專利名稱：沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物在制備防治炎癥性腸病藥物中的應用的制作方法
沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物在制備防治炎癥性腸病藥物中的應用技術領域
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域中重組蛋白在藥物研發(fā)中的新用途，特別是涉及一種沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物(代號CZLC331)在研制用于防治炎癥性腸病藥物中的新用途。
背景技術：
潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis,UC)又稱特發(fā)性潰瘍性結腸炎或慢性非特異性潰瘍性結腸炎，是一種以粘膜及粘膜下層浸潤為主、特發(fā)于大腸的慢性非特異性炎癥性腸病，主要臨床癥狀表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、粘液便和血便，并伴有多發(fā)性硬化癥、視神經炎和骨質疏松等病癥。由于該病具有治療難度大、療程長及易復發(fā)等特點，已被世界衛(wèi)生組織確定為現(xiàn)代難治病。雖然現(xiàn)已有多種炎癥性腸病治療藥物，如氨基水楊酸類藥物、糖皮質激素類藥物和免疫抑制劑等，但是它們卻具有療效差(尤其是中重度UC)、起效慢、療程長、副作用大等缺點，因此，市場上迫切需要一種療效顯著、起效快、療程短、安全性高、副作用小、用藥方便的預防和治療炎癥性腸病(特別是慢性非特異性潰瘍性結腸炎)的藥物。
關于沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物，已有研究表明，沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物 CBLB502(標準命名)對造血系統(tǒng)有保護作用，可延長高劑量放射損傷后小鼠的生存時間，并可提高低劑量照射小鼠的生存率(Lyudmila G. Burdelya, et al, .An Agonist ofToll-Like Receptor 5 Has Radioprotective Activity in Mouse and Primate Models. Science 2008 ;320 (5873) :226-230)。深入研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌鞭毛蛋白及包含其 N-和C-端保守結構域的衍生物均具有輻射防護作用，能夠有效提高小鼠骨髓中造血干細胞數量有效地預防致死劑量照射引起的小鼠死亡，其機制為通過NF- K B信號通路發(fā)揮抗凋亡作用。提示該沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CBLB502可向抗輻射藥物方向發(fā)展。目前并沒有任何關于沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物向抗輻射藥物以外其它藥用·方向的研究報道。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331在防治炎癥性腸病藥物研發(fā)與制備中的用途。
本發(fā)明所述沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331對炎癥性腸道疾病如潰瘍性結腸炎和克羅恩病等具有良好的預防和治療效果，因此，以該蛋白為活性成分，可以制備成預防和治療炎癥性腸病的藥物。
本發(fā)明所述沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331是包括Tat蛋白轉導肽、沙門氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸殘基和第402-505位氨基酸殘基的融合蛋白；所述沙門氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸殘基和第402-505位氨基酸殘基可通過柔性連接肽連接。
可采用常規(guī)原核表達方法制備沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331，純度大于 95%。
具體制備沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331的方法可包括以下步驟
I)合成沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296編碼基因，其核苷酸序列如序列表中序列I所示；所述沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296是通過柔性臂將沙門氏菌鞭毛蛋白自N 端第1-176位氨基酸殘基和自N端第402-505位氨基酸殘基連接得到的；
2)將人工合成的沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296編碼基因克隆到攜帶Tat轉導肽編碼序列的原核表達載體中，得到攜帶Tat蛋白轉導肽編碼序列和沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296編碼基因的原核表達載體；所述N端連接有Tat蛋白轉導肽的沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物命名為CZLC331,編碼該蛋白的基因的核昔酸序列如序列表中序列2所不；
3)將重組表達載體pET28b-Tat-CZLC331轉化入宿主菌；
4)誘導表達含有攜帶Tat蛋白轉導肽編碼序列和沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物 CZLC296基因的原核表達載體的宿主菌；
5)分離及純化表達的重組蛋白，得到沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白。
在上述沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331制備方法中，所述步驟2)中攜帶 Tat轉導肽編碼序列的原核表達載體為任意一種可在大腸桿菌中表達的原核表達載體， 如pET-22b系列、pET-28系列或pET-15系列等，優(yōu)選為pET28b_Tat ；以pET28b_Tat為出發(fā)載體構建的攜帶沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物C Z L C 3 31編碼基因的重組表達載體為 pET28b-Tat-CZLC331。
步驟3)中的宿主菌可為 E.coli BL21(DE3)、Ε· coli ER2566 (DE3)、 E. coliBL21(DE3，plysS)、E. coli JM109、E. coli HBlOl 或 Ε· coli ToplO 等，優(yōu)選為 E. coliBL21(DE3)。
本發(fā)明所制備的含有CZLC331蛋白的藥物可以制成注射液、口服液、灌腸液、膠囊、腸溶片、粉劑或粒劑等多 種形式，優(yōu)選為注射液、灌腸液或腸溶片。
上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備。
所述膠囊、腸溶片、粉劑和粒劑等固態(tài)劑型的藥物中活性成分沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白的質量百分含量可為1-35%。
所述注射液、口服液和灌腸液等液態(tài)劑型的藥物中活性成分沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白的濃度可為2-64g/L。
需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的輔料，包括藥學領域常規(guī)的吸收促進劑、表面活性劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、 稀釋劑、吸附載體、賦形劑等，必要時還可加入色素、甜味劑及香味劑等。
具體的，所述藥物可以為蛋白注射液，由重量體積比為5% (5g/100mL)的CZLC331 蛋白、0.85% (0. 85g/100mL)的氯化鈉和注射用水組成。
或者，所述藥物為腸溶片，由CZLC331蛋白100重量份，乳糖60重量份，微晶纖維素20重量份、羧甲基淀粉鈉20重量份、聚維酮K3tl 10重量份混合制粒，再將干顆粒按重量份2500 50的比例加入滑石粉混合均勻壓片，再在壓片表邊噴霧涂覆腸溶薄膜衣層制成。
上述藥物的用量一般為0. 2-6. 4mg CZLC331蛋白/kg體重，每天給藥1-2次，療程為5至10天。注射液可經肌肉注射、腹腔注射或靜脈注射給藥。
本發(fā)明提供了沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白在炎癥性腸病藥物研發(fā)中的新用途。通過給予小鼠三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)灌腸以模擬人潰瘍性結腸炎實驗發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白對炎癥性腸病具有明顯的預防和治療作用，具體表現(xiàn)為1)造模組小鼠攝食/飲水量明顯減少，活動減少并伴有便血，結腸出現(xiàn)肉眼可見的的充血、水腫、出血及潰瘍、顯微鏡下可見細胞結構紊舌L、杯狀細胞消失、淋巴細胞和中性粒細胞浸潤等；(2)腹腔給藥后小鼠攝食/飲水量恢復正常、活動明顯增加且便血減少，結腸肉眼可見的充血、水腫、出血及潰瘍等現(xiàn)象明顯減輕， 顯微鏡下可見的細胞結構紊亂和杯狀細胞消失、淋巴細胞和中性粒細胞浸潤現(xiàn)象明顯減輕等。上述實驗結果表明腹腔注射CZLC331蛋白可以有效對抗結腸炎癥對腸粘膜的損傷，并對炎癥條件下的小鼠起到保護作用。因而，可以沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白為活性成分制備成預治炎癥性腸病藥物，該藥具有以下優(yōu)點1)療效明顯(有效率達100%， 治愈率達70% )，而臨床一線藥物柳氮磺胺吡啶有效率僅達90%左右，顯效率僅50% ;2)起效快(用藥后24小時即可起效)，柳氮磺胺吡啶則在服用2周左右，癥狀方有所改善；3)療程短(療程一般為5-10天)，柳氮磺吡啶的療程一般為6周左右；4)安全性高(無毒性)， 而服用柳氮磺胺吡啶后患者有丙氨酸轉氨酶(ALT)和天冬氨酸轉氨酶(AST)的升高，提示其有肝臟毒性；5)副作用小(無明顯副作用)，而柳氮磺胺吡啶在服用后則有惡心、皮疹、粒細胞減少等不良反應；6)用藥方便(每日腹腔注射一次即可)而柳氮磺胺吡啶則3-4g/d， 分3-4次口服。綜上所述，本發(fā)明可解決現(xiàn)有炎癥性腸病治療藥物療效差、起效慢、療程長、 副作用大的問題，可顯著減少患者治療過程的痛苦，促進患者的身體康復和提高生存質量。 本發(fā)明將在炎癥性腸病及其它部位炎癥的預防和治療中發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應用前旦-5^ O


圖I為O. 2mg/kg CZLC331蛋白在三硝基苯磺酸(TNBS)造模后給藥O. 5h治療潰瘍性結腸炎小鼠的結腸外觀
圖2為O. 2mg/kg CZLC331蛋白在三硝基苯磺酸(TNBS)造模后給藥O. 5h治療潰瘍性結腸炎小鼠的結腸粘膜
圖3為O. 2mg/kg CZLC331蛋白在三硝基苯磺酸(TNBS)造模后給藥O. 5h治療潰瘍性結腸炎小鼠結腸粘膜組織切片后HE染色結果
圖4為不同濃度CZLC331蛋白在三硝基苯磺酸(TNBS)造模后給藥O. 5h治療潰瘍性結腸炎小鼠的結腸外觀和結腸粘膜
圖5為不同濃度不同給藥時間CZLC331蛋白治療潰瘍性結腸炎小鼠結腸外觀
圖6為不同濃度不同給藥時間CZLC331蛋白治療潰瘍性結腸炎小鼠結腸粘膜
圖7為不同濃度不同給藥時間CZLC331蛋白治療潰瘍性結腸炎小鼠結腸粘膜組織切片后HE染色結果
圖8為3. 2mg/kg CZLC331蛋白在三硝基苯磺酸(TNBS)造模后4h腹腔注射治療潰瘍性結腸炎小鼠，使用RT-PCR技術檢測結腸TLR1-4家族基因表達的情況(A幅)，及其柱狀分析圖(B幅)
圖9為3. 2mg/kg CZLC331蛋白在三硝基苯磺酸(TNBS)造模后4h腹腔注射治療潰瘍性結腸炎小鼠，使用RT-PCR技術檢測結腸TLR6-9家族基因表達的情況(A幅)，及其柱狀分析圖(B幅)
圖10為O. 2mg/kg CZLC331蛋白在三硝基苯磺酸(TNBS)造模前O. 5h預防給藥后潰瘍性結腸炎小鼠的結腸外觀
圖11為O. 2mg/kg CZLC331蛋白在三硝基苯磺酸(TNBS)造模前O. 5h預防給藥后潰瘍性結腸炎小鼠的結腸粘膜具體實施方式
為了深入研究沙門氏菌鞭毛蛋白的新功能并將其開發(fā)為新領域的保護藥物，本發(fā)明的發(fā)明人通過系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)CZLC331可能通過下調TLRs的表達對炎癥性腸道疾病如潰瘍性結腸炎和克羅恩病等具有良好的預防和治療效果。
關于炎癥性腸病的研究(AbreuMT, Vora P, Faure E, Thomas LS, Arnold ET, Arditi M. Decreased expression of Toll-like receptor-4 and MD—2 correlateswith intestinal epithelial cell protection against dysregulatedproinflammatory gene expression in response to bacterial lipopolysaccharide. J Immunol,2001 Aug I ； 167(3) :1609-16)表明，腸上皮細胞可以通過下調TLR4表達及其信號傳導來維持腸道免疫耐受。本發(fā)明的發(fā)明人意外研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌鞭毛蛋白具有防治潰瘍性結腸炎的作用，而且還進一步證明這種作用是通過下調結腸組織Toll樣受體家族的表達實現(xiàn)的。
Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)是與果蜆Toll蛋白具有同源性的受體蛋白家族，屬于模式識別受體，主要識別病原微生物的保守結構，通過多種信號轉導途徑改善免疫系統(tǒng)功能。TLR家族既在抗感染免疫及先天性免疫中起關鍵性作用，也是重要的獲得性免疫調節(jié)因子。TLR識別病原體后，向胞內傳遞活化信號，激活NF-κ B等轉錄因子，誘導促炎癥因子TL-I、IL-6、IL-8等的產生，上調IL-12、TNF等重要炎癥因子的表達水平及對病原體的殺傷水平。在細胞介導的免疫應答中，IL-12對于誘導T、B淋巴細胞產生Thl 細胞來說，是一個關鍵性的調節(jié)物，可作為生物佐劑放大特異性T細胞對病原體的應答，因此，可以說TLR家族是IL-12以及Thl細胞參與免疫應答產生的早期信號。TLRs和正常菌群之間的平衡被打破，便 會造成病理性腸道炎癥。特別的，沙門氏菌鞭毛蛋白具有下調結腸組織TLR家族表達的效果，可能是其對潰瘍性結腸炎治療作用的重要機制。
本發(fā)明針對沙門氏菌鞭毛蛋白第1-176位氨基酸和第402-505位氨基酸，從頭合成其核苷酸編碼序列，通過原核表達制備了全長為331個氨基酸的沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物，命名為CZLC331，并通過實驗證明其對炎癥性腸道疾病如潰瘍性結腸炎和克羅恩病等具有良好的預防和治療效果。本發(fā)明的實施將為炎癥性腸病的預防和治療提供重要參考。
以下給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述實施例。
本發(fā)明所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例I、沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白的制備
I.構建沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331的原核表達載體pET28b_Tat_CZLC331
I)人工合成沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296(沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物 CZLC296是通過柔性臂將沙門氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸殘基和自N端第 402-505位氨基酸殘基連接得到的)的編碼基因，其核苷酸序列如序列表中序列I所示，長度為891bp，由北京博邁德科技發(fā)展有限公司合成。對合成的基因進行2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，檢測結果表明獲得了 891bp的目的基因，與預期結果相符。
2)重組表達載體pET28b-Tat_CZLC331的構建
a) PCR擴增沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296蛋白編碼基因
采用常規(guī)PCR的方法以人工合成的核苷酸序列為模板擴增出891bp的沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296蛋白的編碼基因，50 μ I PCR反應體系為質粒模板(攜帶沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296蛋白編碼基因的克隆載體PGH-CZLC296，構建方法為將人工合成的CZLC296編碼基因插入克隆載體pGH的SmaI酶切位點獲得)O. 5 μ 1，IOXdNTP 5 μ 1， IOXEx Taq緩沖液5 μ I，上、下游引物(上游弓丨物序列為5’ -CGCGGGATCCATGGCTCAAGTTA TCA-3’，下游引物序列為5’ -CCGCTCGAGTCTCAACAAAGACAAGTT-3，)各 O. 5 μ 1，Ex Taq 酶 O. 25 μ 1，ddH20 38. 25 μ I ；PCR 反應條件為先 95°C 4 分鐘；然后 95°C 45 秒，56°C 30 秒， 72 0C 45秒，共30個循環(huán)；最后72 °C 7分鐘。反應結束后，對PCR產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果表明經擴增獲得了 891bp的DNA片段，與預期結果相符，回收并純化該目的片段。
b)限制性內切酶分別酶切目的基因CZLC296和pET28b_Tat載體
分別對沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296編碼基因和載體pET28b_Tat載體(構建方法為首先通過化學合成的方法合成含有酶切位點為NcoI (上游)和NdeI (下游)的雙鏈TAT核心序列，然后采用限制性內切酶NcoI和NdeI雙酶切TAT核心片段和載體pET28b， 回收目的片段后經T4 DNA連接酶連接及酶切鑒定，最后送英駿公司直接測序確證含有TAT 核心片段的原核表達載體pET28b-TAT構建正確)用限制性內切酶BamH I和Xho I雙酶切， 然后將酶切產物在16°C下用T4 DNA連接酶連接過夜并轉化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中。
c)鑒定
將培養(yǎng)后生長出的克隆分別通過限制性內切酶酶切及測序確證。
測序結果表明獲得了序列及插入位置均正確的攜帶Tat蛋白轉導肽編碼序列和沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296編碼基因的重組表達載體，命名為pET28b-Tat-CZLC331。 所述在N端連接有Tat蛋白轉導肽的沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296命名為CZLC331，編碼該蛋白的基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
2.轉化及菌體復蘇
將步驟I構建正確的原核表達載體pET28b-Tat-CZLC331轉化大腸桿菌BL21 (DE3) 并涂布至含有Kana+(終濃度100 μ g/mL)的LB平皿上，待長出克隆，各組分別挑取一個克隆接種到5mL含有Kana+(終濃度100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖菌約16小時， 待菌體完全復蘇。
3.原核表達載體pET28b-Tat_CZLC331的誘導表達
將復蘇的菌液稀釋至OD6tltl = O. 8，然后吸取5mL菌液接種到150mL含有Kana+ (終濃度100μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 °C、220rpm搖菌約4_5小時后測定0D_，待OD6tltl = O. 6-1. O時迅速加入誘導劑IPTG (終濃度ImM)，并于30°C、220rpm誘導表達8小時。
4.沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白樣品的制備
上述誘導表達菌液于4°C、12000rpm離心10分鐘以收集菌體,采用20mM磷酸鈉緩沖液稀釋樣品后超聲破碎，制備CZLC331蛋白樣品，留取上清液待分離純化。
5.沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白的分離、純化
將步驟4制備的上清液采用初始緩沖液(20mM Na3P04+0. 5M NaCl，pH7. 4)平衡后直接上樣至平衡好的HisTrap HP 5mL柱(購自GE公司)，然后采用4_5個柱體積的上述緩沖液沖洗柱子至洗脫峰基線，最后采用洗脫緩沖液(20mM Na3P04+0. 5M NaCl+0. 5M咪唑， pH7. 4)洗脫蛋白樣品，脫鹽后得到沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白，純度達95%以 上。
實施例2、沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白對炎癥性腸病的治療效果驗證
實驗動物清潔級7-8周Balb/c雄性小鼠(25±5克)，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心；單籠隔離飼養(yǎng)24小時并允許自由飲食。
實驗試劑三硝基苯磺酸(TNBS，購自Sigma公司)；CZLC331 (實施例I制備)； RT-PCR試劑盒(貨號FSK100，購自東洋紡生物科技有限公司)
模型制備首先將小鼠采用麻醉機麻醉，然后采用直徑2. 0mm、長約IOcm的硅膠管由肛門輕緩插入(深約4cm)并將灌腸試劑(含有150g/L TNBS+380mL/L乙醇溶液，150mg/ kg)緩慢推入結腸以制備炎癥性腸病模型。
實驗分組實驗動物分組為模型組、治療組和對照組，每組8只小鼠。對照組是針對正常小鼠用以上方法將380mL/L乙醇溶液(不含TNBS)灌腸I次，正常喂養(yǎng)2天；治療組是針對已制備潰瘍性結腸炎模型的小鼠，待其潰瘍性結腸炎形成后O. 5h，腹腔注射 CZLC331蛋白(3. 2mg/kg體重)進行治療，同時，可根據損傷程度在模型制造成功后O. 5_8h 時間范圍內，在O. 2-6. 4mg/kg體重的濃度范圍內用藥，正常喂養(yǎng)2天；模型組是針對已制備潰瘍性結腸炎模型的小鼠進行正常喂養(yǎng)2天。
I、藥效檢測首先對注射CZLC331蛋白前、后小鼠攝食/水量、活動度、便血等一般指標進行觀察；然后于2d后頸椎脫白處死小鼠并分離全結腸，拍照觀察腸壁形態(tài)(如圖I、 圖4左幅、圖5所示)；最后沿腸系膜剪開腸腔，觀察結腸黏膜組織(如圖2、圖4右幅、圖6 所示)，生理鹽水沖洗后留取遠端結腸，_80°C冰凍保存以備后續(xù)檢測。
結果可見模型組小鼠攝食/水量明顯減少，活動減少，有便血；小鼠結腸肉眼觀察，會出現(xiàn)明顯的充血、水腫、出血及潰瘍形成(0.2mg/kg CZLC331蛋白在三硝基苯磺酸 (TNBS)造模后給藥O. 5h治療潰瘍性結腸炎小鼠的結腸外觀和結腸粘膜分別如圖I和圖2 所示，A :對照組；B :模型組；C :治療組)，顯微鏡下可見模型組細胞結構紊亂、杯狀細胞消失、淋巴細胞和中性粒細胞浸潤等現(xiàn)象(O. 2mg/kg CZLC331蛋白在三硝基苯磺酸(TNBS) 造模后給藥O. 5h治療潰瘍性結腸炎小鼠結腸粘膜組織切片后HE染色結果如圖3所示，A 對照組；B :模型組；C :治療組)；CZLC331經腹腔注射后，小鼠便血、少食少動現(xiàn)象有所減輕 (攝食/水量、活動性明顯增加)；解剖發(fā)現(xiàn)，腸粘膜充血、水腫、潰瘍等現(xiàn)象亦有所減輕，如圖I、圖2、圖4(不同濃度CZLC331蛋白在三硝基苯磺酸(TNBS)造模后給藥O. 5h治療潰瘍性結腸炎小鼠的結腸外觀和結腸粘膜。A :0. 2mg/kg CZLC331 ；B :0. 4mg/kg CZLC331 ；C 0. 8mg/kg CZLC331 ;D :I. 6mg/kgCZLC331)、圖 5(不同濃度不同給藥時間 CZLC331 蛋白治療潰瘍性結腸炎小鼠結腸外觀。A :0. 2mg/kg CZLC331 ；B :0. 4mg/kg CZLC331 ；C :0. 8mg/kg CZLC331 ；D 1. 6mg/kgCZLC331 ；E :3. 2mg/kg CZLC331 ；F :6. 4mg/kg CZLC331)和圖 6(不同濃度不同給藥時間CZLC331蛋白治療潰瘍性結腸炎小鼠結腸粘膜。A :0. 2mg/kg CZLC331 ； B 0.4mg/kgCZLC331 ；C :0.8mg/kg CZLC331；D :1.6mg/kg CZLC331；E :3.2mg/kg CZLC331 ；F 6. 4mg/kg CZLC331)所示，顯微鏡下可見治療組細胞排列結構比較整齊、少量杯狀細胞消失及淋巴細胞和中性粒細胞浸潤等現(xiàn)象(如圖3和圖7所示)。
對照組小鼠攝食、飲水量正常，無便血及活動減少等現(xiàn)象，顯微鏡下可見細胞排列整齊，無杯狀細胞減少及淋巴細胞和中性粒細胞浸潤等現(xiàn)象。
2、腸粘膜組織病理學評分所取腸道組織置于4%甲醛溶液中固定后石蠟包埋、 切片和HE染色，并進行光學顯微鏡觀察檢測。O. 2mg/kg CZLC331蛋白在三硝基苯磺酸 (TNBS)造模后給藥O. 5h治療潰瘍性結腸炎小鼠結腸粘膜組織切片后HE染色結果如圖3所示，不同濃度不同給藥時間CZLC331蛋白治療潰瘍性結腸炎小鼠結腸粘膜組織切片后HE染色結果如圖 7所示(A 0. 2mg/kg CZLC331 ；B :0. 4mg/kg CZLC331 ；C :0. 8mg/kg CZLC331 ；D I. 6mg/kg CZLC331 ；E :3. 2mg/kg CZLC331 ；F :6. 4mg/kg CZLC331)，經 CZLC331 蛋白治療后細胞排列結構趨于整齊、少量杯狀細胞消失并出現(xiàn)淋巴細胞和中性粒細胞浸潤等現(xiàn)象，說明達到了良好的治療效果。
3、腸道TLR家族表達水平檢測提取注射CZLC331蛋白前模型組、治療組、對照組小鼠結腸粘膜組織的總RNA，反轉錄后通過PCR檢測TLR家族基因表達水平，具體TLR家族及內參基因β-actin引物信息如下表I所示。PCR反應體系為Ex Taq O. 25μ1、10Χ上樣緩沖液5μ l、dNTP 5μ I、模板2μ I、上、下游引物各1μ 1，雙蒸水補齊至50μ I。PCR反應條件為95 °C 5min— (95°C 45s — 62 °C 45s ^ 72 °C lmin) X 35 個循環(huán)—72°C 5min — 4°C 停止。反應結束后，對PCR擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并采集圖像分析。結果如圖8和圖9所示，經CZLC331治療后TLR家族PCR條帶的表達量顯示與模型組明顯的差異， 其中TLR2、TLR3、TLR4、TLR8、TLR9模型組的表達量都明顯上調，給予CZLC331治療后可逆轉其上調；TLR6、TLR7模型組表達量明顯上調，給予CZLC331治療后逆轉其上調雖然沒有統(tǒng)計學差異，但其逆轉下調趨勢明顯。檢測結果表明治療過程 和機理還可能與TLR家族表達下調有關，推測沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白可通過TLR家族等通路對炎癥性腸病發(fā)揮治療作用，可以其為活性成分制備成炎癥性腸病治療藥物。
表I RT-PCR擴增用弓丨物序列信息表
權利要求
1.沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白在防治炎癥性腸病藥物研發(fā)中的應用。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于所述炎癥性腸病包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病。
3.根據權利要求I或2所述的應用，其特征在于所述沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物 CZLC331是包括Tat蛋白轉導肽、沙門氏菌鞭毛蛋白自N端第1_176位氨基酸殘基和第 402-505位氨基酸殘基的融合蛋白；所述沙門氏菌鞭毛蛋白自N端第1-176位氨基酸殘基和第402-505位氨基酸殘基可通過柔性連接肽連接。
4.根據權利要求I至3任一所述的應用，其特征在于所述沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物 CZLC331蛋白可采用常規(guī)的原核表達的方法制備得到，純度大于95%。
5.根據權利要求I至4任一所述的應用，其特征在于所述沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物 CZLC331蛋白按包括以下步驟的方法制備得到1)合成沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296編碼基因，其核苷酸序列如序列表中序列I 所示；所述沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296是通過柔性臂將沙門氏菌鞭毛蛋白自N端第 1-176位氨基酸殘基和自N端第402-505位氨基酸殘基連接得到的；2)將人工合成的沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296編碼基因克隆到攜帶Tat轉導肽編碼序列的原核表達載體中，得到攜帶Tat蛋白轉導肽編碼序列和沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296編碼基因的原核表達載體；所述N端連接有Tat蛋白轉導肽的沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物命名為CZLC331,編碼該蛋白的基因的核昔酸序列如序列表中序列2所不；3)將重組表達載體pET28b-Tat-CZLC331轉化入宿主菌；4)誘導表達含有攜帶Tat蛋白轉導肽編碼序列和沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC296基因的原核表達載體的宿主菌；5)分離及純化表達的重組蛋白，得到沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述步驟2)中攜帶Tat轉導肽編碼序列的原核表達載體為任意一種可在大腸桿菌中表達的原核表達載體，如pET-22b系列、 pET-28系列或pET-15系列，優(yōu)選為pET28b_Tat ;以pET28b_Tat為出發(fā)載體構建的攜帶沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331編碼基因的重組表達載體為pET28b-Tat-CZLC331 ;所述步驟 3)中的宿主菌為 E. coli BL21(DE3)、E. coli ER2566 (DE3)、Ε· coli BL21 (DE3，plysS)、 E.coli JM109、E.coli HBlOl 或 E. coli ToplO 等，優(yōu)選為 Ε· coli BL21(DE3)。
7.根據權利要求1-6任一項所述的應用，其特征在于所述藥物可以制成注射液、口服液、灌腸液、膠囊、腸溶片、粉劑或粒劑，優(yōu)選為注射液、灌腸液或腸溶片。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述膠囊、腸溶片、粉劑和粒劑等固態(tài)劑型的藥物中活性成分沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白的質量百分含量為1-35% ； 所述注射液、口服液和灌腸液等液態(tài)劑型的藥物中活性成分沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物 CZLC331蛋白的濃度可為2-64g/L ;在所述藥物中可以加入一種或多種藥學上可接受的輔料，包括藥學領域常規(guī)的吸收促進劑、表面活性劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、粘合劑、濕潤劑、崩解齊 、稀釋齊 、吸附載體、賦形劑，必要時還可加入色素、甜味劑及香味劑。
9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述藥物為蛋白注射液，由重量體積比為 5% (5g/100mL)的CZLC331蛋白、O. 85% (O. 85g/100mL)的氯化鈉和注射用水組成。
10.根據權利要求7或8所述的應用，其特征在于所述藥物為腸溶片，由CZLC331蛋白100重量份，乳糖60重量份，微晶纖維素20重量份、羧甲基淀粉鈉20重量份、聚維酮K3q 10重量份混合制粒，再將干顆粒按重量份2500 50的比例加入滑石粉混合均勻壓 片，再在壓片表邊噴霧涂覆腸溶薄膜衣層制成。
全文摘要
本發(fā)明公開了沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白在防治炎癥性腸病藥物研發(fā)中的用途。本發(fā)明證實，沙門氏菌鞭毛蛋白衍生物CZLC331蛋白對腸道炎癥性疾病如潰瘍性結腸炎和克羅恩病等具有良好的預防和治療效果，可以該蛋白為活性成分，制備成預防和治療炎癥性腸病的藥物。本發(fā)明可解決現(xiàn)有炎癥性腸病治療藥物療效差、起效慢、療程長、副作用大的問題，可顯著減少患者治療過程的痛苦，促進患者的身體康復和提高生存質量。本發(fā)明將在炎癥性腸病及其它部位炎癥的預防和治療中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號A61P1/00GK102861317SQ201210018080
公開日2013年1月9日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權日2011年7月5日
發(fā)明者張成崗, 徐陽, 吳永紅, 李偉光, 李軍懷, 張艷春, 高艷, 李志慧 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所, 蘇州科景生物醫(yī)藥科技有限公司