專(zhuān)利名稱：貓棒束孢粗多糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌提取物，具體屬于一種貓棒束孢粗多糖(IFP)及其制備方法，以及IFP在制備治療慢性腎功能衰竭藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
貓棒束孢(Isaria felina)是從天然冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體中經(jīng)菌種分離培養(yǎng)獲得的一種菌株，在分類(lèi)上屬于半知菌綱、叢梗孢目、棒束孢屬。經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定為 Isaria felina (DC. :Fr) Fr,該菌種已被中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(保藏號(hào)=CGMCC NO. 0706)，并取得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利(ZL02103669. I)。Deffieux Gerard 等人(J Antibiot (Tokyo)· 1981,34 (10) 1261-1265.)從 Isaria felina中提取分離得到環(huán)羧酹酸肽結(jié)構(gòu)的殺蟲(chóng)劑Isariins B, C和D,并對(duì) Isariins B, C 和 D 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定(J Antibiot (Tokyo) · 1981，34 (10) : 1266-1270.)。 郭永霞從貓棒束孢菌絲體中分離純化得到具有抗真菌作用的環(huán)縮肽isarfelin，并對(duì) isarfelin進(jìn)行了理化性質(zhì)的分析、結(jié)構(gòu)鑒定，并發(fā)現(xiàn)isarfelin具有抑制細(xì)菌、抵抗真菌的活性(郭永霞.貓棒束孢菌抗真菌多肽和巨大口蘑抗真菌蛋白的分離純化及特性的研究[博士論文].北京中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005)。Ikumoto等研究發(fā)現(xiàn)冬蟲(chóng)夏草、蛹蟲(chóng)草及貓棒束孢的浸出液對(duì)離體心房有負(fù)收縮效應(yīng)，同時(shí)對(duì)電刺激回腸的收縮反應(yīng)及人血小板的凝結(jié)有抑制作用(Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 1991, 111 (9) 504-509)。我們?cè)趯?duì)貓棒束孢的研究中發(fā)現(xiàn)貓棒束孢菌絲粉對(duì)順鉬引起的急性腎功能損傷有很好的保護(hù)作用，并申報(bào)了專(zhuān)利，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?01110175421. 4。經(jīng)過(guò)對(duì)貓棒束孢粗多糖的提取及其治療慢性腎功能衰竭的研究，發(fā)現(xiàn)貓棒束孢中的粗多糖成分同樣具有腎臟保護(hù)作用，對(duì)慢性腎功能衰竭有較好的治療效果。目前尚未見(jiàn)到關(guān)于貓棒束孢粗多糖在治療慢性腎功能衰竭方面的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種貓棒束孢粗多糖，以及該多糖在制備治療慢性腎功能衰竭藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的貓棒束孢是從天然冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體中經(jīng)分離培養(yǎng)獲得，該菌株保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC NO. 0706。本發(fā)明使用的貓棒束孢菌絲體可由專(zhuān)利號(hào)ZL02103669. I的方法培養(yǎng)得到。本發(fā)明提供的一種貓棒束孢粗多糖(IFP)，通過(guò)如下方法制得取菌絲粉，加入
3-5倍菌絲粉重量的蒸懼水,沸水浴提取70-110min,3000r/min轉(zhuǎn)速下離心4_6min ;于沉淀中繼續(xù)加人3-5倍菌絲粉重量的蒸懼水,沸水浴提取20-40min, 3000r/min轉(zhuǎn)速下離心
4-6min;于沉淀中繼續(xù)加人3_5倍菌絲粉重量的蒸懼水,沸水浴提取20_40min, 3000r/min離心4-6min ;合并三次提取的上清液，水浴濃縮至800_1000mL ;加人3_4倍的95%乙醇，充分混勻，沉淀過(guò)夜；取沉淀，于70°C烘干備用。所述95%乙醇的加人量?jī)?yōu)選為濃縮后上清液體積的3. 75倍。本發(fā)明貓棒束孢粗多糖在制備治療慢性腎功能衰竭藥物中的應(yīng)用將貓棒束孢粗多糖用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠連續(xù)灌胃腺嘌呤30d后(IOOmgCf1)，其血清中CRE和BUN水平顯著升高，成模大鼠在灌胃貓棒束孢粗多糖后其血清中CRE和BUN水平均顯著下降；IFP可以部分糾正慢性腎功能衰竭病情進(jìn)展中常見(jiàn)的貧血問(wèn)題；IFP模型組大鼠腎臟病變嚴(yán)重，而給藥組大鼠腎臟病理改變較輕。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，貓棒束孢粗多糖對(duì)腺嘌呤引起的大鼠慢性腎功能衰竭有很好的治療作用，在不超過(guò)50mg/kg的給藥劑量下對(duì)慢性腎功能衰竭有較好的治療效果，是一種具有良好開(kāi)發(fā)前景的抗腎功能衰竭的藥物。


圖I :正常組腎臟病理圖(HE染色，X 100)。圖2 :模型組腎臟病理圖(HE染色，X 100)圖3 :IFP給藥低劑量組腎臟病理圖(HE染色，X 100)
具體實(shí)施例方式I.實(shí)驗(yàn)材料及方法I. I實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF (specific pathogen free)級(jí) SD 大鼠，雄性，220_240g, 7-8 周齡，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK-(軍)2007-004。飼養(yǎng)溫度為 200C _22°C，12h/12h照明，自由飲水，飼喂無(wú)菌全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司)。I. 2貓棒束孢菌絲體的培養(yǎng)培養(yǎng)基組成蛋白胨0.6%，酵母膏1.2%，蔗糖2.4%，MgSO4 0.05 %, KH2PO4
O.I %以及飽和NaHCO3溶液。培養(yǎng)方法將O. 5g菌種接種于裝有500mL培養(yǎng)基的3000mL三角瓶中，牛皮紙封口，于180r/min搖床上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26. 5°C，2d_3d后收集發(fā)酵液，將發(fā)酵液在2000r/ min轉(zhuǎn)速條件下離心5min，得菌絲體。所得菌絲體干燥粉碎后用于以下實(shí)驗(yàn)。I. 3貓棒束孢粗多糖(IFP)的提取取300g菌絲粉,加入1200mL蒸懼水,沸水浴提取90min, 3000r/min離心5min ;于沉淀中繼續(xù)加人1200mL蒸懼水,沸水浴提取30min, 3000r/min離心5min ;于沉淀中繼續(xù)加人1200mL蒸懼水,沸水浴提取30min, 3000r/min離心5min ;合并三次提取的上清液,水浴濃縮至900mL ;加人3. 75倍的95%乙醇，充分混勻，沉淀過(guò)夜；取沉淀，于70°C烘干備用。I. 4動(dòng)物分組與造模40只SD大鼠購(gòu)入后，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，稱重，按體重隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組，腺嘌呤模型組，IFP給藥高劑量組、IFP給藥中劑量組、IFP給藥低劑量組，每組8只動(dòng)物。
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除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠每天灌胃給予腺嘌呤100mg/kg，每天一次，連續(xù)灌胃30d。尾尖采血，檢測(cè)血清中BUN和CRE水平，驗(yàn)證造模是否成功。I. 5給藥方法及取材造模結(jié)束后IFP給藥組開(kāi)始給藥治療，給藥劑量按每公斤體重中占有體表面積比值確定，IFP給藥高、中、低劑量組給藥量分別為200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg，灌胃量為 5mL/kg，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等量蒸餾水。給藥治療60d，給藥過(guò)程中大鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水。給藥結(jié)束前一天，將大鼠轉(zhuǎn)移至代謝籠飼養(yǎng)，收集24h尿液，測(cè)定尿蛋白及尿肌酐含量。末次給藥后24h，稱重大鼠，將已禁食I !的大鼠用20%烏拉坦(氨基甲酸乙酯) 麻醉，劑量為5mL/kg。分別用普通血清管和EDTA抗凝管腹主動(dòng)脈采血，一部分EDTA抗凝血做血常規(guī)檢測(cè)，將另一部分EDTA抗凝血離心，分離血漿，-80°C冷凍保存待測(cè)；離心普通血清管血液，取血清，-80°C冷凍保存待測(cè)。剖取左、右腎臟，稱重。取左腎，剝除外膜，固定于 4%甲醛溶液中，待測(cè)。I. 6觀察及檢測(cè)項(xiàng)目及方法I. 6. I觀察造模過(guò)程及給藥過(guò)程中大鼠的一般生存情況及進(jìn)食進(jìn)水情況。1.6.2定期對(duì)大鼠進(jìn)行尾尖采血，測(cè)定血清CRE、BUN水平采用肌酐試劑盒和尿素氮試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。I. 6. 3大鼠血清CRE、BUN、UA、GLU、CK、LDH等生化指標(biāo)測(cè)定采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。I. 6. 4大鼠血常規(guī)RBC、HGB、HCT、MCV等測(cè)定采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)。1.6.5腎臟病理檢測(cè)取左腎，剝除外膜，固定于4%甲醛溶液中，常規(guī)脫水、透明、 石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察腎臟病理改變。I. 6. 6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，采用SPSS17. O軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用最小顯著差異法(LSD)，取α =0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。2.結(jié)果2. I實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠的一般狀態(tài)與正常對(duì)照組大鼠相比，造模組大鼠用腺嘌呤灌胃3-5天后，開(kāi)始表現(xiàn)出進(jìn)食量減少，尿量增多，活動(dòng)力下降，一周左右開(kāi)始出現(xiàn)皮毛稀疏，無(wú)光澤，體重增長(zhǎng)緩慢。造模過(guò)程中動(dòng)物死亡I只。給藥過(guò)程中動(dòng)物死亡4只，其中模型組I只，IFP高劑量組I只，中劑量組2只。 2. 2造模期間動(dòng)物血清BUN和CRE的變化表I、表2結(jié)果顯示，造模組與正常對(duì)照組比較，BUN、CRE顯著增高(P < O. 05)，說(shuō)明造模成功。表I造模期間大鼠血清BUN的變化
權(quán)利要求
1.一種貓棒束孢粗多糖，其特征在于，通過(guò)如下方法制得取菌絲粉，加入3-5倍重量的蒸懼水，沸水浴提取70-110min, 3000r/min轉(zhuǎn)速下離心4_6min ;于沉淀中繼續(xù)加人3_5 倍菌絲粉重量的蒸懼水，沸水浴提取20-40min, 3000r/min轉(zhuǎn)速下離心4_6min ;于沉淀中繼續(xù)加人3-5倍菌絲粉重量的蒸懼水,沸水浴提取20-40min, 3000r/min離心4_6min ;合并三次提取的上清液，水浴濃縮至800-1000mL ;加人3_4倍的95%乙醇，充分混勻，沉淀過(guò)夜； 取沉淀，于70°C烘干備用。
2.如權(quán)利要求I所述的貓棒束孢粗多糖，其特征在于，所述95%乙醇的加人量為濃縮后上清液體積的3. 75倍。
3.如權(quán)利要求I所述的貓棒束孢粗多糖在制備治療慢性腎功能衰竭藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種貓棒束孢粗多糖(IFP)及其制備方法，以及該多糖在制備治療慢性腎功能衰竭藥物中的應(yīng)用。貓棒束孢粗多糖制備取菌絲粉，加入3-5倍重量的蒸餾水，沸水浴提取70-110min，3000r/min轉(zhuǎn)速下離心4-6min；連續(xù)提取三次；合并提取的上清液，水浴濃縮至800-1000mL；加人3-4倍的95％乙醇，充分混勻，沉淀過(guò)夜；取沉淀即得貓棒束孢粗多糖。該多糖在一定劑量下可以顯著降低腎衰大鼠血清中肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)的水平，對(duì)腎臟的病理性損害有較好的保護(hù)作用，可以部分糾正慢性腎功能衰竭病情進(jìn)展中常見(jiàn)的貧血癥狀。該多糖能夠改善腎功能，對(duì)慢性腎功能衰竭具有顯著的治療作用。
文檔編號(hào)A61K31/715GK102585024SQ20121001195
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月15日
發(fā)明者任連生, 張生萬(wàn), 楊喜花 申請(qǐng)人:山西大學(xué)