專利名稱：具有抗菌和創(chuàng)傷愈合活性的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于銀和透明質(zhì)酸的組合物、包含所述組合物的藥物制劑、它們?cè)谥委熎つw損傷和創(chuàng)傷中的應(yīng)用及包含所述組合物的裝置。
背景技術(shù)：
通過應(yīng)用醫(yī)療裝置以幫助創(chuàng)傷愈合、促進(jìn)血管再生、吸收滲出物，并且在必要時(shí)發(fā)揮抗菌/殺菌作用，從而處理各種原因的急性或慢性皮膚損傷。通常，滲出物為發(fā)炎組織中毛細(xì)血管滲透性增加的結(jié)果。滲出物具有限制病理進(jìn)程、防止微生物的擴(kuò)散和阻礙可能的危險(xiǎn)抗原通過免疫機(jī)制發(fā)揮作用的功能。相反，慢性損傷中，滲出物以反常的方式產(chǎn)生，并通過破壞生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)及抑制細(xì)胞增殖而決定了對(duì)組織修復(fù)過程的阻塞。臨床上，高滲出物可決定病灶周圍的皮膚的浸潰，并促進(jìn)通過，特別是細(xì)菌物種大腸桿菌(Escherichia coli)、綠膿假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、金黃色葡萄球菌(Staphilococcus aureus)及通過例如白色念珠菌(Candida albicans)的真菌所造成的感染。此外，滲出物的高產(chǎn)出造成不停替換創(chuàng)傷敷料的需要。在這些情況下，不應(yīng)低估由于對(duì)健康護(hù)理的持續(xù)需要而看到他/她的生活質(zhì)量被惡化的患者所感到的不適和健康費(fèi)用的隨之增加?，F(xiàn)在，可商購許多包含抗菌劑的裝置，并且這些裝置根據(jù)它們旨在的應(yīng)用具有不同的特性。其它裝置中，應(yīng)提及基于聚氨基甲酸酯和水狀膠質(zhì)(Contreef)或基于親水性 纖維(Aquacel Ag)的粘性的或非粘性的泡沫、多層聚乙烯網(wǎng){AeiictKii')、包含吸收劑粉
末的紗布。這些產(chǎn)品特征為吸收劑聚合物支架和金屬，特別是銀。銀的抗菌性質(zhì)是公知的(Fraser, J.F等，ANZ J.Surg.2004，74，139-212)，并通常涉及離子銀的氧化形式。銀抑制組成細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)蛋白的合成，從而防止細(xì)菌的形成，并結(jié)合到細(xì)菌DNA的酶蛋白上，從而擾亂它的功能。然而，這樣的結(jié)合以非特異性方式發(fā)生，即銀同時(shí)作用于創(chuàng)傷中存在的細(xì)菌壁上和周圍的皮膚/真皮細(xì)胞上，造成銀對(duì)受傷患者的毒性。事實(shí)上，銀抑制角化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(真皮和表皮的基本組分)的增殖，減慢應(yīng)用它的創(chuàng)面床的再生，這對(duì)損傷的完全愈合是不利的，由于一些對(duì)角化細(xì)胞培養(yǎng)物的體外檢測(cè)的結(jié)果，一些人甚至建議避免使用銀類裝置(Lam, P.K等，Br.J.Biomed.Sc1., 2004, 61, 125-127)。此外，主要是在長(zhǎng)期應(yīng)用時(shí)，銀為光敏劑，確切地說這通常在褥瘡、燒傷或緩慢愈合的傷口的情況下發(fā)生(“慢性接觸銀或銀鹽，Patty’s Industrial Hygiene and Toxicolog’y”,卷 2, G.D.Clayton, F.E.Clayton, Eds.ffiley-1nterscience,紐約，第三版，1981,1881 1894 頁)。透明質(zhì)酸(HA)為雜多糖，即可具有可具有寬范圍的分子量的聚合物，通常與不同生物效應(yīng)相關(guān)。HA生物效應(yīng)的多重性是公知的，并主要與它的化學(xué)性質(zhì)相關(guān)。
高M(jìn)W部分(百萬道爾頓的數(shù)量級(jí))具有非常高的粘性，并具體用于眼科手術(shù)中，也用于對(duì)于手術(shù)和護(hù)膚目的軟組織填充的特定情況下；相反，其對(duì)傷口愈合的效果有很強(qiáng)的爭(zhēng)議性，以至于一些作者證明高平均MW的HA對(duì)細(xì)胞增殖具有非常積極的效果，而另一些則強(qiáng)調(diào)其具有完全相反的效果。中間分子量部分(500 750kDa) (Brun 等，OsteoarthritisCartilage, 2003, 11，208-16)通常在骨關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)疾病中用作粘彈性補(bǔ)充劑。因?yàn)樗鼈兛僧a(chǎn)生具有與滑液非常相似的粘性的溶液，因此事實(shí)上這些部分發(fā)揮了機(jī)械潤(rùn)滑作用。最后，低分子量HA (低聚HA，通常意味著具有I至IOkDa之間的平均麗)具有顯著的血管生成作用；因而尤其促進(jìn)應(yīng)用它的組織的血管再生，以促進(jìn)傷口愈合。此外，已知低分子量HA具有刺激細(xì)胞遷移和激活成纖維細(xì)胞遷移的能力，這顯然對(duì)修復(fù)過程很重要(West等，Science, 1985，228，1324-6 ;Deed等，Int.J.Cancer, 1997，71，251-6)。由于這些原因，低分子量HA被用作許多具有傷口愈合作用的產(chǎn)品和裝置的組分。本發(fā)明的一個(gè)目的為提供比現(xiàn)在可用的用于治療皮膚損傷的那些組合物更有效和更小毒性的用于創(chuàng)傷敷料和傷口愈合的組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的為使對(duì)組織再生的抑制效應(yīng)和對(duì)治療的組織的毒性最小化的同時(shí)，滿足具有強(qiáng)的抗微生物/抗真菌活性劑的敷料的臨床需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了包含透明質(zhì)酸和銀的組合物，其中，所述透明質(zhì)酸具有130至230Kda之間的重均分子量，并且其中，銀具有膠狀金屬形式或具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式。本發(fā)明還提供了包含所述組合物和至少一種藥學(xué)可接受的賦形劑的藥物制劑。同樣公開了所述組合物作為尤其用于對(duì)表面皮膚損傷和/或小腔皮膚損傷和/或創(chuàng)傷的局部治療的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用于將適用于皮膚敷用的干燥噴劑、泡沫或親水性凝膠的形式的所述組合物配藥的裝置。


圖1 顯示了在具有 5000 至 IOOOODa (樣品 i)至 I, 500，000 至 3，200，OOODa (樣品
V)范圍內(nèi)的不同重均分子量部分的HA的存在下培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞的體外細(xì)胞增殖的評(píng)估(實(shí)施例1)。圖2顯示了具有不同重均分子量部分，即5000至IOOOODa (樣品i)、10，000至15，OOODa (樣品ii)和200，OOODa (樣品iii)的HA對(duì)纖連蛋白的表達(dá)的影響。圖3顯示了具有不同重均分子量部分，即5000至IOOOODa (樣品i)、10，000至15，OOODa (樣品ii)和200，OOODa (樣品iii)的HA對(duì)I型膠原蛋白的表達(dá)的影響。圖4顯示了在5mg/ml和30mg/ml的濃度培養(yǎng)3天或5天后，與對(duì)照及包含膠狀金屬銀而不包含透明質(zhì)酸的可商購的制劑(C)相比，包含膠狀金屬銀(A)和微粉化金屬銀(B)的本發(fā)明的組合物對(duì)健康的成纖維細(xì)胞增殖的影響。圖5顯示了組合物A至C對(duì)耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)細(xì)菌的生長(zhǎng)的活性。
具體實(shí)施例方式如文中使用，術(shù)語“重均分子量”按照“特性粘度”的方法(Terbo j eVi ch等，Carbohydr, Res., 1986, 363-377)計(jì)算。如文中使用，“海綿狀結(jié)構(gòu)”是指具有開室和/或閉室結(jié)構(gòu)及5m2/g或更高的表面面積的完全多孔的材料。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含透明質(zhì)酸和銀的組合物，其中，透明質(zhì)酸具有130至230Kda的重均分子量，并且其中銀具有膠狀金屬形式或具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式。文中公開的組合物促進(jìn)各種(急性的、慢性的、各種病因的潰爛、燒傷、疼痛)的損傷的愈合，消除細(xì)菌和/或真菌感染，并促進(jìn)受損組織的愈合。如文中公開，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過包含具有明確限定的重均分子量(MW)的透明質(zhì)酸的組合物來刺激人成纖維細(xì)胞增殖、造成膠原蛋白和纖連蛋白沉積、并防止銀在這些細(xì)胞上產(chǎn)生損傷，從而獲得益處。本領(lǐng)域中已知的組合物的抗菌活性是通過銀來發(fā)揮作用的，所述銀可以鹽(例如硝酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽和其它鹽，可購自例如Sigma Aldrich);或膠狀金屬，即與改善它的穩(wěn)定性的小蛋白相連；或金屬形式的形式商購獲得。各種類型的金屬銀中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)特別合適的微粉化金屬銀具有以下特征:-平均顆粒尺寸2至18微米，優(yōu)選10微米-具有顯著增加的表面積(>5m2/g)的高多孔性“海綿狀”(SL)微結(jié)構(gòu)；-高純度(優(yōu)選 >99.5%)；(下文，“海綿狀微粉化金屬銀”)。如被下文的試驗(yàn)結(jié)果所證明的那樣，所述獨(dú)特的“海綿狀”多孔結(jié)構(gòu)促進(jìn)在創(chuàng)面床中Ag離子(Ag+)增加的速釋和緩釋，導(dǎo)致與最通常使用的銀的形式相比，提高了抗微生物和抗真菌活性。顯而易見地，本發(fā)明的組合物中包含的“海綿狀”微粉化金屬銀不使皮膚和衣服染色，而且在暴露于太陽光后，當(dāng)存在滲出物時(shí)不使創(chuàng)傷被染成深色，并且在制備根據(jù)本發(fā)明的藥物形式時(shí)更易于處理。微型顆粒尺寸使“海綿狀”微粉化金屬銀易于與其它組分混合。相反，膠狀金屬銀必須首先經(jīng)歷微粉化過程，尤其是在期望以噴霧的形式傳輸時(shí)，以防止由于形成粉末塊而產(chǎn)生的堵塞。雖然優(yōu)選“海綿狀”微粉化金屬銀，用于本發(fā)明的組合物的銀可為被發(fā)現(xiàn)具有相當(dāng)?shù)目咕?抗微生物活性的膠狀或“海綿狀”微粉化金屬銀。透明質(zhì)酸(HA)為由D-葡糖醛酸和N-乙?；?D-葡糖胺殘基交替組成的直鏈雜多糖，根據(jù)提取的來源或所用的制備方法，所述透明質(zhì)酸可具有400和3X IO6Da之間的重均分子量。事實(shí)上，可通過例如從雞冠花中提取(EP138572B1)、通過發(fā)酵或合成方法，獲得透明質(zhì)酸。如已經(jīng)所述，已知HA在體內(nèi)發(fā)揮多重作用，從例如皮膚、腱、肌肉和軟骨的許多組織的細(xì)胞的機(jī)械支撐，到組織的水化和關(guān)節(jié)的潤(rùn)滑。此外，已知HA通過它的膜受體CD44能夠調(diào)節(jié)與細(xì)胞生理和生物學(xué)相關(guān)的許多不同的過程，例如細(xì)胞增殖、遷移、分化和血管再生。
這些效果中的每種基本上都可歸因于具有不同分子量的HA的部分，特別是具有低分子量(低聚HA)的HA部分的組織修復(fù)活性特別明顯，并且隨分子量增加而減小。相反，幾個(gè)檢測(cè)中，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)具有根據(jù)“特性粘度”方法(Terbo jevich等，Carbohydr.Res.，1986，363-377)計(jì)算的130至230kDa范圍內(nèi)的重均MW，因而具有比那些已知具有創(chuàng)傷愈合活性的顯著更高的MW的HA的特定部分對(duì)人成纖維細(xì)胞增殖具有非同尋常的效力。此夕卜，發(fā)現(xiàn)具有130至230kDa之間的重均分子量的HA令人驚奇地改善了與它結(jié)合的銀(膠狀金屬形式或“海綿狀”微粉化金屬形式)的抗微生物/抗真菌活性，從而顯著地減小了銀的細(xì)胞毒性。合適的檢測(cè)后，選擇這些HA部分用于本發(fā)明的目標(biāo)組合物，通過文中說明的試驗(yàn)證明了它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)治療中抗病原體的效果，并使抗人成纖維細(xì)胞的毒性減小，同時(shí)伴隨著創(chuàng)傷愈合活性的提高。顯著地，用在本發(fā)明的組合物中的HA可源自提取的、發(fā)酵的(從鏈球菌屬)或生物合成(從芽孢桿菌屬)的來源，優(yōu)選地從發(fā)酵和生物合成的來源，并具有130至230kDa之間、優(yōu)選145至210kDa之間、甚至更優(yōu)選160至200kDa之間的重均MW ;后者下文簡(jiǎn)稱定義為160至200kDa重均MW HA。它可從許多能夠提供具有關(guān)于MW的所需規(guī)格的HA的公司(例如 Lifecore Biomedical、QP 公司、Seikagaku、Shiseido、Fidia farmaceutici)購得。與預(yù)期相反，發(fā)現(xiàn)具有顯著高于低聚物部分的重均分子量的透明質(zhì)酸部分比低聚物部分對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖具有更強(qiáng)的積極的影響。在特定的檢測(cè)中，與只基于銀的標(biāo)準(zhǔn)組合物相比，包含這些HA的特定部分和銀的組合物顯示出增強(qiáng)的抗菌/抗真菌效力，同樣減小了對(duì)成纖維細(xì)胞的毒性。例如，參照?qǐng)D4第三欄，包含這些HA的特定部分和銀的本發(fā)明的組合物相對(duì)于對(duì)照樣品刺激了成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，而觀察到使用膠體銀而不含HA的對(duì)照中成纖維細(xì)胞的減少，總量低至本發(fā)明的組合物的檢測(cè)中的三分之一。這意味著本發(fā)明的組合物代表本領(lǐng)域水平的明確的和不可預(yù)測(cè)的進(jìn)步，比目前可用于所述皮膚損傷的局部治療的組合物更有效且毒性更小?；谙旅婀_·的實(shí)施例的結(jié)果，意外地發(fā)現(xiàn)包含具有160至200kDa的重均分子量的HA和膠狀或微粉化“海綿狀”金屬銀的本發(fā)明的組合物具有以下令人驚奇的性質(zhì):-具有160至200kDa重均分子量的HA刺激成纖維細(xì)胞增殖的前所未有且顯著的能力；-與膠狀銀或微粉化“海綿狀”金屬銀的存在相關(guān)的抗菌活性，至少與防止通常在感染的創(chuàng)傷中發(fā)現(xiàn)的微生物的常規(guī)治療相當(dāng)；-尤其地，當(dāng)使用微粉化“海綿狀”金屬銀時(shí)，本發(fā)明的組合物比標(biāo)準(zhǔn)抗MRSA治療更有活性，而MRSA特別難于治療；-對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞非常低的毒性或無毒性；-在保持HA刺激成纖維細(xì)胞增殖的能力的同時(shí)，在低于市場(chǎng)上可購的制劑的50%的量的銀的存在下同樣發(fā)揮抗菌活性由于這些原因，本發(fā)明的組合物尤其優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中已知的組合物和目前可購的用于治療皮膚損傷和創(chuàng)傷的組合物，例如源自各種來源(急性、慢性、各種病因的潰爛、燒傷、疼痛)的皮膚損傷和/或創(chuàng)傷。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物中，透明質(zhì)酸具有145至210Kda之間的重均分子量。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物中，透明質(zhì)酸具有160至200Kda之間的重均分子量，并且銀具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物中，具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式銀具有2至18微米之間的平均粒徑和不小于5m2/g的表面面積。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物中，透明質(zhì)酸的濃度為基于所述組合物整體的0.1至2%w/w之間，更優(yōu)選所述組合物整體的0.1至0.5%w/w之間,進(jìn)一步更優(yōu)選所述組合物整體的 0.2%w/w。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物中，膠狀金屬形式的銀或具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式的銀的濃度為所述組合物整體的I至3%w/w之間，更優(yōu)選所述組合物整體的2%w/w。根據(jù)本發(fā)明的組合物可為粉末、溶液或懸浮液形式，從而以各種形式配藥，其中優(yōu)選親水性凝膠、泡沫、干燥噴劑，因?yàn)樗鼈兂尸F(xiàn)一些特定的所需特性。尤其是干燥噴劑和泡沫:-由于它們不需要切割或修整以適應(yīng)創(chuàng)傷，因此不需要特殊的操作而易于應(yīng)用；-敷用時(shí)可避免與創(chuàng)傷的接觸，這樣有助于減少額外的污染原因；-可完全適應(yīng)其敷用的位點(diǎn)，也就是說，表面的、平面的或任何小的成腔的創(chuàng)傷都將從易于均勻分布的干燥噴劑中受益。事實(shí)上，干燥噴劑中存在的透明質(zhì)酸粉末與滲出物接觸立即形成透明凝膠，從而將損傷的腔內(nèi)的濕潤(rùn)度保持在一定程度以促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，同時(shí)使它與周圍環(huán)境分開，防止額外的污染；在深的、洞狀的創(chuàng)傷中，相反，敷用泡沫更有效，泡沫均勻且平坦地填滿整個(gè)創(chuàng)面床，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合劑(透明質(zhì)酸)和抗菌劑(銀)兩者與損傷部分的緊密接觸。-不必須用繃帶覆蓋，具有簡(jiǎn)化包扎再生步驟的優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)于水凝膠的形式，發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷不特別深或并未形成腔且具有很少滲出物的情況下特別有用；實(shí)際上，水凝膠自身提供了對(duì)愈合過程必要的正確的濕潤(rùn)環(huán)境。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含含有透明質(zhì)酸和銀的組合物及至少一種藥學(xué)可接受的賦形劑的藥物制劑，其中，透明質(zhì)酸具有130至230Kda之間的重均分子量，并且其中，銀具有膠狀金屬形式或具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物制劑進(jìn)一步包含選自懸浮劑、載劑和拋射劑中的至少一種賦形劑。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑中，拋射劑選自由異丁烷/正丁烷/丙烷的混合物和正丁烷組成的組中。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑為適于皮膚敷用的干燥噴劑、泡沫或親水性凝膠形式。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑為干燥噴劑形式，作為透明的凝膠覆蓋在損傷的腔上，以促進(jìn)最佳的濕性傷口愈合。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑為干燥噴劑形式，包含0.2%w/w濃度的具有160至200kDa之間的重均分子量的透明質(zhì)酸、2%w/w濃度的具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬銀及作為拋射劑的正丁烷。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑為干燥噴劑形式，包含0.2%w/w濃度的具有160至200kDa之間的重均分子量的透明質(zhì)酸、2%w/w濃度的膠狀金屬銀及作為拋射劑的正丁燒。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑為泡沫形式，包含0.2%w/w濃度的具有160至200kDa之間的重均分子量的透明質(zhì)酸、2%w/w濃度的具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式或膠狀金屬形式的銀及作為拋射劑的異丁烷/正丁烷/丙烷的混合物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑為親水性凝膠形式，包含0.2%w/w濃度的具有160至200kDa之間的重均分子量的透明質(zhì)酸、2%w/w濃度的具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式或膠狀金屬形式的銀及作為拋射劑的異丁烷/正丁烷/丙烷的混合物。在實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及如上面公開的用作藥物的組合物或藥物制劑。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及如上面公開的用于表面和/或小腔皮膚損傷和/或創(chuàng)傷的局部治療中的組合物或藥物制劑。優(yōu)選地，用 于表面和/或小腔皮膚損傷和/或創(chuàng)傷的局部治療中的藥物制劑為干燥噴劑形式，包含0.2%w/w濃度的具有160至200kDa之間的重均分子量的透明質(zhì)酸、2%w/w濃度的具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式的銀及作為拋射劑的正丁烷。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的用于表面和/或小腔皮膚損傷和/或創(chuàng)傷的局部治療中的藥物制劑為干燥噴劑形式，包含0.2%w/w濃度的具有160至200kDa之間的重均分子量的透明質(zhì)酸、2%w/w濃度的膠狀金屬形式的銀及作為拋射劑的正丁烷。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的用于表面和/或小腔皮膚損傷和/或創(chuàng)傷的局部治療中的藥物制劑為泡沫形式，包含0.2%w/w濃度的具有160至200kDa之間的重均分子量的透明質(zhì)酸、2%w/w濃度的具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式或膠狀金屬形式的銀及作為拋射劑的異丁烷/正丁烷/丙烷的混合物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的用于表面和/或小腔皮膚損傷和/或創(chuàng)傷的局部治療中的藥物制劑為親水性凝膠形式，包含0.2%w/w濃度的具有160至200kDa之間的重均分子量的透明質(zhì)酸、2%w/w濃度的具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式或膠狀金屬形式的銀及作為拋射劑的異丁烷/正丁烷/丙烷的混合物。在再一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及治療表面和/或小腔皮膚損傷和/或創(chuàng)傷的方法，包含如上所述的組合物和藥物組合物的局部敷用。在實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于將以上公開的干燥噴劑、用于皮膚敷用的泡沫或親水性凝膠形式的組合物的配藥的裝置。本串請(qǐng)中顯示的全部試驗(yàn)在從人皮膚活組織活檢物中分離的健康成纖維細(xì)胞上進(jìn)行，以便盡可能準(zhǔn)確地復(fù)制敷用最終產(chǎn)品時(shí)所發(fā)現(xiàn)的病理狀況。細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)使用三維材料作為支撐，以準(zhǔn)確地模擬創(chuàng)面床，雖然受損，創(chuàng)面床仍包含較深的真皮層和更表面的表皮層。文中報(bào)道了所用的研究方案和材料。實(shí)驗(yàn)例1:在具有不同的MW的HA的存在下，評(píng)估培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞的體外細(xì)胞增殖?；诒绢I(lǐng)域水平中可用的技術(shù)，制備不同的HA樣品，具體地:1.如EP868437的實(shí)施例1制備具有5，000至10，OOODa之間的重均MW的HA ;i1.如EP868437的實(shí)施例2制備具有10，000至15，OOODa之間的重均MW的HA ;
ii1.具有 160，000 至 200，OOODa 之間的重均 MW 的 HA ;iv.如EP535200的實(shí)施例1制備具有I, 000，OOODa的重均MW的HA ;V.具有1，500，000至3，200，0000&之間的重均麗的擬，丨切3丨1山1.彳\1:丨(]^8110代等，Arthr.Res.Ther.，2009，11，R183)；全部為培養(yǎng)基的lmg/ml的濃度。從人皮膚活檢物中分離健康成纖維細(xì)胞:簡(jiǎn)要地，在添加抗生素的磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌后，從活檢物中去除皮下脂肪組織，并將其切成小條，用分散酶進(jìn)行30分鐘酶消化。處理結(jié)束后，從下面的真皮分離皮膚，用胰蛋白酶消化10分鐘；然后通過離心提取細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng):通過在添加20%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/鏈霉素(P/S)及1%的谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基中接種從而在體外培養(yǎng)細(xì)胞。MTT檢測(cè):這個(gè)檢驗(yàn)定量地測(cè)量培養(yǎng)細(xì)胞中存在的琥珀酸脫氫酶活性；這種只存在于活體細(xì)胞的線粒體中的活性通常被用作檢測(cè)代謝活性、存活率，及因而培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)的標(biāo)記。檢測(cè)是基于通過琥珀酸脫氫酶使唑類染料MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5二苯基四唑溴)從黃色轉(zhuǎn)化到藍(lán)色。分光光度法確定的藍(lán)色染料(甲)的量與細(xì)胞培養(yǎng)物中的存在的琥珀酸脫氫酶成比例，因而與活體細(xì)胞的數(shù)目成比例。將細(xì)胞用0.5mg/ml MTT溶液培養(yǎng)3小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，用提取溶液(90%的異丙醇、10%DMS0)從細(xì)胞中提取染料，并在540/660nm的波長(zhǎng)下顯示。操作過稈:如所 述，用三維培養(yǎng)基和在無紡Hyaffl I(根據(jù)EP618817的實(shí)施例2制備)上精確地接種細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測(cè)。這是當(dāng)意圖模擬體內(nèi)成纖維細(xì)胞增值時(shí)所選擇的步驟，并且在由主要由透明質(zhì)酸和膠原蛋白形成的細(xì)胞外三維基質(zhì)組成的真皮中進(jìn)行，其中插入了皮膚成纖維細(xì)胞。將根據(jù)上述分離的成纖維細(xì)胞在附著到合適的板內(nèi)的無紡材料的小塊上(IXlcm)上接種(60，000)，并保持培養(yǎng)24小時(shí)。然后，將所檢測(cè)的不同的HA樣品加到培養(yǎng)基中，處理3天后，進(jìn)行MTT檢測(cè)以評(píng)估細(xì)胞增殖。對(duì)照由未用HA處理的成纖維細(xì)胞組成。益里:如圖1清楚地顯示，與現(xiàn)有技術(shù)水平中說明的相反，低麗的HA部分不刺激細(xì)胞增殖。相反，160至200kDa重均麗部分具有顯著的增殖活性，而當(dāng)甚至無毒時(shí)大于一百萬的Da的麗導(dǎo)致完全無效。根據(jù)下面的步驟，還通過定量評(píng)估I型膠原蛋白(圖3)和纖連蛋白(圖2)的基因表達(dá)，證明了成纖維細(xì)胞的增殖和活性。如上述分離并培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，并用樣品1、ii和iii處理3天(由于對(duì)細(xì)胞增殖消極的影響，排除其它)；在處理結(jié)束后，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR以評(píng)估I型膠原蛋白和纖連蛋白的基因表達(dá):根據(jù)供應(yīng)商的指導(dǎo)(TRIZ0L試劑，LIFE Techonologies, GIBCO BRL)用“Trizol”方法提取細(xì)胞RNA。簡(jiǎn)要地，通過加入1.0ml的Trizol裂解細(xì)胞，并通過在260nm測(cè)量吸光度量化總RNA。對(duì)于每種將要擴(kuò)增的基因，用Primer3軟件(Roche MolecularDiagnostics, Pleasanton, CA, USA)選擇合適的引物。用 Rotor-gene TM5500 (CorbettResearch, Sydney, Australia)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR評(píng)估基因表達(dá)。結(jié)果總結(jié)于圖2和圖3中:它們證明了與對(duì)照相比，160至200kDa重均麗的HA決定了兩種蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的顯著的上升，這意味著處理的成纖維細(xì)胞能夠建立對(duì)創(chuàng)傷的完全愈合必需的胞外基質(zhì)。結(jié)論:令人驚奇地，160至200kDa的重均MW的HA顯示對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞增殖特別有效的作用。由于這樣的細(xì)胞排除胞外基質(zhì)，這樣的成纖維細(xì)胞可成活，并有代謝活性，因此它們能夠激活損傷皮膚組織的修復(fù)?；谏鲜鲆庀氩坏降慕Y(jié)果，使用市售的產(chǎn)品作為對(duì)照，評(píng)估文中說明的制劑的抗微生物和抗真菌效果。使用通常在感染的創(chuàng)傷中存在的那些微生物:即大腸桿菌、綠膿假單胞桿菌、屎腸球菌(抗萬古霉素)、金黃色葡萄球菌(抗甲氧西林)和白色念珠菌。以粉末形式制備包含膠狀和金屬形式的銀的檢測(cè)劑型，以溶解在試驗(yàn)培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)例2:評(píng)估制劑的抗微生物/抗真菌活性。體外進(jìn)行檢測(cè)，因此以粉末形式制備包含膠狀金屬或微粉化金屬銀的檢測(cè)制劑，以使它們可溶解或懸浮以評(píng)估它們的效力。對(duì)照制劑(C)可以粉末及干燥噴劑的形式商購(Katoxyn*'，Deverge M&M)。制劑A.0.2% 的 160 至 200kDa 的 MW 的 HA 鈉的膠狀金屬銀.4% 的 Syloid244 (賦形劑).輕質(zhì)高嶺土 (賦形劑)足量至100制劑B.0.2% 的 160 至 200kDa 的 MW 的 HA 鈉.2% 的微粉化金屬銀海綿狀(SL) 2% (MicroSiIver BG Pharma).4%Syloid244 (賦形劑).輕質(zhì)高嶺土 (賦形劑)足量至100與由.4.25%膠狀金屬銀.1.5%的過氧化苯甲酰.1%的無水葡 萄糖酸鈣(賦形劑).硅酸鋁(賦形劑)足量至100組成的標(biāo)準(zhǔn)的可商購的組合物(制劑C-Katoxyn)對(duì)照檢驗(yàn)檢測(cè)的微生物:根據(jù)供應(yīng)商的指導(dǎo)制備每種微生物的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)至少48小時(shí)，以獲得豐富的和成活的培養(yǎng)物；通過McFarland等級(jí)大概確定每個(gè)培養(yǎng)物的名字。對(duì)于一些微生物，通過在兩個(gè)100ml TSB樣品(Tryptic Soy Broth;Millipore)中培養(yǎng)而制備包含約IO3和約IO6的CFU兩種檢測(cè)的懸浮液。計(jì)數(shù)接種物，以精確地確定懸浮液在T=O的微生物濃度。制劑樣品:從每種制劑中提取兩個(gè)約Ig的樣品，然后加到包含IO3和IO6CFU的懸浮液中，或僅加到IO3CFU的懸浮液中。培養(yǎng)這樣制備的樣品，并保持持續(xù)的緩慢振蕩和垂直旋轉(zhuǎn)，以使產(chǎn)品與微生物的緊密接觸最大化，并防止粉沫的沉淀現(xiàn)象。培養(yǎng)30分鐘后，提取等分試樣，通過對(duì)包含IO6CFU的樣品的合適的稀釋操作，通過過濾膜技術(shù)進(jìn)行對(duì)懸浮液微生物含量的計(jì)數(shù)。用于過濾的膜子在TSA培養(yǎng)基(Tryptone Soy Agar-Biogenetics)中轉(zhuǎn)移，并培養(yǎng)至少5天。在12小時(shí)和24小時(shí)后，重復(fù)對(duì)檢測(cè)的懸浮液中細(xì)菌含量的計(jì)數(shù)。下面的表格公開了每種檢測(cè)制劑，在不同的接觸時(shí)間后各種微生物的濃度的對(duì)數(shù)減小值。表1-制劑A
權(quán)利要求
1.一種包含透明質(zhì)酸和銀的組合物,其中，透明質(zhì)酸具有130至230Kda之間的重均分子量，并且其中，銀具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式或膠狀金屬形式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，透明質(zhì)酸具有145至210Kda之間的重均分子量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，透明質(zhì)酸具有160至200Kda之間的重均分子量，并且銀具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，透明質(zhì)酸具有160至200Kda之間的重均分子量，并且銀具有膠狀金屬形式。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 3所述的組合物，其中，具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式的銀具有2至18微米之間的平均粒徑和不小于5m2/g的表面面積。
6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其中，透明質(zhì)酸的濃度在所述組合物整體的0.1至2%w/w之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中，透明質(zhì)酸的濃度在所述組合物整體的0.1至0.5%w/w 之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中，透明質(zhì)酸的濃度為所述組合物整體的0.2%w/Wo
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其中，具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式或膠狀金屬形式的銀的濃度在所述組合 物整體的I至3%w/w之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中，銀的濃度為所述組合物整體的2%w/w。
11.一種藥物制劑，包含根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，和至少一種藥學(xué)可接受的賦形劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物制劑，其中，所述至少一種賦形劑選自懸浮劑、載劑和拋射劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物制劑，其中，所述拋射劑選自由異丁烷/正丁烷/丙烷的混合物和正丁烷組成的組中。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物制劑，所述藥物制劑為適于皮膚敷用的干燥噴劑、泡沫或親水性凝膠的形式。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的藥物制劑，所述藥物制劑為干燥噴劑形式，包含0.2%w/w濃度的具有160至200kDa之間的重均分子量的透明質(zhì)酸、2%w/w濃度的具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式的銀和作為拋射劑的正丁烷。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的藥物制劑，所述藥物制劑為干燥噴劑形式，包含0.2%w/w濃度的具有160至200kDa之間的重均分子量的透明質(zhì)酸、2%w/w濃度的膠狀金屬形式的銀和作為拋射劑的正丁烷。
17.根據(jù)權(quán)利要求14 16所述的制劑，所述制劑為干燥噴劑形式，作為透明凝膠覆蓋在損傷的腔上，以促進(jìn)最佳的濕性傷口愈合。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的藥物制劑，所述藥物制劑為泡沫形式，包含0.2%w/w濃度的具有160至200kDa之間的重均分子量的透明質(zhì)酸、2%w/w濃度的具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式或膠狀金屬形式的銀和作為拋射劑的異丁烷/正丁烷/丙烷混合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的藥物制劑，所述藥物制劑為親水性凝膠的形式，包含`0.2%w/w濃度的具有160至200kDa之間的重均分子量的透明質(zhì)酸、2%w/w濃度的具有多孔“海綿狀”結(jié)構(gòu)的微粉化金屬形式或膠狀金屬形式的銀。
20.根據(jù)權(quán)利要求1 10所述的組合物或權(quán)利要求11 19所述的制劑，用作在表面和/或小腔皮膚損傷和/或創(chuàng)傷的局部治療中的藥物。
21.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物制劑，用作在表面和/或小腔皮膚損傷和/或創(chuàng)傷的局部治療中的藥物。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥物制劑，用作在表面和/或小腔皮膚損傷和/或創(chuàng)傷的局部治療中的藥物。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述 的藥物制劑，用作在表面和/或小腔皮膚損傷和/或創(chuàng)傷的局部治療中的藥物。
24.根據(jù)權(quán)利要求19所述的藥物制劑，用作在表面和/或小腔皮膚損傷和/或創(chuàng)傷的局部治療中的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于銀和透明質(zhì)酸的組合物及它們?cè)谔幚砀鞣N來源(急性的慢性的創(chuàng)傷、潰瘍、燒傷等)的皮膚損傷中的應(yīng)用，所述皮膚損傷的主要特征為存在滲出物因而具有高感染風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)A61P17/02GK103249419SQ201180055714
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者喬瓦尼·熱納里, 詹保羅·梅農(nóng), 蘇西·潘菲洛 申請(qǐng)人:菲迪亞醫(yī)藥公司