專利名稱：用于組織維護(hù)和修復(fù)的多陰離子聚合物和亞精胺的超分子復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由多陰離子聚合物和亞精胺形成的超分子復(fù)合物；及用于結(jié)締組織和粘膜治療、維護(hù)或修復(fù)的包含這些超分子復(fù)合物的醫(yī)學(xué)/美容組合物。
背景技術(shù)：
亞精胺屬于聚胺類(PA)的多陽離子化合物，它們與帶負(fù)電的DNA、RNA、蛋白質(zhì)、磷脂和核苷三磷酸相連接。
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這種能力可解釋它們在細(xì)胞增殖和分化上的作用，見Heby 0.Differentiation1981;19:1-20;和 Cohen SS.A Guide to the Polyamines.New York:Oxford UniversityPress;1998;185-230。然而，它們的生物學(xué)意義難以確切地定義。PA事實(shí)上是原癌基因c-myc和c-fos轉(zhuǎn)錄所需要的。特別是，亞精胺優(yōu)先刺激c-myc的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),而刺激c-fos則為腐胺(Tabib & Bachrach Int J Biochem Cell Biol 1999;31:1289-95)。之前發(fā)現(xiàn)了它在細(xì)胞膜和細(xì)胞核之間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)上的作用(Tabib & Bachrach.Biochem Biophys Res Commun1994;202:720-7)。在TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)上也有亞精胺的參與(Blachowski S等.，Int JBiochem 1994; 26:891-897)，它在細(xì)胞移行時(shí)TGF-β基因的正常表達(dá)上似乎是必須的。已有幾項(xiàng)專利要求保護(hù)各種治療環(huán)境中的亞精胺和其它PA，即W097/014415和W099/051213 (局部止痛和濕疹)；US6555140 (提高男性生育力和性欲)；US06252838 (皮膚抗衰老)；US04242701 (治療酒精中毒)；W09852552 (抗癌)；和US5432202 (抗高血壓Ca拮抗劑)。亞精胺典型的特性是與陰離子超分子相互作用產(chǎn)生超分子復(fù)合物，這些超分子復(fù)合物可調(diào)節(jié)例如酶/DNA 相互作用(Isobe H 等.Chem Commun (Camb).2005; 28; (12): 1549-51)。亞精胺和磷酸鹽類形成的超分子復(fù)合物可改變DNA的壓縮狀態(tài)，保護(hù)其不受核酸酶活性的影響(D' Agostino L等.1UBMB Life.2006; 58 (2): 75-82)。類似的性質(zhì)見于亞精胺超分子，據(jù)報(bào)告起保護(hù)因子作用的聚胺的自組裝聚合物(D' Agostino L等.FEBSJ.2009;276(8):2324-35)。W02010049562公開了多陰離子聚合物與亞精胺或精胺以1:0.1至1:0.5w/w的比例(接近等摩爾)形成的超分子復(fù)合物。據(jù)稱它們的用途是傳送其它生物活性劑。唯一已知的應(yīng)用是Giuliani SpA (意大利米蘭)以Bioscalin⑩商標(biāo)上市的抗脫發(fā)產(chǎn)品，產(chǎn)品包含亞精胺鹽酸鹽，其品牌商標(biāo)為Biogenina和Cronobiogenina。亞精胺鹽酸鹽的配方和抗脫發(fā)方法由Giuliani獲得專利，見EP1469843、W003063851和W02010060729。雖然對于可通過細(xì)胞增殖促進(jìn)組織再生的療法有明顯的需求，但是至今尚無人嘗試設(shè)計(jì)在這種特定組織上具有高效應(yīng)的亞精胺復(fù)合物。發(fā)明概述本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，某些多陰離子聚合物和亞精胺形成的超分子復(fù)合物在結(jié)締組織再生上具有很高的效應(yīng)。一個(gè)方面，本發(fā)明涉及超分子復(fù)合物，其特征為陰離子當(dāng)量(來自多陰離子聚合物)和陽離子當(dāng)量(來自亞精胺)為10:1至IO7: leq/eq,其進(jìn)一步特征為在再生治療上有高效應(yīng)。另一個(gè)方面，本發(fā)明的超分子復(fù)合物較佳的比例為IO2:1至IO4: leq/eq。還有一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含上述超分子復(fù)合物的用于受損或衰老組織維護(hù)或修復(fù)的組合物。本發(fā)明的這些特征和其它特征在下文作最好的描述。附圖的簡要說明

圖1 顯示用 10: 1、IO2: 1、IO3: 1、IO4: 1、IO5:1 和 IO6: leq/eq HA-亞精胺復(fù)合物處理
后24小時(shí)(淺色)和48小時(shí)(深色)相對于未處理細(xì)胞的成纖維細(xì)胞增加百分率；前2欄是HA-亞精胺1: leq/eq復(fù)合物(條形欄，在本發(fā)明范圍外);最后2欄是純HA0.l%w/v(點(diǎn)狀欄，參考文獻(xiàn))。圖 2 顯示用 2X10:1、2X102:1、2X103:1、2X104:1、2X105:1 和 2X106:leq/eq海藻酸鹽-亞精胺復(fù)合物處理后24小時(shí)(淺色)和48小時(shí)(深色)相對于未處理細(xì)胞的成纖維細(xì)胞增加百分率；前2欄是海藻酸鹽-亞精胺2: leq/eq復(fù)合物(條形欄)；最后2欄是純海藻酸鹽0.l%w/v (點(diǎn)狀欄,參考文獻(xiàn))。圖3 顯示用 3X10:1、3X102:1、3X103:1、3X104:1、3X105:1 和 3X106:leq/eq 多馬來酸鹽-亞精胺復(fù)合物處理后的成纖維細(xì)胞增加百分率，圖中意義同圖1和圖2。圖4顯示用系列稀釋的亞精胺3HC1處理后的成纖維細(xì)胞增加百分率。圖5顯示超分子復(fù)合物的成纖維細(xì)胞增加百分率減去當(dāng)量濃度亞精胺3HC1所得值之差。圖6顯示超分子復(fù)合物與當(dāng)量濃度亞精胺3HC1相比較的效應(yīng)比，即表示為成纖維細(xì)胞增加百分率之比。圖7顯示以K1-67抗原染色后用0.l%w/v HA-亞精胺50: leq/eq水溶液處理24小時(shí)的再造人陰道粘膜(RHVE)的組織切片。圖8是用0.9%生理鹽水處理的對照組織。發(fā)明詳述本說明書所用的術(shù)語“超分子復(fù)合物”描述一種多陰離子聚合物和亞精胺形成的多元酸/多元堿復(fù)合物，其特征為陰離子當(dāng)量(來自多陰離子聚合物)和陽離子當(dāng)量(來自亞精胺)之比為約10:1至約IO7: leq/eq，更佳為約IO2:1至約IO4: leq/eq。

這些超分子復(fù)合物具有明顯的增殖/再生活性，這種活性顯著地優(yōu)于亞精胺、多陰離子聚合物及其總和。如下文所述，適用于需要成纖維細(xì)胞增殖的治療/美容目的的這些超分子復(fù)合物及包含該超分子復(fù)合物的組合物是新穎的。所述超分子復(fù)合物的特征是:多陰離子聚合物和亞精胺兩者之比> 10:le/eq，無論在其結(jié)構(gòu)特征上和明顯的對成纖維細(xì)胞的高增殖活性上都不同于兩者接近等摩爾的復(fù)合物。本說明書所用的術(shù)語“多陰離子聚合物和亞精胺接近等摩爾”表示來自多陰離子聚合物的陰離子當(dāng)量與來自亞精胺的陽離子當(dāng)量之比為約1:3至10:leq/eq。
術(shù)語“多陰離子聚合物”，按本領(lǐng)域廣義的理解，指每個(gè)分子包含多個(gè)陰離子基團(tuán)的聚合材料或聚合物。它包括含有多個(gè)陰離子基團(tuán)如羧基(_coo_)、硫酸根(-oso3_)、亞硫酸根(-S03_)、磷酸根(-OPO32O、亞磷酸根(-PO32O及其組合的天然/半合成聚合物和全合成聚合物。術(shù)語“多陰離子聚合物”包括“多陰離子衍生而來的聚合物”，指以前不是多陰離子聚合物，由合適的衍生化反應(yīng)物轉(zhuǎn)變?yōu)槎嚓庪x子聚合物。衍生反應(yīng)的例子有羧基的羧甲基化反應(yīng)、琥珀酰化反應(yīng)、或馬來?；磻?yīng)；硫酸鹽/磺酸鹽的硫酸化反應(yīng)/磺化反應(yīng)/亞磺化反應(yīng)(sulfinilation);磷酸鹽/膦酸鹽的磷化反應(yīng)/磷?；磻?yīng)。并非打算以任何方式限制本發(fā)明的范圍，有用的典型多陰離子聚合物包括陰離子植物多糖類、海藻多糖類和內(nèi)源性多糖類；半合成和全合成多陰離子聚合物。天然多陰離子聚合物可以是植物的和海藻的多糖類如海藻酸鹽、瓊脂、吉蘭糖膠、印度樹膠、卡拉亞膠、黃耆膠、韋蘭膠(welan gum)、黃原膠、κ-、ι-和λ -角叉菜膠、硫酸木甘露聚糖、巖藻多糖和巖藻半乳聚糖(fucogalactan)。其它天然多陰離子聚合物可以是內(nèi)源性多糖，如透明質(zhì)酸鹽、交聯(lián)透明質(zhì)酸鹽及其它葡糖胺多糖，例如肝素、超硫酸化肝素和經(jīng)修飾的肝素，如超硫酸化肝素、速避凝(fraxiparin)、磺達(dá)肝癸素(fondaparin)、艾卓肝素(idraparin)、硫酸軟骨素A、B和C,及K5衍生物。合適的透明質(zhì)酸鹽(hyaluronate,又名hyaluranan (HA))可以是動(dòng)物或微生物來源的，其分子量(MW)在5，OOOkDa至IOMDa范圍內(nèi)。半合成的多陰離子聚合物可以是羧甲基化多糖，如羧甲基纖維素、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、羧甲基殼聚糖、羧甲基甲殼素；硫酸化多糖，如硫酸鼠李多糖(rhamnansulfate)、硫酸葡聚糖、硫酸纖維素、硫代殼聚糖、硫酸凝膠多糖、硫酸羅望子膠(GP4324)，硫酸槐樹豆膠(GP4327)，戊聚糖多硫酸酯(PPS);及磷酸多糖，如磷酸纖維素和磷酸殼聚糖。 半合成的多陰離子聚合物也可以是HA衍生物，如Fidia公司的HA衍生物；或硫醇化多糖類，如硫醇化維素、硫醇化海藻酸鹽、硫醇化殼聚糖、來自ThioMatrix-Green RiverPolymers GmbH(Insbruck, Austria)的硫醇化透明質(zhì)酸鹽，等等。合成的多陰離子聚合物可以是聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯，它們的線性和交聯(lián)均聚物和共聚物，如丙烯酸酯/丙烯酰胺類、丙烯酸酯/alchyl C10-C30丙烯酸酯類、丙稀酸酷 / 辛基丙稀酸胺類、Noveon-Lubrizol 出產(chǎn)的 Carbopol 、Carbomer 和 Pemulen 、丁基-聚丙烯酸、聚(丙烯酸酯-共-丙烯酰胺丙磺酸酯)、聚(丙烯酸酯-共-丙烯基磺酸酯)和聚(丙烯酸酯-共-丙烯基苯磺酸酯)共聚物；甲基丙烯醚/馬來酸和其它馬來酸鹽(酯)共聚物，又名“polymaleates”,如 Gantrez 型(ISP Corp.);另外，如 US2010172861 或US2003021793所描述的；以及聚(4-苯乙烯磺酸鈉)、Y_ART_4、蘇拉明、硫醇化卡波姆、硫醇化聚(甲基)丙烯酸，等等。術(shù)語“多陰離子聚合物”還包括陰離子無機(jī)聚合物，如多磷酸鹽(酯)；或如W02002/077036所公開的重組聚合物。為本發(fā)明目的所用的優(yōu)選多陰離子聚合物是線性和交聯(lián)透明質(zhì)酸鹽(酯)、海藻酸鹽(酯)、線性和交聯(lián)聚丙烯酸酯和多馬來酸鹽(酯)。
按照本發(fā)明所使用的多陰離子聚合物，其分子量> 5000Da ;和/或陰離子密度為
0.l-18meq/g,較佳為 l_14meq/g。為本發(fā)明目的所用的亞精胺(N-(3-氨基丙基)_1，4- 丁二胺，或下文稱作“Spd”)是分子式為NH2(CH2)3NH(CH2)4NH2的物質(zhì)本身或其鹽，可適用于作合成原料，最好以干品計(jì)純度> 99%。本發(fā)明的超分子復(fù)合物通過酸堿交換進(jìn)行制備，例如，通過多陰離子聚合物鹽(典型的為鈉鹽)與亞精胺鹽(如3HC1)結(jié)合，或通過酸形式的多陰離子聚合物與亞精胺游離堿
結(jié)合 復(fù)合物中多陰離子聚合物中多余的陰離子當(dāng)量可以酸的形式存在，或以與諸如堿金屬離子或堿土金屬離子(如Na、K、L1、Ca和Mg)或胺類(如NH4+、一、二和三乙醇胺、緩血酸胺、異丙胺、賴氨酸、乙基環(huán)胺如哌嗪等)部分中和的形式存在。多陰離子聚合物與亞精胺的結(jié)合可在溶劑化狀態(tài)中進(jìn)行，較佳為在水中和/或水溶性溶劑(如低級醇等)中進(jìn)行。這樣形成的超分子復(fù)合物可通過諸如冷凍干燥、噴霧干燥、真空干燥等進(jìn)行干燥；或直接以溶液形式使用，只要溶劑是生理學(xué)上可接受的并與所需的終端用途相容。在一個(gè)實(shí)施方案中，在用于草藥制造的罐式混合器中直接混合一種或幾種多陰離子聚合物和亞精胺，形成超分子復(fù)合物。 例如，通過將反應(yīng)物的水溶液任選地與所選擇的助溶劑、賦形劑、稀釋劑、載體和佐劑混合來進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的超分子復(fù)合物直接以固體狀態(tài)進(jìn)行制備，例如，將亞精胺溶液噴霧到聚合物上，或者混合或研磨干的或部分濕的各組分，及諸如此類的方法。不論所使用的方法如何，獲得的超分子復(fù)合物均可與其它賦形劑、稀釋劑、載體和佐劑混合，制成適合于組織修復(fù)和維護(hù)的組合物。本發(fā)明的超分子復(fù)合物在成纖維細(xì)胞及其祖代細(xì)胞上具有高度的再生活性，因此適于制備具有再生/修復(fù)目的的醫(yī)學(xué)和美容組合物。按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供通過刺激/增強(qiáng)細(xì)胞增殖而使結(jié)締組織再生的組合物和方法。本說明書中所用的術(shù)語“結(jié)締組織”或“CT”，包括“適當(dāng)?shù)腃T”和“特定的CT”，后
者包括諸如軟骨、骨和脂肪組織等亞型。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于再生或修復(fù)結(jié)締組織和基于成纖維細(xì)胞的組織的包含所述超分子復(fù)合物的醫(yī)學(xué)或美容組合物。在幾個(gè)分化型實(shí)施方案中，給予本發(fā)明的組合物以改善衰老或修復(fù)受損組織，包括:-陰道粘膜，即婦科學(xué)用于治療陰道萎縮及相關(guān)疾病，如陰道干燥和性交困難；-尿道粘膜，即泌尿科用于治療女性間質(zhì)性膀胱炎、或男性間質(zhì)性膀胱炎(前列腺炎)、尿道瘺和感應(yīng)性膀胱炎；-眼，即眼科學(xué)用于治療角膜損傷和角膜結(jié)膜炎干燥(干眼癥)；-耳、喉、鼻，即耳鼻喉科用于治療耳炎、鼓膜受損、咽喉炎、吞咽困難、鼻竇手術(shù)后及鼻出血；- 口腔粘膜，即口腔學(xué)用于治療口腔炎、口內(nèi)潰瘍，及口腔干燥、口干和/或干燥綜合癥(Sjogren，s syndrome)；
-齒銀和牙周，即牙周病學(xué)上用于治療齒銀炎/牙周炎；-胃與十二指腸、腸和肛腸粘膜，即胃腸病學(xué)上用于治療消化性潰瘍、胃腸道瘺管、憩室炎、結(jié)腸直腸炎和皸裂；-皮膚和附件衰老，即在美容和皮膚病學(xué)上用于治療皺紋、妊娠紋、皮膚創(chuàng)傷和老年性脫發(fā)；-真皮和皮下層，即美容醫(yī)學(xué)上用皮膚填充劑治療美學(xué)缺陷；-滑液和關(guān)節(jié)組織，即骨科學(xué)上用于治療骨關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)損傷；-小泡肺，即肺科用于治療肺氣腫、呼吸窘迫綜合癥和早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育異常。本發(fā)明的組合物可包含103_107eq/eq比例的超分子復(fù)合物，其量為組合物總量的約0.01%至約10%w/w ;及10_102eq/eq比例的超分子復(fù)合物，其量為組合物總量的約
0.0001% 至約 10%w/wo本發(fā)明的組合物較佳設(shè)計(jì)為每單位劑量提供亞精胺的量約10 μ mol至0.1nmol,更佳為每單位劑量約Iymol至Inmol,甚至更佳為每單位劑量約IOOnmol至lOnmol。在免沖洗組合物中推薦低劑量水平，其長時(shí)間接觸足以釋放治療量的亞精胺到靶組織上。而在清洗組合物或其他短時(shí)間接觸的組合物中推薦較高的劑量水平，以提供足夠的亞精胺水平來促進(jìn)組織再生。治療量和治療時(shí)間應(yīng)根據(jù)靶組織和患者的病情加以確定，典型的為從30天到60或更多天，直至達(dá)到緩解，然后可不限期地停用、逐漸減少或減少。

值得注意的是，本發(fā)明的組合物不同于偶爾包含各自混合進(jìn)去的多陰離子聚合物和亞精胺的組合物(如果有的話)，因此它們可能不或只是部分產(chǎn)生相應(yīng)的超分子復(fù)合物。為了提供較好的利益/風(fēng)險(xiǎn)比，可按已知技術(shù)與生理學(xué)上可接受的成分和載體(如那些INC1-CTFA Annex 93/35/ECC上或藥典中所列出的)，制備本發(fā)明的組合物。液體組合物可具有不同的表現(xiàn)形式，包括凝膠、脂凝膠、氣溶膠、噴霧劑、洗劑、乳狀物、泡沫狀物、乳脂、W/0、Ο/ff或多相乳劑、粘膜粘著劑、貼片等，伴同合適的賦形劑、載體或推進(jìn)劑。婦科用組合物可以設(shè)計(jì)成栓劑、胚珠、陰道片、一次性涂抹器、子宮帽、栓劑、棉塞、植入物如環(huán)等。這些組合物可包裝在陰道塞藥器中，如一次性涂抹器(Lam印last, Italy),或可壓擠的長頸管，如Effik SA(Meudon-La-Fort, France)銷售的5ml_Geliofil陰道凝膠、噴霧劑、泡沫狀物，等等。泌尿科用組合物可以設(shè)計(jì)成包含HA-和/或硫酸軟骨素-亞精胺復(fù)合物滅菌溶液的滴注器。眼科用組合物必須與眼組織相容，如多劑量或一次性包裝的單次使用滅菌滴眼液?？谇徽衬び媒M合物可以很多方式配制，如按ADAA3DR = Guide to DentalTherapeutics, 4th Ed.’，配制成例如漱口液、口服溶液劑、噴霧劑、薄膜凝膠、牙膏、牙粉、牙科片劑、乳脂和凝膠、口香糖、咀嚼片和糖果、凝膠、薄膜、凝膠薄膜、顆粒劑、糊劑、可分散粉末，等等，直接或通過外部器械施用于口腔。

用作皮膚填充料或在透明質(zhì)酸補(bǔ)充(viscosupplementation)上使用的組合物應(yīng)包裝成滅菌裝置。皮膚填充料的容積可為0.5至2ml，細(xì)針狀，如30G、31G和33G ;而透明質(zhì)酸補(bǔ)充裝置可填充于0.5-50ml的注射器或小瓶中，較佳為與較大針頭(如27G)連接的1-1Oml注射器或小瓶。這樣施用的較佳超分子復(fù)合物最好是交聯(lián)HA(HAxx)和亞精胺在緩沖滅菌水中所形成，最終濃度為0.2to2%w/w，粘度為500至8000cP。用作美容填充料的復(fù)合物可以是將亞精胺或其鹽與特別制備的HAxx或與市售HAxx反應(yīng)而制成。在美容醫(yī)學(xué)方面，市售HAxx 的例子為 Artz/Supartz、Healon、Hyalgan、Ostenil、Viscoseal、Orthovisc、Elevess、Adant> Arthrum H、Hyalart、Hyalubrix、Replasyn>Synvisc Hylan G-F 20、Durolane、BioHy> Arthrease 或 Orthovisc ;在透明質(zhì)酸補(bǔ)充上的例子為 Juve Ii ft、Resti lane、Restylane touch、Per lane、Juvederm、Hyalaf orm> Rof i Ian >Prevelle、Puragen>Macrolane、Elevess、Belotero 和 Teosyal。特別的HAxx制備在于將線性HA與交聯(lián)劑(如BDDE (丁二醇縮水甘油醚)、DVS ( 二乙烯砜)、DEO (1，2, 7, 8 二環(huán)氧辛燒)、或ΒΟΗ (p-苯二乙基碳二亞胺(p-phenylenebisetheyl carbodiimide))在溫和加熱條件下進(jìn)行反應(yīng)。所得的物質(zhì)進(jìn)一步加工，即洗漆、稀釋、緩沖和包裝到一次性注射器中，最后用蒸汽循環(huán)或Y-射線進(jìn)行滅菌。皮膚填充料可用于嘴唇、皺褶、臉部輪廓改造、臉頰(chick)和下巴手術(shù)、皺紋、眉間皺紋和口腔結(jié)合處、雞爪(crow’s feet)、痤瘡和創(chuàng)傷后、軟組織問題、乳房和形體再造或鼻整形術(shù)后。注射用滅菌工具還可包含助劑，如麻醉劑、鎮(zhèn)痛劑、殺菌劑、抗病毒劑、肌肉松弛齊U、鹽類、緩沖劑和稀釋劑。婦科用組合物可包含性激素如低劑量雌激素、雌激素-雄激素前體、雄激素，和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)。典型的雌激素為17β-雌二醇和酯、17α-雌二醇和酯、雌三醇和酯、雌酮和酯、硫酸雌酮、結(jié)合雌激素如Premarin (Wyeth-Ayerst)和Cenestin (Duramed),或酯化雌激素如Estratab (Solvay)、馬烯雌酮和酯、17 α -炔雌烯醇和酯。其它雌激素包括雌呋酯、炔雌醚、雌醚醇甲醚、和植物雌激素樣雌馬酚和腸內(nèi)酯。較佳的雌激素為17 β-雌二醇，1-25 μ g (局部用)和1-0.1mg (口服)。典型的雌激素-雄激素前體為脫氫表雄酮(DHEA)和5-雄烯二醇，例如，DHEA 2.5_100mg。典型的雄激素為雄烯二酮、雄-5-烯-3 β，17 α - 二醇、4-雄烯二醇、雄酮、表睪酮、睪酮和甲雄烯二醇。本發(fā)明的組合物可包括抗感染劑(包括抗生素、抗真菌劑、抗病毒劑、殺微生物劑等)。本發(fā)明的組合物中可加入一些添加成分。例子包括(但不限于)抗炎藥、免疫抑制劑、緩沖劑、植物或海藻提取物、抗組胺藥、抗氧化劑、收斂劑、芳香劑、染料、維生素、防曬劑、除臭劑、防腐劑，及其它常用的成分。本發(fā)明的其它組合物同樣可包含本領(lǐng)域技術(shù)人員可用常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)選擇的各種補(bǔ)充成分。
實(shí)施例實(shí)施例1-6和比較例1-軺分子復(fù)合物HA-SDd和成纖維細(xì)朐增葙通過Spd.3HC1 (Sigma-Aldrich)水溶液與HA鈉水溶液(眼科用級別，Bioiberica, Barcelona, Spain) 的反應(yīng)來制備含陰離子當(dāng)量比(HA 3meq/g)和來自Spd的陰離子當(dāng)量(3eq./mol)的超分子復(fù)合物HA-Spd,得到 10:1、IO2:1、IO3:1、IO4:1、IO5:1eq/eq系列復(fù)合物的0.l%w/v水溶液。
對這些超分子復(fù)合物進(jìn)行試驗(yàn)以評估它們對人成纖維細(xì)胞(ATCC-CRL-2703)的刺激作用。將含受試樣品(0.l%w/v)的培養(yǎng)基加到含處于細(xì)胞周期GO相的細(xì)胞的孔中，在37°C和5%C02中使細(xì)胞與各復(fù)合物接觸24和48小時(shí)(培養(yǎng)基每24小時(shí)更換一次)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)進(jìn)行MTT染色，以評估細(xì)胞生存能力和增殖提高率(與未處理的對照細(xì)胞相比)。每一次測定進(jìn)行6個(gè)試驗(yàn)。細(xì)胞與復(fù)合物接觸后用200ml PBS洗滌，然后在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入200 μ I MTT-培養(yǎng)基，于37°C和5%C02中培養(yǎng)4小時(shí)。然后除去MTT-培養(yǎng)基并加入200 μ IMTT溶解液(10%Triton X-100和0.1N HC1，在干燥的異丙醇中)。在旋轉(zhuǎn)盤上振搖20-30分鐘以溶解結(jié)晶并使溶液攪勻，于570nm讀出吸光度；于690nm讀出本底。結(jié)果表示為相對于未處理(對照)細(xì)胞的細(xì)胞增殖百分率，見表I。表權(quán)利要求
1.一種超分子復(fù)合物，由至少一種多陰離子聚合物和亞精胺形成，其陰離子當(dāng)量和陽離子當(dāng)量的比例為10:1至IO7: leq/eq，所述超分子復(fù)合物的各成分緊密混合，這些成分之間沒有任何共價(jià)鍵。
2.如權(quán)利要求1所述的超分子復(fù)合物，其中所述比例為10:1至IO7:leq/eq。
3.如權(quán)利要求1所述的超分子復(fù)合物，其中所述多陰離子聚合物為天然陰離子植物多糖類、海藻多糖類或內(nèi)源性多糖類；半合成多陰離子聚合物；或全合成多陰離子聚合物，以及它們的混合物。
4.如權(quán)利要求3所述的超分子復(fù)合物，其中所述植物_、海藻-或內(nèi)源性多糖選自海藻酸鹽、瓊脂、吉蘭糖膠、印度樹膠、卡拉亞膠、黃耆膠、蘭膠、黃原膠、角叉菜膠、硫酸木甘露聚糖、巖藻多糖和巖藻半乳聚糖，以及線性和交聯(lián)透明質(zhì)酸鹽。
5.如權(quán)利要求3所述的超分子復(fù)合物，其中所述半合成多陰離子聚合物選自羧甲基纖維素、交聯(lián)焦糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、羧甲基殼聚糖、羧甲基殼聚糖、線性或交聯(lián)透明質(zhì)酸衍生物；硫酸鼠李多糖、硫酸葡聚糖、硫酸纖維素、硫酸凝膠多糖和磷酸殼聚糖。
6.如權(quán)利要求3所述的超分子復(fù)合物，其中所述全合成多陰離子聚合物選自線性或交聯(lián)的均聚物或共聚物丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、聚卡波菲爾、羧乙烯聚合物、馬來酸酐共聚物“多馬來酸鹽”及硫醇化聚丙烯酸酯。
7.用于受損或衰老結(jié)締組織維護(hù)或修復(fù)提供成纖維細(xì)胞增殖的包含權(quán)利要求1-6之一所述超分子復(fù)合物的醫(yī)學(xué)/美容組合物，其中所述結(jié)締組織選自陰道粘膜、尿道粘膜、目艮、耳、喉、鼻粘膜、口腔粘膜、齒齦和牙周、胃腸道粘膜、衰老皮膚和附件、真皮和皮下層、滑液和關(guān)節(jié)組織及齒槽粘膜。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，用于婦科學(xué)治療陰道萎縮、陰道干燥和性交困難。
9.如權(quán)利要求7所述的組合物，用于泌尿科治療間質(zhì)性膀胱炎、前列腺炎、尿道瘺管和感應(yīng)性膀胱炎。
10.如權(quán)利要求7所述的組合物，用于眼科治療角膜受損和干眼癥。
11.如權(quán)利要求7所述的組合物，用于耳鼻喉科治療耳炎、鼓膜受損、咽喉炎、吞咽困難、鼻竇炎手術(shù)后和鼻出血。
12.如權(quán)利要求7所述的組合物，用于口腔科治療口腔炎、口腔潰瘍和口腔干燥。
13.如權(quán)利要求7所述的組合物，用于牙周病學(xué)治療齒齦炎和牙周炎。
14.如權(quán)利要求7所述的組合物，用于胃腸病學(xué)治療消化性潰瘍、胃腸道瘺管、結(jié)腸直腸炎和皸裂。
15.如權(quán)利要求7所述的組合物，用于美容和皮膚醫(yī)學(xué)治療皺紋、妊娠紋、皮膚創(chuàng)傷和老年性脫發(fā)。
16.如權(quán)利要求7所述的組合物，用于美容醫(yī)學(xué)通過皮膚充填治療美容缺陷。
17.如權(quán)利要求7所述的組合物，用于骨科學(xué)上治療骨關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)損傷。
18.如權(quán)利要求7所述的組合物，用于肺科治療肺氣腫、呼吸窘迫綜合癥和早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育異常。
19.如權(quán)利要求1-18之一所述的組合物，包含多陰離子聚合物和亞精胺比例^ 10: leq/eq的超分子復(fù)合物，每單位劑量亞精胺的量為I至0.001 μ mol，通過局部或粘膜內(nèi)給予。
20.如權(quán)利要求1-18之一所述的組合物，包含多陰離子聚合物和亞精胺比例≥ 10: leq/eq的超分子復(fù)合物,每個(gè)滅菌單位劑量亞精胺的量為I至0.001 μ mol,通過滴注或局部注射給予。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由多陰離子聚合物和亞精胺形成的超分子復(fù)合物，其陰離子當(dāng)量和陽離子當(dāng)量的比例為101:1至107:1eq/eq，更佳為102:1至104:1eq/eq，其各成分通過非共價(jià)、離子相互作用連接。所述超分子復(fù)合物的特征為有效刺激成纖維細(xì)胞增殖。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明超分子復(fù)合物的醫(yī)學(xué)/美容組合物，該組合物用于受損和衰老狀態(tài)結(jié)締組織和粘膜的營養(yǎng)、維護(hù)、再生和修復(fù)。
文檔編號A61K31/132GK103153293SQ201180047745
公開日2013年6月12日 申請日期2011年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月4日
發(fā)明者C·吉賽爾伯蒂 申請人:體恤醫(yī)藥公司