專利名稱：具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人工模擬抗氧化劑制備技術(shù)領(lǐng)域中的抗氧化酶模擬物，尤其涉及具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體。
背景技術(shù)：
角蛋白是蛋白質(zhì)的一種，在自然界中非常豐富，我國(guó)年產(chǎn)幾十萬(wàn)噸，廣泛存在于人和動(dòng)物的表皮、毛發(fā)、蹄、殼、爪及角等中，但其通常被作為一種環(huán)境污染有機(jī)廢棄物而丟棄。然而，角蛋白作為一種可再生資源，卻具有很大的回收利用價(jià)值。天然角蛋白的加工利用已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史。隨著對(duì)角蛋白的理論研究和應(yīng)用研究的開展，角蛋白已經(jīng)廣泛應(yīng)用于飼料和紡織業(yè)中?；诟叻肿恿康慕堑鞍拙哂泻芨叩臋C(jī)械強(qiáng)度、優(yōu)良的加工性能、可降解性、良好的生物相容性、無(wú)毒和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)外有很多人正在研究利用角蛋白開發(fā)表面活性劑、絮凝劑、可生物降解包裝材料、分離膜、傷口敷料、氨基酸產(chǎn)品、系列保健品和化妝品等。例如以角蛋白為原料制備的表面活化劑可以使假發(fā)表面附著一層和人發(fā)化學(xué)成分相同的角蛋白質(zhì)，使假發(fā)絲變成和人發(fā)一樣具有柔軟、順暢；以角蛋白為原料制備的角蛋白固體纖維或粉末可用于高吸水性材料、賦形劑及具生物相容性的粘彈性填料等的制備中；以羽毛角蛋白粉為原料制備的角蛋白膜具有良好的生物可降解性，可作為藥物載體用于膜劑藥物的制備中。因此，拓展羽毛角蛋白的廢物再利用途徑有著十分重要的意義。超氧陰離子自由基(SuperoxideAnion Free Radical, SAFR ；02"0 是代謝過程中產(chǎn)生的第一個(gè)自由基，而超氧化物歧化酶(SOD)是一類能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，平衡體內(nèi)SAFR的金屬酶。SOD在臨床上可以治療多種疾病，如SOD具有防止再灌注損傷，減輕炎癥反應(yīng)及延緩衰老等作用。天然SOD雖具有優(yōu)異的清除SAFR的性能，但用于臨床領(lǐng)域的SOD酶蛋白尚存在許多問題和缺點(diǎn)，如天然SOD從動(dòng)物的血漿中提取過程復(fù)雜，成本高；在生物體內(nèi)容易失活(體內(nèi)半衰期5 8min)等，均使其藥用價(jià)值受到很大限制，因此制備能消除SAFR的高效、無(wú)毒的模擬酶成為研究的熱點(diǎn)。迄今為止，許多SOD模擬物已經(jīng)被合成和檢測(cè)，如金屬卟啉配合物、大環(huán)金屬配合物、希夫堿金屬配合物等，這些SOD模擬物具有合成方法簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、可大量生產(chǎn)、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，可以很好的克服天然SOD 本身的局限性，已經(jīng)用在抗炎癥，抑制腫瘤生長(zhǎng)，治療心血管疾病等臨床應(yīng)用中。本發(fā)明對(duì)難以重復(fù)溶于水的羽毛角蛋白進(jìn)行處理，進(jìn)一步與金屬離子進(jìn)行結(jié)合， 成功制備了角蛋白銅離子結(jié)合體，用此方法不僅制得了一種具有良好生物相容性和高抗氧化活性的大分子SOD模擬物，而且使羽毛角蛋白達(dá)到了廢物再利用，既得到了一種高效的超氧化物歧化酶模擬物，又可用于有機(jī)廢棄物資源化，保護(hù)環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效、價(jià)格低廉且制備方法簡(jiǎn)單的具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體。為解決上述問題，本發(fā)明所述的具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)
3合體，其特征在于該結(jié)合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結(jié)合而成，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為I : 5 I : 100。如上所述的具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將羽毛角蛋白、Na2S2O3固體放入二次去離子水中，并加入濃度為2mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)PH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液；所述羽毛角蛋白與所述Na2S2O3固體的質(zhì)量比為5 20 10 60 ;所述羽毛角蛋白與所述二次去離子水的質(zhì)量體積比為5 20 : 100 ;所述二次去離子水與所述NaOH溶液的體積比為 100 O.05 ；(2)角蛋白銅離子結(jié)合體的制備將濃度為25mmol/L的Cu (OAc)2溶液與所述可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應(yīng) 12h后，即得一系列角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu);該角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu)在O 4°C條件下避光保存即可；所述Cu(OAc)2溶液與所述可溶性角蛋白(FK)溶液的體積比為 O. 01 O. 20 10。如上所述的具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應(yīng)用，其特征在于所述角蛋白銅離子結(jié)合體的超氧化物歧化酶(SOD)活性為O. 005 O. 12ymol/L，其模擬度為天然SOD酶的68. 3% 683. 3%。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明以羽毛角蛋白為原料，通過堿溶、還原改性得到可溶性角蛋白溶液，再與金屬銅離子復(fù)合，得到角蛋白銅離子結(jié)合體，應(yīng)用于超氧化物歧化酶(SOD)的模擬中，模擬度很高。經(jīng)對(duì)比蛋白銅離子結(jié)合體FK-Cu20、FK-Cu60與FK(可溶性角蛋白)和天然CuZnSOD 的抗SAFR活性(參見圖1)，可知FK的活性很低；FK結(jié)合銅離子后，活性顯著提高，其中，結(jié)合體與天然CuZnSOD相比，模擬度可達(dá)到683. 3%。2、本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)單，原料來(lái)源廣泛，成本低廉，實(shí)現(xiàn)了廢物的有效再利用，有利于環(huán)境保護(hù)。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。圖I為本發(fā)明角蛋白銅離子結(jié)合體與天然CuZnSOD的抗SAFR活性對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體，該結(jié)合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結(jié)合而成，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為1:5。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將IOmg羽毛角蛋白、25mg Na2S2O3固體放入IOOmL二次去離子水中，并加入O. 05mL濃度為2mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白銅離子結(jié)合體的制備將O. OlmL濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應(yīng)12h后，即得角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為I : 5。該角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu)在O 4°C條件下避光保存即可。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應(yīng)用通過氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化學(xué)還原法對(duì)角蛋白銅離子結(jié)合體進(jìn)行超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定，其活性為O. 06ymol/L，具有優(yōu)異的抗SAFR能力， 與天然CuZnSOD相比，模擬度達(dá)到68. 3%。具體測(cè)定方法如下用照度計(jì)控制光強(qiáng)度(4000Lux)。用pH = 7. 80 的 O. 05mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 緩沖溶液配制含3. 4X10_6mol/L核黃素，O. 01mol/L蛋氨酸，4. 66 X 10_5mol/L硝基NBT及不同濃度自由基清除劑的混合液，混合液均用空氣飽和，置于25°C恒溫O. 5hr，每次取3mL混合液于恒定光強(qiáng)度下進(jìn)行光照，測(cè)定加入或不加入配合物時(shí)在560nm處不同光照時(shí)間后(時(shí)間間隔為30s.)溶液的吸光度E，以E對(duì)t作圖，由圖中直線的斜率即可求得吸光度隨時(shí)間的變化量Λ，比較加入配合物前后吸光度隨時(shí)間的變化量Aci和Λ，即可求得NBT還原反應(yīng)受到抑制的百分?jǐn)?shù)(式I)。f%= (Δ0-Δ)/Δ0Χ100%(I)以對(duì)Cm(配合物的濃度)作圖得到一條曲線，通常以抑制百分?jǐn)?shù)f%= 50%的活性物質(zhì)的濃度(Cm)作為I個(gè)SOD活力單位。得到的活性數(shù)據(jù)與相同條件獲得的天然CuZnSOD的活性比較，經(jīng)檢測(cè)，天然 CuZnSOD 的 EC50 為 O. 041 μ mol/L。相比角蛋白(FK)而言，Cu (II)和FK結(jié)合后抗SAFR能力明顯增強(qiáng)，其SOD活性可與天然CuZnSOD相媲美。實(shí)施例2具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體，該結(jié)合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結(jié)合而成，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為I : 20。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將5mg羽毛角蛋白、IOmg Na2S2O3固體放入IOOmL 二次去離子水中，并加入O. 05mL 濃度為2mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白銅離子結(jié)合體的制備將O. 04mL濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應(yīng)12h后，即得角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為I : 20。該角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu)在O 4°C條件下避光保存即可。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應(yīng)用通過氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化學(xué)還原法對(duì)角蛋白銅離子結(jié)合體進(jìn)行超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定(測(cè)定方法同實(shí)施例I)，其活性為O. 018 μ mol/L, 具有優(yōu)異的抗SAFR能力，與天然CuZnSOD相比，模擬度達(dá)到227. 8 %。實(shí)施例3具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體，該結(jié)合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結(jié)合而成，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為I : 50。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將20mg羽毛角蛋白、60mg Na2S2O3固體放入IOOmL二次去離子水中，并加入O. 05mL 濃度為2mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白銅離子結(jié)合體的制備將O. IOmL濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應(yīng)12h后，即得角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為I : 50。該角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu)在O 4°C條件下避光保存即可。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應(yīng)用通過氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化學(xué)還原法對(duì)角蛋白銅離子結(jié)合體進(jìn)行超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定(測(cè)定方法同實(shí)施例I)，其活性為O. 012 μ mol/L, 具有優(yōu)異的抗SAFR能力，與天然CuZnSOD相比，模擬度達(dá)到341. 7%。實(shí)施例4具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體，該結(jié)合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結(jié)合而成，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為I : 80。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將15mg羽毛角蛋白、35mg Na2S2O3固體放入IOOmL二次去離子水中，并加入O. 05mL 濃度為2mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白銅離子結(jié)合體的制備將O. 16mL濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應(yīng)12h后，即得一系列角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為I : 80。該角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu)在O 4°C條件下避光保存即可。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應(yīng)用通過氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化學(xué)還原法對(duì)角蛋白銅離子結(jié)合體進(jìn)行超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定(測(cè)定方法同實(shí)施例I)，其活性為O. 02 μ mol/L,具有優(yōu)異的抗SAFR能力，與天然CuZnSOD相比，模擬度達(dá)到205. O %。實(shí)施例5具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體，該結(jié)合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結(jié)合而成，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為I 100。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將18mg羽毛角蛋白、50mg Na2S2O3固體放入IOOmL二次去離子水中，并加入O. 05mL 濃度為2mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白銅離子結(jié)合體的制備將O. 20mL濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應(yīng)12h后，即得一系列角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為I : 100。該角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu)在O 4°C 條件下避光保存即可。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應(yīng)用通過氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化學(xué)還原法對(duì)角蛋白銅離子結(jié)合體進(jìn)行超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定(測(cè)定方法同實(shí)施例I)，其活性為O. 017 μ mol/L, 具有優(yōu)異的抗SAFR能力，與天然CuZnSOD相比，模擬度達(dá)到241. 2%。實(shí)施例6具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體，該結(jié)合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結(jié)合而成，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為I : 60。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體的制備方法，包括以下步驟(I)可溶性角蛋白的制備將8mg羽毛角蛋白、12mg Na2S2O3固體放入IOOmL 二次去離子水中，并加入O. 05mL 濃度為2mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白(FK)溶液。(2)角蛋白銅離子結(jié)合體的制備將O. 05mL濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與IOmL可溶性角蛋白(FK)溶液避光攪拌反應(yīng)12h后，即得一系列角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu)，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為I : 60。該角蛋白銅離子結(jié)合體(FK-Cu)在O 4°C條件下避光保存即可。該具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應(yīng)用通過氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化學(xué)還原法對(duì)角蛋白銅離子結(jié)合體進(jìn)行超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定(測(cè)定方法同實(shí)施例I)，其活性為O. 006 μ mol/L, 具有優(yōu)異的抗SAFR能力，與大然CuZnSOD相比，模擬度達(dá)到683. 3%。
權(quán)利要求
1.具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體，其特征在于該結(jié)合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子結(jié)合而成，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為I : 5 I : 100。
2.如權(quán)利要求I所述的具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體的制備方法，包括以下步驟(1)可溶性角蛋白的制備將羽毛角蛋白、Na2S2O3固體放入二次去離子水中，并加入濃度為2mol/L的NaOH溶液， 調(diào)節(jié)PH值至5 9，常溫下密封避光攪拌6 12h，得可溶性角蛋白溶液；所述羽毛角蛋白與所述Na2S2O3固體的質(zhì)量比為5 20 10 60 ;所述羽毛角蛋白與所述二次去離子水的質(zhì)量體積比為5 20 100 ;所述二次去離子水與所述NaOH溶液的體積比為100 0.05;(2)角蛋白銅離子結(jié)合體的制備將濃度為25mmol/L的Cu(OAc)2溶液與所述可溶性角蛋白溶液避光攪拌反應(yīng)12h后， 即得一系列角蛋白銅離子結(jié)合體；該角蛋白銅離子結(jié)合體在O 4°C條件下避光保存即可； 所述Cu(OAc)2溶液與所述可溶性角蛋白溶液的體積比為O. 01 O. 20 10。
3.如權(quán)利要求I所述的具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體作為超氧化物歧化酶模擬物在抗氧化中的應(yīng)用，其特征在于所述角蛋白銅離子結(jié)合體的超氧化物歧化酶活性為O. 005 O. 12ymol/L，其模擬度為天然SOD酶的68. 3%~ 683. 3%0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有模擬超氧化物歧化酶功能的角蛋白銅離子結(jié)合體，該結(jié)合體由羽毛角蛋白與金屬銅離子(Cu2+)結(jié)合而成，其中羽毛角蛋白的物質(zhì)的量與金屬銅離子的物質(zhì)的量的比值為1∶5～1∶100。本發(fā)明采用堿溶法、還原法制備了可溶性角蛋白溶液，并將金屬銅離子與提取的可溶性角蛋白溶液相結(jié)合而制得。本發(fā)明應(yīng)用于超氧化物歧化酶(SOD)的模擬中，模擬度很高，可達(dá)到天然SOD的68.3％～683.3％；同時(shí)本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)單，原料來(lái)源廣泛，成本低廉，實(shí)現(xiàn)了廢物的有效再利用，有利于環(huán)境保護(hù)。
文檔編號(hào)A61K38/39GK102585246SQ201210011619
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者何玉鳳, 宋鵬飛, 李曉曉, 王榮民, 趙婷婷 申請(qǐng)人:西北師范大學(xué)