專利名稱：：畜禽肉中沙門氏菌和大腸桿菌o157多重pcr快速檢測試劑盒及檢測方法畜禽肉中沙門氏菌和大腸桿菌0157多重PCR快速檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種畜禽肉中微生物檢測裝置及檢測方法。
背景技術(shù)：
：過去幾十年因進(jìn)食被沙門氏菌、空腸彎曲菌、大腸桿菌0157污染的食品而引起的食源性疾病的發(fā)病率居高不下，發(fā)達(dá)國家每年約有1/3的人患食源性疾病，美國每年約有7600萬例食源性疾病患者，引起國際社會(huì)對食品安全尤其是食品中含有害微生物問題的關(guān)注。食品生產(chǎn)模式及飲食方式的改變、消費(fèi)者中對食源性病原菌易感人群的增多、發(fā)展中國家對畜禽肉的需求量增加等因素是導(dǎo)致食源性疾病發(fā)病率升高的重要原因。因此加大畜禽肉的檢驗(yàn)檢疫，保證其食用安全，是預(yù)防食源性疾病暴發(fā)的重要途徑。大腸桿菌0157(Enterohemorrhagici51c力ar/c力j'aco7_z'0157)禾口沙門氏菌(5"sZffl(9/e22sspp.)是目前世界公認(rèn)引起食源性疾病的重要致病菌，主要通過食物和飲水傳播，肉及肉制品的污染率最高。沙門氏菌感染后可引起胃腸炎、敗血癥，大腸桿菌0157感染后可并發(fā)溶血性尿毒癥。在我國現(xiàn)行國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中，這兩種菌都被列為致病菌的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目。目前，包括我國在內(nèi)的許多國家對這些致病菌的檢驗(yàn)大多仍沿用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定方法，其檢測周期長、操作繁瑣、靈敏度低，而且每次只能檢測出一種致病菌，面對日益增加的多重混合污染，目前的實(shí)驗(yàn)診斷顯得嚴(yán)重滯后。因此，建立快速敏感和特異的檢測方法對于盡快明確致病因素和采取有效的預(yù)防和治療措施都是非常必要的。多重PCR技術(shù)可以在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測多個(gè)病原微生物，具有高效、高產(chǎn)、低成本、速度快等優(yōu)點(diǎn)，一經(jīng)提出，即得到眾多研究者的青睞，目前己在多種病原微生物的檢測中得到了應(yīng)用。選擇特異的靶基因和設(shè)計(jì)出合理的引物對PCR檢測致病菌至關(guān)重要。沙門氏菌的侵襲蛋白決定細(xì)菌進(jìn)入宿主上皮細(xì)胞的能力，與沙門氏菌的致病性密切相關(guān)，它是由invA、invB、invC、invD和invE等一組基因編碼，其中invA為沙門氏菌的主要毒力因子(ZhaoS，QaiyumiS，F(xiàn)riedmanS，etal.CharacterizationofSalmonellaentericaSerotypenewportisolatedfromhumansandfoodanimals.JClinMicrobiol,2003，41(12):5366-5371.)。研究證明沙門氏菌的invA基因序列比較保守，可以作為PCR檢測沙門氏菌的靶基因(CohenND.NeibergsHL.MegruderED，etal.Genus—specificdetectionofsalmonellaeusingthepolymerasechainreaction.JVetDiagnInvest,1993,5(3):368-371.)。國內(nèi)外報(bào)道的大腸桿菌0157PCR檢測方法中，stxl、stx2、eaeA、hlyA這4個(gè)基因最常用作耙基因，但研究發(fā)現(xiàn)不同類的致瀉性大腸桿菌有相同的基因片段，這些毒力基因并不是大腸桿菌0157所特有，因此，單一檢測上述基因片段，特異性不高，難以確認(rèn)或排除大腸桿菌0157污染。BILGE(BilgeSS，JamesC，Vary,etal.Roleofthe^sc力arj'c力isc<xZ_z'0157:H70sidechaininadherenceandanalysisofanlocus.InfectI腿un，1996，64(11):47954801.)、LEIWANG(WangL，ReevesPR.OrganizationofEscherichiacoli01570AntigenGeneClusterandIdentificationofItsSpecificGenes.InfectI誦n，1998,66(8):35453551.)分別于1996和1998通過研究證實(shí)，編碼0157抗原的rfbE基因其基因序列與其它細(xì)菌的類似功能基因的序列沒有同源性，為大腸桿菌0157的特異基因。因此，本文的多重PCR中采用了rfbE基因做為診斷大腸桿菌0157的標(biāo)志，實(shí)現(xiàn)了對大腸桿菌
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種能同時(shí)檢測畜禽肉中沙門氏菌和大腸桿菌0157的多重PCR快速檢測試劑盒以及檢測方法。本發(fā)明所述的檢測試劑盒，包括10XPCRbuffer,1.03.0mmol/LMgCl2，240Wnol/LdNTPeach,200nmol/L沙門氏菌引物、200nmol/L大腸桿菌0157引物，1.33.0UTaq酶。其中，兩種菌的引物序列及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別如表1所示。表1:兩種菌的引物序列及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明所述的檢測方法，包括提取樣品DNA，多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，分析結(jié)果。其中，樣品DNA提取包括1)1.5mL菌液，8000r/min離心10min，去上清液；2)力n567叱TE懸浮沉淀，并加30叱100g/LSDS，3叱20mg/mL蛋白酶K，混勻，37。C保溫lh;3)加100叱5mol/LNaCl，混勻；4)加80叱CTAB/NaCl溶液，混勻，65。C保溫20min;5)用等體積酚氯仿異戊醇(25:24:1，v:v:v)抽提，10000r/min離心10min，將上層清液移至干凈離心管；6)用等體積氯仿異戊醇(24:1，v:v)抽提，取上清液移至干凈離心管中；7)加等體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜置30min，沉淀DNA;8)用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于100I4JE，-2(TC保存。多重PCR擴(kuò)增包括l)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:10XPCRbuffer2.5PL，2腿ol/LMgCU240Rnol/LdNTPeach，200nmol/L沙門氏菌引物、200nmol/L大腸桿菌0157引物，3UTaq酶，DNA模板2叱，反應(yīng)體系25叱。2)擴(kuò)增反應(yīng)條件94"預(yù)變性5min;94。C變性lmin、58。C退火lmin、72'C延伸2min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72"C延伸10min;于4'C下保存。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測包括將擴(kuò)增產(chǎn)物于15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測及UVI凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。本發(fā)明有較好的特異性，可在89h內(nèi)完成對沙門氏菌和大腸桿菌0157的同時(shí)檢測，比常規(guī)的細(xì)菌學(xué)診斷快速簡便經(jīng)濟(jì)，為食物樣品中致病菌的診檢提供有力的技術(shù)手段，有良好的應(yīng)用前景。圖l為引物靈敏度檢測的電泳圖，其中M:lOObp分子量標(biāo)準(zhǔn)，1:稀釋度為10—22:稀釋度為10—33:稀釋度為10—44:稀釋度為10—55-稀釋度為10-66:稀釋度為10—77:稀釋度為1CT88:空白對照具體實(shí)施方式實(shí)施例一引物特異性檢測根據(jù)所設(shè)計(jì)的2對特異性PCR引物對27株常見致病菌進(jìn)行PCR檢測陰性、陽性結(jié)果見表2。其中5株大腸桿菌0157菌株均檢測到rfbE基因，其它血清型大腸桿菌未檢測到上述基因，所有非大腸桿菌菌株均未見上述特異性擴(kuò)增帶；10株沙門氏菌均檢測到irwA基因。結(jié)果表明，2對引物僅對它們的目標(biāo)生物特異。表2引物特異性電泳結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注NCTC(UnitedKingdomNationalCollectionofTypeCultures,英國國立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所)，CMCC(NationalCenterforMedicalCultureofCollections，中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心)，ATCC(AmericanTypeCultureCollection,美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心)，GDCIQ(GuangdongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局)，GIM(GuangdongInstituteofMicrobiology/'東省微生物研究所)，VPL4-90(上海疾病控制中心來源菌種)實(shí)施例二引物靈敏度檢測將標(biāo)準(zhǔn)菌株S.typhiCMCC50115、E.coli0157NCTC12900的培養(yǎng)液(平板計(jì)數(shù)結(jié)果分別為2.4X109cfu/mL禾Q2.2X109cfu/mL)等量混合后，做10倍梯度稀釋，然后將各個(gè)梯度稀釋液分別接種到含10g碎豬肉的90mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，培養(yǎng)4h后，提取DNA進(jìn)行多重PCR檢測。結(jié)果如圖l所示。可檢測到的最高稀釋濃度即為多重PCR在樣品中的最高檢測靈敏度。則結(jié)果表明可檢測的最高稀釋度為10—7，即可檢測到的兩種菌的濃度分別為2.4X102cfu/mL沙門氏菌和2.2X102cfu/mL大腸桿菌0157。實(shí)施例三、使用本發(fā)明所述的多重PCR快速檢測試劑盒檢測豬肉中的沙門氏菌和大腸桿菌01571、樣品前處理采用無菌操作隨機(jī)取樣10g，加入到90mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，37'C培養(yǎng)4小時(shí)。2、樣品DNA提取1)1.5mL菌液，8000r/min離心10min，去上清液；2)加567叱TE懸浮沉淀，并加30叱100g/LSDS，3叱20mg/mL蛋白酶K，混勻，37。C保溫lh;3)加100叱5mol/LNaCl，混勻；4)加80禮CTAB/NaCl溶液，混勻，65。C保溫20min;5)用等體積酚氯仿異戊醇(25:24:1,v:v:v)抽提，10000r/min離心10min，將上層清液移至干凈離心管；6)用等體積氯仿異戊醇(24:1，v:v)抽提，取上清液移至干凈離心管中；7)加等體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜置30min，沉淀DNA;8)用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于100l^LTE，-2(TC保存。3、多重PCR擴(kuò)增1)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10XPCRbuffer2.5叱，2mmol/LMgCl2，240Wnol/LdNTPeach，200nmol/L沙門氏菌引物、200nmol/L大腸桿菌0157引物，3UTaq酶，DNA模板2叱，反應(yīng)體系25叱。2)擴(kuò)增反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min;94。C變性lmin、58。C退火lmin、72。C延伸2min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min;于4。C下保存。4、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測將擴(kuò)增產(chǎn)物于15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測及UVI凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，產(chǎn)物大小為495bp，說明檢測的豬肉中含有沙門氏菌。實(shí)施例四、使用本發(fā)明所述的多重PCR快速檢測試劑盒檢測雞肉中的沙門氏菌和大腸桿菌01571、樣品前處理采用無菌操作隨機(jī)取樣10g，加入到90mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，37'C培養(yǎng)4小時(shí)。2、樣品DNA提取1)1.5mL菌液，8000r/min離心10min，去上清液；2)加567^TE懸浮沉淀，并加301^L100g/LSDS，3叱20mg/mL蛋白酶K，混勻，37。C保溫lh;3)力Q100叱5mol/LNaCl，混勻；4)力H80MLCTAB/NaCl溶液，混勻，65。C保溫20min;5)用等體積酚氯仿異戊醇(25:24:1，v:v:v)抽提，10000r/min離心10min，將上層清液移至干凈離心管；6)用等體積氯仿異戊醇(24:1，v:v)抽提，取上清液移至干凈離心管中；7)加等體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜置30min，沉淀DNA;8)用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于100叱TE，-2(TC保存。3、多重PCR擴(kuò)增1)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系10XPCRbuffer2.5PL，2咖ol/LMgC"，240Wnol/LdNTPeach，200nmol/L沙門氏菌引物、200nmol/L大腸桿菌0157引物，3UTaq酶，DNA模板2叱，反應(yīng)體系25叱。2)擴(kuò)增反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min;94'C變性lmin、58。C退火lmin、72。C延伸2min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min;于4'C下保存。4、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測將擴(kuò)增產(chǎn)物于15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測及UVI凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，產(chǎn)物大小為678bp，說明檢測的雞肉中含有大腸桿菌0157。實(shí)施例五、使用本發(fā)明所述的多重PCR快速檢測試劑盒檢測牛肉中的沙門氏菌和大腸桿菌Q1571、樣品前處理采用無菌操作隨機(jī)取樣10g，加入到90mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，37。C培養(yǎng)4小時(shí)。2、樣品DNA提取1)1.5mL菌液，8000r/min離心10min，去上清液；2)加567叱TE懸浮沉淀，并加30PL100g/LSDS，3叱20mg/mL蛋白酶K，混勻，37。C保溫lh;3)力[]100叱5mol/LNaCl，混勻；4)力n80叱CTAB/NaCl溶液，混勻，65'C保溫20min;5)用等體積酚氯仿異戊醇(25:24:1，v:v:v)抽提，10000r/min離心10min，將上層清液移至千凈離心管；6)用等體積氯仿異戊醇(24:1，v:v)抽提，取上清液移至干凈離心管中；7)加等體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜置30min，沉淀DNA;8)用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于100WJE，-2(TC保存。3、多重PCR擴(kuò)增1)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:10XPCRbuffer2.5叱，2咖ol/LMgCl2，240Wnol/LdNTPeach，200nmol/L沙門氏菌引物、200nmol/L大腸桿菌0157引物，3UTaq酶，DNA模板2pL，反應(yīng)體系25叱。2)擴(kuò)增反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min;94。C變性lmin、58。C退火lmin、72。C延伸2min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min;于4。C下保存。4、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測將擴(kuò)增產(chǎn)物于15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測及UVI凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，產(chǎn)物大小分別為495bp和678bp，說明檢測的牛肉中含有沙門氏菌和大腸桿菌0157。權(quán)利要求1、畜禽肉中沙門氏菌和大腸桿菌O157多重PCR快速檢測試劑盒，其特征在于包括10×PCRbuffer，1.0～3.0mmol/LMgCl2，240μmol/LdNTPeach，200nmol/L沙門氏菌引物、200nmol/L大腸桿菌O157引物，1.3～3.0UTaq酶。2、如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的沙門氏菌引物序列為上游5，-ATCGGCGTTATCCCTTTCTCTGGTG_3，；下游5，-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGAGA_3，。3、如權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于所述的大腸桿菌0157引物序列為上游5，-AACGGTTGCTCTTCATTTAG-3，;下游5，-GAGACCATCCAATAAGTGTG_3，。4、一種使用如權(quán)利要求1或2或3所述的檢測試劑盒同時(shí)檢測畜禽肉中沙門氏菌和大腸桿菌0157的多重PCR檢測方法，其特征在于包括樣品DNA，多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，分析結(jié)果。5、如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于樣品DNA提取包括1)1.5mL菌液，8000r/min離心10min，去上清液；2)力Q567叱TE懸浮沉淀，并加30PL100g/LSDS，3叱20mg/mL蛋白酶K，混勻，37。C保溫lh;3)加100叱5mol/LNaCl，混勻；4)加80叱CTAB/NaCl溶液，混勻，65。C保溫20min;5)用等體積酚氯仿異戊醇，其體積比為25:24:1，抽提，10000r/min離心10min，將上層清液移至干凈離心管；6)用等體積氯仿:異戊醇，其體積比為24:1，抽提，取上清液移至干凈離心管中；7)加等體積異丙醇，顛倒混合，室溫下靜置30min，沉淀DNA;8)用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于100I4JE，-20。C保存。6、如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于多重PCR擴(kuò)增包括1)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:lOXPCRbuffer2.5叱，2mmol/LMgCl2，240Mmol/LdNTPeach，200nmol/L沙門氏菌引物、200nmol/L大腸桿菌0157引物，3UTaq酶，DNA模板2PL，反應(yīng)體系25叱；2)擴(kuò)增反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5min;94t:變性lmin、58t:退火lmin、72。C延伸2min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min;于4。C下保存。7、如權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于將擴(kuò)增產(chǎn)物于15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測及UVI凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。全文摘要本發(fā)明涉及一種畜禽肉中微生物檢測裝置及檢測方法。所述的畜禽肉中沙門氏菌和大腸桿菌O157多重PCR快速檢測試劑盒包括10×PCRbuffer，1.0～3.0mmol/LMgCl₂，240μmol/LdNTPeach，200nmol/L沙門氏菌引物、200nmol/L大腸桿菌O157引物，1.3～3.0UTaq酶。本發(fā)明有較好的特異性，可在8～9h內(nèi)可以完成對沙門氏菌和大腸桿菌O157的同時(shí)檢測，比常規(guī)的細(xì)菌學(xué)診斷快速簡便經(jīng)濟(jì)，為食物樣品中致病菌的診檢提供有力的技術(shù)手段，有良好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12R1/42GK101245384SQ20081002603公開日2008年8月20日申請日期2008年1月25日優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日公開號(hào)200810026031.9發(fā)明者吳清平,張菊梅,楊小鵑,郭偉鵬申請人:廣東省微生物研究所被以下專利引用(1),