變體表達水平的增強或減弱，可以表明所述受治療者對IFN-P的治療不敏感。除了表現(xiàn)出增強或減弱的基因表達水平之外，盡管進行治療，不敏感者還可能表現(xiàn)出連續(xù)性神經(jīng)功能惡化。用于評估MS受治療者神經(jīng)功能惡化的方法為本領域所公知，并且可以包括，例如，定量MRI分析，擴張能力喪失狀態(tài)量表(EDSS)(例如，EDSS得分提高至少大約
0.5可以作為神經(jīng)功能惡化的指標)，以及多發(fā)性硬化功能復合物。在本發(fā)明的另一個例子中，下列基因和/或其變體中至少一個(例如，大約4個)的增強或減弱的表達水平(與對照相比)可以表明所述受治療者對IFN-P治療不敏感:
2-50AS ;銜接蛋白；Akt-2 ；AP0L3 ；ATF2 ；Bad ;Bcl_2 ；BST2 ;C1_INH ；Clorf29 ；Clr ；C1S ;半胱天冬酶 I (Caspasel);半胱天冬酶 7 ;半胱天冬酶 9 ；CCR1 ;CD3e ；CEACAM ；c-myc ；C0MT ；CREB ； CXCL11 ；CXCR4 ；CYB56 ；DDX17 ；Def-a3 ;人彈性蛋白酶 2 (Elastase2) ;Fas_L ；FK506 ；FLJ20035 ；G1P3 ；Gadd45 ；GATA3 ；GBP2 ；HLADP ；HLADRA ；Hou ；HPAST ；Hsfl ；Hsp90 ；ID0 ；TFI16 ；IF1-17 ；IFN-44 ；IFI60 ；IFIT1 ；IFIT2 ；IFIT5 ；IFITM2 ；IFITM3 ；IFN-17 ；IFNARl ；IFNAR2 ；IFNGRl ；IFNGR2 ；IL15 ；IL18BP ；IL1RN ；IL2 ；IL2Rg ；IL6 ;Int_6 ;IP_10 ；IRF2 ；ISG15-L ；ISG20 ；ISGF3g ；LICAM ；MAP2K3 ；MAP2K4 ；MAP3K14 ；MAP3K3 ；MAP3K4 ；MAP3K7 ；MAP4K1 ；MAPK13 ；MAP7 ；Met-onco ；MMP-1 ;MMP_9 ；MT1H ；MT1X ；MT2A ；MX1 ;NF-1L_6 ；NFkB ;NMI ;NT5e:0ASL ;P4HA1 ;p53 ;p57Kip2 ;PA1-1;PDK1 ;PDK2 ;P13K ;PKR ;網(wǎng)蛋白；PLSCR I ；PSMB9 ；RCNI:RGS2 ；RH0 ⑶P ;RIG_1 ；SERPIN:SNN ；S0CS-1 ；STATI ；STAT2 ；STAT4 ；TFEC ；TGFbR2 ；TGFbR3 ；TIMP-1 ；TNF-a ；TNFAI P6 ；TORlB ；TRAIL ；UBE2L6 ；USP118 ；VegFC ；蝰毒素(Viperin)和 WARS。在本發(fā)明的另一個例子中，下列基因和/或其變體中至少一個(例如，大約4個)的增強或減弱的表達水平(與對照相比)可以表明所述受治療者對IFN-P治療的不敏感:TRAIL ；RIG-1 ；2-50AS ；STATI ；P13-激酶;IL_15 ;IP_10 ;MM1 ；P4HA1 ;半胱天冬酶 7 ；PD2 ；ATF-2:TNF-a ；RGS2 ；SNN ；hsp90 ；c-myc ;A1_AT ；FILA-DRA ；C0MT ；NFKB ；HLA-DP ；TIMP-1 ；CXCR4 ;和 IL-2。在本發(fā)明的另一個例子中，下列基因和/或其變體中至少一個(例如，大約4個)的增強的表達水平(與對照相比)可以表明所述受治療者對IFN-P治療的不敏感=TRAIL ；RIG-1 ；2-50AS ；STAT I ；PI3-激酶;IL_15 ;IP_10 ；MMP-1 ；P4HA1 ;半胱天冬酶 7 ；PDK2 ；ATF-2 ； TNF-a ;和 RGS2。

在本發(fā)明的另一個例子中，下列基因和/或其變體中至少一個(例如，大約4個)的減弱的表達水平(與對照相比)可以表明所述受治療者對IFN-P治療的不敏感:SNN ；hsp90 ；c-myc ;A1_AT ；HLA-DRA ；C0MT ；NFKB ；HLA-DP ；TIMP-1 ；CXCR4 ;和 IL-2。 本發(fā)明另一方面可以包括確定MS受治療者是否應該還要用除IFN- ^之外的治療劑治療。例如，與對照相比，當MS受治療者的至少一種IRG和/或其變體(例如，表I所列基因中至少大約4個基因)具有增強或減弱的表達水平時，所述受治療者就可以用除IFN-3之外的治療劑治療。除IFN-P之外的MS療法為本領域所公知，并且可以包括，例如，醋酸格拉太咪爾,米托蒽醌,和那他珠單抗，以及其他療法(例如,維生素D)。其他MS療法可以包括目前用于MS治療的臨床研究的方法，如阿侖單抗，達利珠單抗，肌苷，BG00012,芬戈莫德，拉喹莫德和NEUROVAX。下面將更詳細地說明本發(fā)明的用于治療MS患者的方法。在步驟20，所述方法10可選擇性包括在獲得所述生物學樣品之前給MS受治療者施用一定劑量的IFN-P。所述IFN-P劑量可以作為單一制劑輸送，這可以降低基因表達測定(即，在步驟16)的干擾?？梢越oMS受治療者施用的IFN-P劑量的例子包括IFN-P-1a(例如，AVONEX，REB1F)和 IFN-P-1b (例如，B SERON，EXTAV1A)。所述 IFN-P 劑量可以通過任何一種已知的途徑給藥，如血管內注射。在給所述受治療者施用所述FN-P劑量之后，可以獲得至少一種生物學樣品(如上文所述)?？梢栽谝粋€或多個時間點獲得所述生物學樣品。例如，可以在用IFN-P劑量之后大約12小時從MS受治療者的體內獲得全血樣品。應當理解的是，在第一個IFN-@劑量之后，還可以給受治療者用額外劑量的IFN-P。例如，可以給受治療者用第一個劑量的IFN-P，然后在用第一個劑量大約12小時之后收集生物學樣品，然后在大約6個月用第二個劑量的IFN-3，隨后再次收集生物學樣品。在獲得所述生物學樣品之后，可以從所述樣品中分離至少一種核酸(如上文所述)。同樣如上文所述，隨后可以利用，例如，宏陣列之類測定所述至少一種IRG和/或其變體的表達水平。一旦測定了所述至少一種IRG和/或其變體的表達水平，就可以對所述表達水平進行分析(如上文所述)。例如，所述測定的基因表達水平可以與所述對照的基因表達水平進行比較。所述對照可以從一個或多個未患MS的受試者體內分離、從沒有用IFN-P治療的受試者體內獲得、或在用IFN-P治療之前從受試者體內獲得。例如，當表I所列基因中至少大約4個基因的所述基因表達測定水平增強或減弱(與所述對照相比)時，所述受治療者可能對IFN-0治療反 應不敏感。盡管IFN- ^是最常用的MS疾病改善治療劑，其作用機理尚不十分清楚，并且沒有對個性化治療進行指導的生物學標記。根據(jù)以下發(fā)現(xiàn):MS受治療者對IFN-P注射的放大的分子反應是先天性免疫反應驅動發(fā)病機理的一類受治療者的標志，本發(fā)明優(yōu)選提供了用于鑒定被定義為對IFN-P治療不敏感狀態(tài)的少數(shù)受治療者的方法10。正如下面將更詳細討論的，本發(fā)明因此能夠為每一個MS受治療者定制疾病改善治療方案。圖2表示本發(fā)明另一方面，包括用于篩選治療MS的制劑的方法30。方法30可以包括以下步驟:提供一個來自MS受治療者的外周血單核細胞(PBMCs)群體(步驟32);給所述PBMCs使用一種制劑(步驟34);從所述PBMCs中至少分離一種核酸(步驟36);測定至少一種IRG和/或其變體的基因表達水平(步驟38);和分析測定的基因表達水平(步驟40)。在步驟32，可以從患有MS并且是IFN-P治療不敏感者的受治療者的體內獲得PBMCs群體。確定所述受治療者是否是不敏感可以按照上述方法10完成。例如，與對照相t匕，具有至少一種IRG和/或其變體(例如，表I所列基因中大約4個基因)增強或減弱的表達水平的MS受治療者可以被表征為不敏感者。本領域技術人員可以理解的是，存在若干種用于分離PBMCs的方法。例如，PBMCs可以利用不同密度梯度離心方法從全血樣品中分離。一般，可以將抗凝全血在分離介質上鋪層，然后離心。在離心步驟結束時，目測可見有若干層(從頂部到底部):血漿/血小板；PBMCs ;分離介質；和紅細胞/粒細胞?？梢猿BMC層并且洗滌以便除去所有污染物(例如，血紅細胞)。在洗滌之后，可以用本領域公知的方法驗證細胞類型和細胞活力。所述PBMCs隨后可以在體外培養(yǎng)一段時間，并且是在足以促進形成充分融合的細胞層的條件下培養(yǎng)。在步驟34，可以給所述PBMCs群體使用至少一種藥劑。可以給所述PBMCs群體使用的藥劑包括可能用于MS治療的候選物的任何生物學部分，化合物，或藥物。所述藥劑的例子可以包括生物制劑，藥用化合物，多肽，蛋白，核酸和小分子。在步驟36，可以從所述PBMCs群體中分離至少一種核酸。從細胞群體中分離核酸的方法為本領域所公知。例如,可以利用公知的RNA提取方法從所述PBMCs群體中分離RNA。如上文所述，在步驟38，可以測定所述至少一種IRG和/或其變體(例如，表I所列基因中大約4個基因)的表達水平。例如，宏陣列可用于檢測基因表達水平。一旦確定所述至少一種IRG和/或其變體(例如，表I所列基因中大約4個基因)的表達水平，就可以在步驟40分析所述測定的表達水平(如上文所述)。例如，所述測定的基因表達水平可以與對照的基因表達水平進行比較。當所述測定的基因表達水平增強或減弱(與對照相比)時，所使用的試劑就可能不宜用作MS治療的候選物。相反，當所述基因表達水平?jīng)]有增強或減弱(與所述對照樣品相比)時，所使用的試劑就可能用于MS治療的候選物。圖3表示本發(fā)明另一方面，包括用于治療MS受治療者的方法50。方法50可以包括以下步驟:從MS受治療者的體內獲得生物學樣品(步驟52);從所述生物學樣品中分離至少一種核酸(步驟54);測定所述至少一種IRG和/或其變體的基因表達水平(步驟56);分析所述測定的基因表達水平(步驟58);和給所述受治療者施用至少一種藥劑(步驟60)。方法50可選擇性地包括在獲得所述生物學樣品之前給MS受治療者用一定劑量的IFN- β(步驟 62)。在步驟52，可以從MS受治療者的體內獲得至少一種生物學樣品。如上文所述，例如，所述生物學樣品可以包括用注射器針頭從受治療者靜脈血管中獲得的全血樣品。在步驟54，可以從所述生物學樣品中分離至少一種核酸(如上文所述)。例如，可以使用PAXGE E RNA血液提取試劑盒從全血樣品中分離RNA。接著，可以在步驟56測定所述至少一種IRG和/或其變體的表達水平，如上文所述，例如，雜交宏陣列可用于檢測表1所列基因中至少大約4個基因的基因表達水平。一旦確定了所述至少一種IRG和/或其變體的表達水平，就可以在步驟58分析所述測定的基因表達水平(如上文所述)。例如，所述測定的基因表達水平可以與所述對照的基因表達水平進行比較。當所述測定的基因表達水平增強或減弱(與對照相比)時，所述受治療者可能是IFN-P治療的不敏感者。相反，當所述基因表達水平?jīng)]有增強或減弱(與所述對照樣品相比)時，所述受治療者可能是IFN-P治療的候選人。在步驟60，可以給所述受治療者施用治療有效量的至少一種藥劑。給所述受治療者用的具體藥劑取決于事先確定的所述受治療者的反應狀態(tài)。例如，如果所述受治療者是不敏感者，就可以給所述受治療者用治療有效量的除IFN-P之外的藥劑，如那他珠單抗。相反，如果所述受治療者是不敏感者，就可以給所述受治療者用治療有效量的一種藥劑，如IFN-^。應當理解的是，治療的類型，劑量，方案，和治療時間可以根據(jù)受治療者的病理學嚴重性和/或預后而改變。本領域技術人員可以調整治療的類型，劑量，方案，和治療時間。優(yōu)選的是，方法50提供了一種用于治療MS受治療者的方案，受治療者不用使用不必要的藥物，反過來，由于能夠節(jié)省不必要的成本，這對于醫(yī)療保健體系來說是十分有利的。還可以理解的是，方法50可選擇性包括在獲得所述生物學樣品之前(如上文所述)，在步驟62給MS受治療者用一定劑量的IFN- ^的步驟。還可以理解的是，作為方法10，30，和50的一部分，本發(fā)明還可以包括蛋白或多肽分離和檢測技術。例如，可以用公知方法分離并檢測由本發(fā)明的IRGs和/或其變體編碼的蛋白，多肽，和/或其變體。為此，可以從MS受治療者的體內獲得生物學樣品(如上文所述)。然后，用公知技術處理所述生物學樣品，以便分離由本發(fā)明的IRG和/或其變體編碼的蛋白，多妝，和 / 或其變體。例如，參見，Protein Purification Protocols, Humana Press(1996)。然后可以利用一種或多種公知技術的組合檢測所述分離的蛋白，多肽，和/或其變體，如蛋白微陣列，免疫染色，免疫沉淀反應，電泳(例如，2D或3D)，Western印跡，分光光度法，和BCA測定。在檢測所述蛋白，多肽，和/或其變體之后，可以分析所述蛋白，多肽，和/或其變體的含量。當所述蛋白，多肽，和/或其變體的含量增加或減少(與對照樣品相比)時，所述受治療者可能是IFN-@治療的不敏感者。相反，當所述蛋白，多肽，和/或其變體的含量沒有增加或減少(與所述對照樣品相比)時，所述受治療者可能是IFN-P治療的候選人。下面的例子只是用于說明目的的，而不是要限定權利要求的范圍，權利要求附在說明書之后。
實施例1 述 臨床方案 克利夫蘭診所(CC)的機構審查委員會批準了該項研究。所有受治療者都提供了書面知情同意文書。如果受治療者具有臨床孤立綜合征(CIS)或復發(fā)緩和MS，開始是通過肌內注射I FN-P-1a治療，以前從未接受過治療，并且隨后在CC MS中心跟蹤觀察，他們就是合適人選。共有99位受治療者參與了該研究。在初始時間、6、12、和24個月時均對每一個受治療者進行檢查。在3和18個月，電話聯(lián)系受治療者，評估治療適應性并查明副作用。在初始觀察時間、6個月和24個月，在臨床研究單位采集血液，在即將IFN- ^注射之前和注射之后準確的12小時進行IRG分析，并且對所述受治療者進行標準化腦MRI掃描，以便定量評估損傷和腦萎縮。在每一次檢測時，對受治療者進行神經(jīng)學檢測，以便測定Kurtzke擴張能力喪失量表得分(Kurtzke，J.F.，Neurology33:1444-1452，1983)，多發(fā)性硬化功能組合得分(Rudick，R.A.et al, Mult.Scler.8:359_365，2002)，和間歇性復發(fā)或疾病病史；還給受治療者提供了結構問卷，以表征其流感樣綜合征，肌痛，受寒，疲勞，頭痛，和體力下降。在6和24個月檢測血清中的IFN-中和抗體。
MRI分析所述MRI獲取結果包括在注射標準劑量的禮(0.1 mmol/kg)之前和之后獲得的T2-加權的流體衰減反轉恢復(FLAIR)圖像，T2-和質子密度-加權的快速雙回波自旋回波圖像，和Tl-加權的自旋回波圖像。利用內部開發(fā)的圖像分析軟件測定腦主質級分(BPF), T2損傷體積，H低強度損傷體積，釓-強化損傷體積和數(shù)量，新T2損傷數(shù)量，和擴大的T2損傷數(shù)量。利用全自動分割軟件根據(jù)FLAIR圖像計算BPF (Rudick, R.A.et al,J.Neuroimtnunol.93:8-14,1999)。有關損傷分析方法的細節(jié)以前業(yè)已公開(Cohen, J.A.etal’Mult.Scler.14:370-382, 2008)。簡單講，在FLAIR和T2/PD圖像中自動分割T2高強度損傷，并且利用交互軟件進行目測檢驗，以便校正誤分類的損傷。將6個月的跟蹤圖像記錄到初始時間，并進行強度標準化。將初始時間T2損傷掩蔽施加于同時記錄的6個月的圖像上，以確定持久性損傷。然后，從所述記錄的、強度標準化的6個月圖像中扣除初始時間圖像，以便自動確定6個月時的新的和擴大的T2損傷。利用交互軟件目測檢驗所述新的和擴大的T2損傷，以便產(chǎn)生最終計數(shù)。
RNA分離利用PAXGENE RNA血液提取試劑盒(PreAnalytix, Switzerland),按照生產(chǎn)商的說明，在體外從血液中提 取RNA，并且通過乙醇沉淀濃縮。通過分光光度法(吸光度比值為280/260nm)評估RNA的質量和數(shù)量，并且通過瓊脂糖凝膠電泳進行額外的目測觀察。RNA樣品在-80° C下保存。
用宏陣列進行基因分析用于cDNA宏陣列分析的詳細方法是按照公開的方法進行的(Schlaak，J.F.etal, J.Biol Chem.277，49428-49437，2002 ;Rani，M.R.S.et al, Ann.N.Y Acad Sc1.1182:58-68,2009)。常規(guī)宏陣列上的IRGs由從Unigene數(shù)據(jù)庫中篩選的166種人類cDNAs代表。在表I中示出了所述宏陣列上所有基因的名稱和GenBank登錄號。
表1:選擇用于定制宏陣列的166種I型干擾素響應基因的名稱和GenBank登錄號
權利要求
1.一種預測干擾素-P (IFN-0 )在多發(fā)性硬化癥(MS)接受治療者體內的治療效力的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 從所述受治療者體內獲得生物學樣品；和 確定至少一種干擾素-調控基因(IRG)和/或其變體的表達水平； 其中，與對照試驗相比，所述至少一種IRG和/或其變體表達的增強或減弱均表明所述受治療者對IFN-P的治療不敏感。
2.如權利要求1所述的方法，其所述生物學樣品包括全血。
3.如權利要求2所述的方法，還包括從所述全血樣品中分離RNA。
4.如權利要求1所述的方法，還包括在獲得所述生物學樣品之前給予所述受治療者一定劑量的IFN-3。
5.如權利要求4所述的方法，還包括在給予一定劑量的IFN-P后約12小時之內獲得所述生物學樣品。
6.一種篩選可用于治療MS的藥劑的方法，該方法包括以下步驟: 提供從IFN-P治療不敏感的MS受治療者體內獲得的外周血單核細胞(PBMCs)群體； 給所述PBMCs使用一種藥劑；和 確定至少一種IRG和/或其變體在所述一個或多個PBMCs中的表達水平。
7.如權利要求6所述的 方法，與對照試驗相比，其中所述至少一種IRG和/或其變體的表達增強或減弱表明所述藥劑不是用作MS治療的候選藥物。
8.一種治療MS接受治療者的方法，該方法包括以下步驟: 從所述接受治療者體內獲得生物學樣品； 確定至少一種IRG和/或其變體的表達水平；和 與對照試驗相比，如果所述至少一種IRG和/或其變體中的一種或多種表達顯示增強或減弱的話，則給所述受治療者施用除IFN-P之外的治療有效量的至少另一種藥劑。
9.如權利要求8所述的方法，所述生物學樣品包括全血。
10.如權利要求9所述的方法，還包括從所述全血樣品中分離RNA。
11.如權利要求8所述的方法，還包括在獲得所述生物學樣品之前對所述受治療者給予一定劑量的IFN-3。
12.如權利要求11所述的方法，還包括在給予一定劑量的IFN-P后約12小時之內獲得所述生物學樣品。
13.一種用于治療MS受治療者的方法，該方法包括以下步驟: 從所述受治療者體內獲得生物學樣品； 確定至少一種IRG和/或其變體的表達水平；和 與對照試驗相比，如果所述至少一種IRG和/或其變體的表達顯示增強或減弱的話，給所述受治療者施用治療有效量的那他珠單抗。
14.如權利要求13所述的方法，所述生物學樣品包括全血。
15.如權利要求14所述的方法，還包括從所述全血樣品中分離RNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于預測干擾素-β(IFN-β)在患有多發(fā)性硬化癥接受治療者體內的治療效力的方法。所述方法的一個步驟可以包括從所述受治療者體內獲得生物學樣品。在獲得所述生物學樣品之后，可以測定所述至少一種干擾素-調控基因(IRG)和/或其變體的表達水平。與對照相比，所述至少一種IRG和/或其變體的增強或減弱的表達可以表明所述受治療者對IFN-β的治療不敏感性。
文檔編號A61K48/00GK103140235SQ201180036119
公開日2013年6月5日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權日2010年6月18日
發(fā)明者理查德·A.·拉迪克, 理查德·M.·蘭塞霍夫 申請人:克利夫蘭臨床基金會