專利名稱：一種多聚核酸分子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種多聚核酸分子及其應用。
背景技術：
人類基因組中存在的蛋白編碼基因大約有2-3萬個，約占總序列量的2%，其余 98%的序列不編碼蛋白質，曾一度被認為是沒有生物學功能的“垃圾DNA”。近年來隨著研究的深入，我們發(fā)現這些基因組序列能轉錄產生大量的非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)。 具體的，根據成熟轉錄本的大小，將這些非編碼分為小分子ncRNA (如siRNA，miRNA, piRNA 等)，中等長度 ncRNA (70-200nt)和長 ncRNA (long ncRNA, IncRNA, > 200nt)。目前，非編碼RNA領域的研究工作多集中于小分子非編碼RNA的鑒定和功能研究方面，對長非編碼RNA 的了解還非常有限。最近的研究表明長非編碼RNA通常是以RNA轉錄本的形式，在細胞分化、細胞增殖、細胞凋亡和類固醇代謝等過程中發(fā)揮重要的調控作用。最近的研究還發(fā)現長非編碼RNA與細胞癌變有著極為密切的聯系，在肺癌、非霍杰金淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病中，發(fā)現某些具有腫瘤抑制功能長非編碼RNA的缺失或表達量下降，表明長非編碼RNA在細胞增殖、分化和癌變中具有重要的作用，尤其是其中分化相關的長非編碼RNA，有可能為分化相關疾病尤其是腫瘤的診斷和治療提供生物標志物和靶點。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及以下按順序編號的段落中定義的主題I、一種分離的多聚核酸分子，其特征在于所述核酸分子選自I)具有SEQ ID NO 1所示核酸序列的多聚核酸分子；2)具有SEQ ID NO 1所不核酸序列的部分核酸序列的多聚核酸分子；3)具有與I)或2)所述多聚核酸分子序列90%或以上同源性核酸序列的多聚核酸分子；4)具有與I)、2)或3)所述多聚核酸分子序列互補核酸序列的多聚核酸分子。2、段落I所述的多聚核酸分子作為分化標志物的應用。3、段落I所述的多聚核酸分子作為脂肪組織分化標志物的應用。4、段落I所述的多聚核酸分子作為疾病標志物的應用，其特征在于所述疾病選自脂肪瘤、子宮平滑肌肉瘤、間質瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺樣囊性癌、或II型糖尿病。5、段落I所述的多聚核酸分子作為疾病治療靶點的應用，其特征在于所述疾病選自脂肪瘤、子宮平滑肌肉瘤、間質瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺樣囊性癌、或II型糖尿病。6、一種在離體樣本中檢測段落I所述多聚核酸分子表達水平的方法，其特征在于所述方法選自雜交法、擴增法或測序法。7、段落6所述的方法，其特征在于離體樣本選自分離的體液、淋巴結樣本、或組織樣本。8、段落6所述的方法，其特征在于所述雜交法選自斑點雜交、Northern雜交、或基
3因芯片雜交。9、段落6所述的方法，其特征在于所述擴增法選自半定量RT-PCR、實時熒光定量 RT-PCR、Taqman PCR。10、段落9所述的方法，其特征在于所使用的引物組合選自SEQ ID NO 200-SEQ IDNO 209所示的核酸序列。11、段落6所述的方法，其特征在于所述測序法選自雙脫氧終止測序法、或高通量測序。12、一種檢測系統，其特征在于包含段落10所述的引物組合。13、段落12所述的檢測系統，其特征在于該系統還包括逆轉錄酶及其反應緩沖液、四種脫氧核糖核苷酸底物、DNA聚合酶、熒光定量PCR反應緩沖液、人工合成的內參及正常人對照品。14、段落6-13任一項所述的方法或系統在分化標志物檢測中的應用。15、段落6-13任一項所述的方法或系統在脂肪組織分化標志物檢測中的應用。16、段落6-13任一項所述的方法或系統在疾病標志物檢測中的應用，其特征在于所述疾病選自脂肪瘤、子宮平滑肌肉瘤、間質瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺樣囊性癌、或II型糖尿病。17、段落14-16任一項所述的應用，其特征在于包含以下步驟1)測定段落I所述的多聚核酸分子在離體樣本中的水平；2)測定段落I所述的多聚核酸分子在參考樣本中的水平；3)比較多聚核酸分子在離體樣本和參考樣本中的水平。18、一種能降低段落I所述多聚核酸分子表達水平的抑制劑。19、段落18所述的抑制劑，其特征在于所述抑制劑為小干擾核酸分子。20、段落19所述的抑制劑，其特征在于所述小干擾核酸分子序列選自SEQ ID NO 300-SEQ ID NO :327所示的核酸序列。21、段落19-20任一項所述的抑制劑，其特征在于所述小干擾核酸分子包含如下修飾中的至少一種1)對核酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；2)對核酸序列中核苷酸的核糖的2’ -OH的修飾；3)對核酸序列中核苷酸的堿基的修飾。22、段落18所述的抑制劑，其特征在于所述抑制劑為shRNA表達載體，優(yōu)選情況下所述表達載體包含選自SEQ ID NO 350-SEQ ID NO 377所示的核酸序列。23、段落18所述的抑制劑，其特征在于所述抑制劑為反義核酸分子，優(yōu)選情況下所述反義核酸分子具有SEQ ID NO 240-SEQ ID NO 253所示的核酸序列。24、一種細胞分化抑制劑，其特征在于包含段落18-23任一項所述的至少一種抑制劑。25、一種藥物組合物，其特征在于包含段落18-23任一項所述的至少一種抑制劑及藥學上可接受的載體。26、段落18-25任一項所述的抑制劑在制備疾病治療藥物組合物中的應用。27、段落26所述的應用，其特征在于所述疾病選自脂肪瘤、子宮平滑肌肉瘤、間質瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺樣囊性癌、以及II型糖尿病。一方面，本發(fā)明提供了一種分離的多聚核酸分子(命名為“TAR”)，該多聚核酸分子具有SEQ ID NO 1所示的全部或部分核酸序列，或與SEQ ID NO 1所示的全部或部分核酸序列具有90 %或以上同源性的核酸序列，或與以上核酸序列互補的核酸序列。另一方面，本發(fā)明提供了上述多聚核酸分子作為分化標志物的應用；優(yōu)選的，本發(fā)明提供了上述多聚核酸分子作為脂肪組織分化標志物的應用；更優(yōu)選的，本發(fā)明提供了上述多聚核酸分子作為疾病標志物的應用，所述疾病包括脂肪瘤、子宮平滑肌肉瘤、間質瘤、 血管粘液瘤、骨肉瘤、腺樣囊性癌、或II型糖尿??；更優(yōu)選的，本發(fā)明提供了上述多聚核酸分子作為疾病治療靶點的應用，所述疾病包括脂肪瘤、子宮平滑肌肉瘤、間質瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺樣囊性癌、或II型糖尿病。另一方面，本發(fā)明提供了一種在離體樣本中檢測上述多聚核酸分子的方法，所述離體樣本包括分離的體液、淋巴結樣本、或組織樣本。另一方面，本發(fā)明提供了一種在離體樣本中檢測上述多聚核酸分子的方法，所述檢測方法包括雜交法、擴增法或測序法。具體地說，擴增法包括半定量RTP-CR、實時熒光定量RT-PCR、Taqman PCR ;雜交法包括斑點雜交、Northern雜交、或基因芯片雜交；測序法包括雙脫氧終止測序法、或高通量測序。優(yōu)選的，上述PCR檢測中所用的檢測引物選自SEQ ID NO :214_SEQ ID NO :219所
示的核酸序列組合。另一方面，本發(fā)明提供了一種在離體樣本中檢測上述多聚核酸分子的檢測系統， 該系統包含上述檢測引物；在較佳的實施方式中，該系統還包括逆轉錄酶及其反應緩沖液、 四種脫氧核糖核苷酸底物、DNA聚合酶、熒光定量PCR反應緩沖液、人工合成的內參及正常人對照品。另一方面，本發(fā)明提供了上述檢測方法、檢測試劑或檢測系統在分化標志物檢測中的應用。優(yōu)選的，本發(fā)明提供了上述檢測方法、檢測試劑或檢測系統在脂肪組織分化標志物檢測中的應用；更優(yōu)選的，本發(fā)明提供了上述檢測方法、檢測試劑或檢測系統在疾病標志物檢測中的應用，所述疾病包括脂肪瘤、子宮平滑肌肉瘤、間質瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺樣囊性癌、或II型糖尿??；更優(yōu)選的，本發(fā)明提供了上述檢測方法、檢測試劑或檢測系統在疾病治療中的應用，所述疾病包括脂肪瘤、子宮平滑肌肉瘤、間質瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、 腺樣囊性癌、或II型糖尿病。另一方面，本發(fā)明提供了一種疾病檢測及診斷方法，該方法包含以下步驟1)測定離體樣本中上述多聚核酸分子的水平；2)測定參考樣本中相應多聚核酸分子的水平；3) 比較多聚核酸分子在離體樣本和參考樣本中的水平。如果與參考樣本相比，離體樣本中多聚核酸分子的水平有顯著改變，表明分化或疾病的存在。如果與參考樣本相比，多聚核酸分子在離體樣本中的水平顯著升高，表明有分化或疾病發(fā)生?！帮@著升高”在此指的是所述多聚核酸分子的表達水平增加至少5%，包括例如增加至少 6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、或更多。另一方面，本發(fā)明提供了一種能夠降低所述多聚核酸分子表達水平的抑制劑。優(yōu)選的，所述抑制劑包括小干擾核酸分子(siRNA)、shRNA表達載體、或反義核酸分子。這些抑制劑不僅能夠降低所述多聚核酸分子的表達水平，也能夠改變組織分化或疾病的發(fā)生。更優(yōu)選的，所述小干擾核酸分子選自SEQ ID NO 300-SEQ ID NO :327所示的核酸序列、或其化學修飾產物，所述反義核酸選自SEQ ID NO 240-SEQ ID NO :253所示的核酸序列、或其化學修飾產物。所述化學修飾為如下修飾中的至少一種1)對核酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；2)對核酸序列中核苷酸的核糖的2’_0H的修飾；3)對核酸序列中核苷酸的堿基的修飾。在反義核酸研究中，各種化學修飾方法很多，其中又以硫代和甲氧代修飾的研究最為全面。這兩種化學修飾能夠有效地抑制核酸酶對反義核酸分子的降解，保持其生物學活性；此外，硫代反義核酸還能顯著提高RNA酶降解其雜交RNA鏈的活性。應當明確的是， 任何能夠增加反義核酸分子穩(wěn)定性和提高其生物利用度的化學修飾方法都可以應用于本發(fā)明，如膽固醇修飾、PEG修飾等。優(yōu)選的，本發(fā)明中反義核酸分子的化學修飾包括硫代修飾、2’ -甲氧基修飾、膽固醇修飾中的一種或幾種。對于小干擾核酸(siRNA)而言，所述化學修飾為本領域技術人員所公知，所述磷酸二酯鍵的修飾是指對磷酸二酯鍵中的氧進行修飾，包括硫代磷酸修飾和硼烷化磷酸鹽修飾。這兩種修飾均能顯著提高siRNA結構的穩(wěn)定性，保持堿基配對的高特異性和高親和力。所述核糖修飾是指對核苷酸戊糖中2’ -OH的修飾，即在核糖的羥基位置引入某些取代基，例如，2’ -氟代修飾、2’ -氧甲基修飾、2’ -氧亞乙基甲氧基修飾、2，4’ - 二硝基苯酚修飾、鎖核酸(LNA)、2’_氨基修飾、2’-脫氧修飾。這些修飾可以提高siRNA的生物利用度、與靶序列的親和性、以及抗核酸酶降解能力。此外，為了促進抑制劑進入細胞，可以在以上修飾的基礎上，在小干擾核酸分子或反義核酸分子中或其末端引入膽固醇、聚乙二醇等親脂性基團，提高抑制劑的細胞膜穿透能力。另一方面，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有安全有效量的上述至少一種抑制劑和藥學上可接受的載體或賦形劑。優(yōu)選的，所述抑制劑是小干擾核酸分子或反義核酸分子。本發(fā)明提供的藥物組合物可用于治療包括腫瘤在內的與分化相關的疾病；優(yōu)選的，所述疾病包括脂肪瘤、子宮平滑肌肉瘤、間質瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺樣囊性癌、或II型糖尿病。所述載體或賦形劑包括但不限于鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、陽離子脂質體、陽性高分子聚合物及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以根據需要被制成多種劑型，如針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備的針劑。所述“有效量”是指可對人和/或動物產生功能或活性且可被人和/或動物所接受的量。所述“藥學上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態(tài)反應)的成分，即有合理的效益/ 風險比的物質。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明一方面分離了一種多聚核酸分子，該多聚核酸分子可作為組織分化、尤其是脂肪組織分化的標志物和多種疾病的檢測標志物而得到應用；另一方面，本發(fā)明提供了所述多聚核酸分子的檢測方法和系統，該方法和系統能夠特異地檢測到低豐度的所述多聚核酸分子；另一方面，本發(fā)明提供了能夠降低所述多聚核酸分子表達水平的抑制劑，以及包含該抑制劑的藥物組合物。


圖13T3-L1前脂肪細胞誘導分化的油紅O染色圖23T3-L1前脂肪細胞誘導分化中PPAR α和CEBP的表達變化
6
圖3多聚核酸分子(TAR)的組織表達譜圖4多聚核酸分子(TAR)與PPARa的共調控圖5利用siRNA降低多聚核酸分子(TAR)的表達圖6利用反義核酸降低多聚核酸分子(TAR)的表達圖7利用shRNA表達載體降低多聚核酸分子(TAR)的表達
具體實施例方式下面結合具體實施例及附圖，進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不能用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明所使用的 DNA寡聚核酸由Invitrogen北京分公司合成，所使用的RNA寡聚核酸由廣州市銳博生物科技有限公司合成。表1基因表達檢測引物組合TAROl檢測弓物組合
TAROl正向弓物5， -ATCCATCTCCCCTACCCATC(SEQIDNO:200)
TAROl反向弓物5’ -TGCAGAGGACTCACAACTGG(SEQIDNO:201)
TAR08檢測弓物組合
TAR08正向弓物5’ -GGTGCAGTTTTGCACTGAGA(SEQIDNO:202)
TAR08反向弓物5， -GATGGAGAGAAAGGAAGGGG(SEQIDNO:203)
TAR16檢測弓物組合
TAR16正向弓物5， -CCTAGTGCCTTTCTGCCTTG(SEQIDNO:204)
TAR16反向弓物5’ -TGGGGTGATTGTGTAGGGAT(SEQIDNO:205)
TAR31檢測弓物組合
TAR31正向弓物5， -CAAGTGGTTCCGGATTCTGT(SEQIDNO:206)
TAR31反向弓物5’ -CCGTGAAATGAAGTGGTGTG(SEQIDNO:207)
TAR54檢測弓物組合
TAR54正向弓物5， -GCATTTAATTGGTGCTGGCT(SEQID NO :208)
TAR54反向弓物5， -GACCCTTCTCCTAGCTGCCT(SEQ ID NO :209)
Actin檢測弓物組合
Actin正向弓物5’ -GAAGAGCTATGAGCTGCCTGA(SEQ ID NO :210)
Actin反向弓物5， -CTCATCGTACTCCTGCTTGCT(SEQ ID NO :211)
PPARa檢測引物組合
PPARa 正向引物5’ -AAGAGCTGACCCAATGGTTG (SEQ ID NO :212) PPARa 反向引物5’ -ACCCTTGCATCCTTCACAAG (SEQ ID NO :213) hTARl檢測引物組合 hTARl 正向引物5’ -GGCTACGCTCTCCTCTTTCC (SEQ ID NO :214) hTARl 反向引物5’ -TGAACCAGAGAGGAGCTTGTT (SEQ ID NO :215)
hTAR2檢測引物組合0086]hTAR2 正向引物5 ’ -TTGGAGCTGAGGGTAGCTGT
0087]hTAR2 反向引物5，-GAGCAGGGAATTGTGGAAAA
0088]hTAR3檢測弓丨物組合
0089]hTAR3 正向引物5，-TGCTTGTGACTAGCTAAGGAGGA
0090]hTAR3 反向引物5，-CGCCTGGCCTTGAATAAATA
0091]表2反義核酸序列表
(SEQID NO :216)
(SEQID NO :217)
(SEQID NO :218)
(SEQID NO :219)
0092]TAROI-AsI:5，-AACCTTGTGGGCTATATAAC(SEQIDNO:240)0093]TAR01-As2:5，-CCCTACCCCCACCTCAAACT(SEQIDNO:241)0094]TAR01-As3:5，-CTCAAATCAGCACAGATGTG(SEQIDNO:242)0095]TAR08-Asl:5，-CCTATTCAACTGGGCTCAGC(SEQIDNO:243)0096]TAR08-As2:5，-ACCCAGTCCAGCTTCAAGAT(SEQIDNO:244)0097]TAR08-As3:5，-TCATACTTAGCACAGCTTCT(SEQIDNO:245)0098]TAR16-Asl:5，-CATTCTAGGCGAGAAAGCAA(SEQIDNO:246)0099]TAR16-As2:5，-TGCCTGTCAGGAAGGTAGCC(SEQIDNO:247)0100]TAR16-As3:5，-TGGTCTACAGAGTGAGTTCC(SEQIDNO:248)0101]TAR31-Asl:5，-GCAACAGCCAGGTGTGCCTG(SEQIDNO:249)0102]TAR31-As2:5，-GCAGGAAGGATAATGCCACC(SEQ ID NO:250)0103]TAR31-As3:5，-GTGTTTGCCAGCATGCATGT(SEQ ID NO:251)0104]TAR54-Asl:5，-CAGCACTTGGGAGGCAGAGG(SEQ ID NO:252)0105]TAR54-As2:5，-TGCTTGGCCCAGGGAGTGGC(SEQ ID NO:253)
權利要求
1.一種分離的多聚核酸分子，其特征在于所述核酸分子選自1)具有SEQID NO 1所不核酸序列的多聚核酸分子；2)具有SEQID NO 1所不核酸序列的部分核酸序列的多聚核酸分子；3)具有與I)或2)所述多聚核酸分子序列90%或以上同源性核酸序列的多聚核酸分子;4)具有與1)、2)或3)所述多聚核酸分子序列互補核酸序列的多聚核酸分子。
2.權利要求I所述的多聚核酸分子作為分化標志物的應用；優(yōu)選的，權利要求I所述的多聚核酸分子作為脂肪組織分化標志物的應用；更優(yōu)選的，權利要求I所述的多聚核酸分子作為疾病標志物的應用，所述疾病選自脂肪瘤、子宮平滑肌肉瘤、間質瘤、血管粘液瘤、 骨肉瘤、腺樣囊性癌、或II型糖尿??；更優(yōu)選的，權利要求I所述的多聚核酸分子作為疾病治療靶點的應用，所述疾病選自脂肪瘤、子宮平滑肌肉瘤、間質瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺樣囊性癌、或II型糖尿病。
3.一種在離體樣本中檢測權利要求I所述多聚核酸分子表達水平的方法，其特征在于所述方法選自雜交法、擴增法或測序法；優(yōu)選的，所述離體樣本選自分離的體液、淋巴結樣本、或組織樣本；更優(yōu)選的，所述雜交法選自斑點雜交、Northern雜交、或基因芯片雜交；更優(yōu)選的，所述擴增法選自半定量RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR、Taqman PCR ;更優(yōu)選的，所述測序法選自雙脫氧終止測序法、或高通量測序。
4.權利要求3所述的方法在分化標志物檢測中的應用；優(yōu)選的，權利要求3所述的方法在脂肪組織分化標志物檢測中的應用；更優(yōu)選的，權利要求3所述的方法在疾病標志物檢測中的應用，所述疾病選自脂肪瘤、子宮平滑肌肉瘤、間質瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺樣囊性癌、或II型糖尿病。
5.權利要求2-4任一項所述的方法或應用，其特征在于包含以下步驟I)測定權利要求I所述的多聚核酸分子在離體樣本中的水平；2)測定權利要求I所述的多聚核酸分子在參考樣本中的水平；3)比較多聚核酸分子在離體樣本和參考樣本中的水平。
6.一種能降低權利要求I所述多聚核酸分子表達水平的抑制劑；優(yōu)選的，所述抑制劑為小干擾核酸分子；優(yōu)選的，所述抑制劑為shRNA表達載體；優(yōu)選的，所述抑制劑為反義核酸分子。
7.權利要求6所述的抑制劑，其特征在于所述抑制劑為小干擾核酸分子；優(yōu)選的，所述小干擾核酸分子序列選自SEQ ID NO 300-SEQ ID NO :327所示的核酸序列；更優(yōu)選的，所述小干擾核酸分子包含如下修飾中的至少一種1)對核酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；2)對核酸序列中核苷酸的核糖的2’-0H的修飾；3)對核酸序列中核苷酸的堿基的修飾。
8.一種細胞分化抑制劑，其特征在于包含權利要求6或7任一項所述的至少一種抑制劑。
9.一種藥物組合物，其特征在于包含權利要求6或7任一項所述的至少一種抑制劑及藥學上可接受的載體。
10.權利要求6-9任一項所述的抑制劑在制備疾病治療藥物組合物中的應用；優(yōu)選的， 所述疾病選自脂肪瘤、子宮平滑肌肉瘤、間質瘤、血管粘液瘤、骨肉瘤、腺樣囊性癌、以及II 型糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離的具有SEQ ID NO1所示核酸序列或其部分序列的多聚核酸分子；進一步的，本發(fā)明提供了所述多聚核酸分子作為分化標志物或疾病檢測標志物的應用及檢測方法；更進一步的，本發(fā)明提供了能夠降低所述多聚核酸分子表達水平的抑制劑，以及包含該抑制劑的藥物組合物。
文檔編號A61P35/00GK102586237SQ201210036059
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月17日 優(yōu)先權日2012年2月17日
發(fā)明者杜權 申請人:北京大學