專利名稱：抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉一種抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
流行性感冒(Influenza)是由流行性感冒病毒(簡稱流感病毒，Influenza Virus, IV)引起的至今尚未得到有效控制的呼吸道急性傳染病。甲型流感病毒曾引起了全世界數(shù)次大范圍的流行，每次大流行不僅造成了巨大的人力資源和物力資源的損失，還嚴(yán)重危害人類和畜禽健康。禽流感(Avain Influenza Al)和豬流感(Swine Influenza SI)分別是由甲型流感病毒引起的禽類傳染病和畜類傳染病。Smith等人于1933年首次將從人體中所分離到的流感病毒稱之為A型流感病毒。20世紀(jì)人類流感曾發(fā)生過3次瘟疫性的全球大流行，死亡人數(shù)達(dá)2000多萬。禽流感病毒自意大利首次發(fā)現(xiàn)至今，由于候鳥的遷徙和國際間禽類貿(mào)易的日益頻繁，使得該病呈全球性分布，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬在流感病毒的種間傳播方面占有很特別的地位，被認(rèn)為是人、禽和/或豬流感病毒通過基因重排產(chǎn)生新的亞型流感病毒的“混合器”。近年來，人畜共患病毒性疾病頻繁發(fā)生，不僅出現(xiàn)了 SARS等一些新型病毒，而且一些傳統(tǒng)型的人畜共患病毒性疾病呈現(xiàn)流行趨勢，并且隨著病毒的不斷進(jìn)化， 出現(xiàn)了一些新的烈性重組病毒。2009年在全球肆虐的甲型HlNl流感，再次敲響了人畜共患危害人類健康的警鐘。目前，我國流感病毒流行廣泛并且不斷出現(xiàn)變異，毒株間重組的幾率非常高。然而并無效果良好的疫苗，且現(xiàn)有疫苗中，不論是滅活苗、弱毒苗，還是亞單位疫苗，都需要培養(yǎng)大量的致病毒株。不僅給疫苗研制帶來不便，同時(shí)還存在安全性、免疫原性、 產(chǎn)量及保存等諸多方面存在不足，因此迫切需要研制新型的、高效的抗流感疫苗，應(yīng)用新型疫苗來預(yù)防流感的爆發(fā)。多表位疫苗(Multi-epitope Vaccine)也稱雞尾酒式疫苗,是同時(shí)攜帶多個(gè)與目標(biāo)抗原相關(guān)的及輔助性表位的疫苗?？乖砦活A(yù)測大多為計(jì)算機(jī)軟件分析法，即根據(jù)已有的表位數(shù)據(jù)資料，通過計(jì)算機(jī)軟件對氨基酸(或堿基)序列進(jìn)行分析，迅速地預(yù)測出候選抗原表位。流感病毒的主要抗原相關(guān)蛋白有HA和NA、NP、基質(zhì)蛋白M1/M2，其中HA、NA和M2 是豬流感病毒的三種表面抗原分子，針對三種抗原的抗體都有抑制病毒感染的作用，但由于HA和NA抗原變異性很高，不同變異株間不交叉保護(hù)，研制此類抗原疫苗的速度往往跟不上病毒變異。Ml和M2是病毒的兩個(gè)基質(zhì)蛋白，Ml蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，占流感蛋白總量的30% 40%，特異性強(qiáng)，是流感病毒分型的主要依據(jù)之一，IEDB的分析結(jié)構(gòu)顯示Ml 蛋白中存在至少三個(gè)極為保守的抗原決定簇。M2蛋白的氨基酸序列也高度保守，該蛋白在機(jī)體內(nèi)能刺激產(chǎn)生抵抗不同性別流感抗原，但由于M2分子量很小，免疫原性較差，難以誘導(dǎo)高水平的免疫反應(yīng)。NP蛋白是構(gòu)成豬流感病毒的主要核蛋白，各亞型毒株之間氨基酸序列保守，是細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞識(shí)別的內(nèi)部主要抗原。NP和Ml在序列和抗原性上保持相對穩(wěn)定，二者位于病毒內(nèi)部，因此不是誘導(dǎo)中和抗體有效的靶目標(biāo)。然而一旦病毒感染宿主細(xì)胞，這些蛋白可能是激活CTL并克服感染的靶目標(biāo)。2006年Kaiser等提出了通用流感疫苗的設(shè)想，主要基于流感保守的NP和M蛋白。在DNA疫苗及活載體重組疫苗上，大量研究已證實(shí)通過添加NP或M組分,有助于對其他亞型的流感產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)。Ernst等、De Filette分別構(gòu)建了 A型流感病毒M蛋白M2e表位，免疫組小鼠能抵抗HI、H3、H6、H9亞型流感病毒的感染。Kodihal Ii等用火雞H5N2病毒的HA和NP蛋白制備的亞單位復(fù)合疫苗免疫火雞。在免疫后21d，火雞產(chǎn)生高的Hl抗體滴度，并對同源或異源(H6N1)AIV的攻擊產(chǎn)生抵抗力。Jeon等串聯(lián)表達(dá)了 HA、NP蛋白B細(xì)胞的表位、輔助性T細(xì)胞的表位和細(xì)胞毒性 T細(xì)胞表位，將此翻譯肽段免疫小鼠后產(chǎn)生了體液免疫和輔助性T細(xì)胞反應(yīng)，小鼠可抵抗致死性病毒的攻擊，并迅速得以康復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的流感多表位疫苗，其中所描述CTL表位的選擇采用SYFPEITHI、CTLpred、 Multipre對參考毒株序列進(jìn)行分析，對其HLA*0201及HLA*1101的CTL表位進(jìn)行預(yù)測，篩選得分較高，排名靠前的CTL表位，綜合評價(jià)各軟件預(yù)測結(jié)果分析得到所需表位。B表位預(yù)測使用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器BepiPred I. Osever> Bcepred對線性B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測。篩選時(shí)依據(jù)親水性好(hydrophilicity),可及性高(accessibility),可塑性好 (flexibility)，抗原性強(qiáng)(antigenicity)，分子極性強(qiáng)(polarity)，表面暴露(exposed surface)和轉(zhuǎn)角可能性大(Turns)的為候選B細(xì)胞表位。所有預(yù)測表位篩選于HA主要抗原區(qū)和NP、Ml的保守區(qū)域。匯總各項(xiàng)表位預(yù)測結(jié)果，以CTL表位預(yù)測為基礎(chǔ)，使預(yù)測表位盡量覆蓋B細(xì)胞表位預(yù)測區(qū)，以獲得兼有CTL與B細(xì)胞表位功能的預(yù)測表位。應(yīng)用SWISS MODEL SIB Service 和 3D-JIGSAW Protein Comparative Modelling Server 進(jìn)行分子建模，分析候選表位構(gòu)象，最終確定細(xì)胞表位。根據(jù)設(shè)計(jì)的表位，復(fù)原其核酸序列，按照原核優(yōu)勢密碼子規(guī)則進(jìn)行了優(yōu)化，隨后進(jìn)行人工合成?？辜仔土鞲胁《拘滦屯ㄓ帽砦灰呙绲闹苽浞椒?，采用生物信息學(xué)方法，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器和相關(guān)軟件對流感保護(hù)抗原相關(guān)的NP、Ml和HA功能表位進(jìn)行了預(yù)測，獲得來自 H1N1、H3N1、H3N2、H5N1、H5N2亞型CTL表位和B細(xì)胞表位共8條表位，在每兩個(gè)表位之間加入柔性片段GPGPG連接，命名為HMN ;將表位多肽相應(yīng)的核苷酸序列連到質(zhì)粒載體上，原核系統(tǒng)表達(dá)，純化的表達(dá)蛋白配以佐劑制成疫苗，免疫小鼠，所述8條表位分別為SEQ ID No: I至SEQ ID No 8 ；HMN的編碼核苷酸序列為SEQ ID No :9。該多肽通過western blot試驗(yàn),證明目的基因有效表達(dá)且具有抗原性；通過小鼠免疫試驗(yàn)，試驗(yàn)組T淋巴細(xì)胞亞群指數(shù)高于對照組，表明該疫苗可誘導(dǎo)BALC/c小鼠產(chǎn)生針對所選表位的特殊性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，證明其具有免疫原性。


圖I :重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-HMN PCR鑒定；M1 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2 :重組質(zhì)粒 pET28a-HMN PCR 產(chǎn)物；圖2 :重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-HMN酶切鑒定；M1、M2 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :空質(zhì)粒 pET28a 的 BamH Ι+HindIII 雙酶切產(chǎn)物；2 :重組質(zhì)粒 pET28a_HMN 的 BamH Ι+HindIII 雙酶切產(chǎn)物；圖3 :重組蛋白原核表達(dá)，M :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)；1 BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌裂解產(chǎn)物；2 pET28a-BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌裂解產(chǎn)物；3_6 :pET28a_HMN在28°C 分別由 O. Immol/L、0. 2mmol/L、0. 3mmol/L、0. 4mmol/L IPTG 誘導(dǎo)后的細(xì)菌裂解產(chǎn)物；7_10 pET28a-HMN 在 37°C分別由 O. Immol/L、0. 2mmol/L、0. 3mmol/L、0. 4mmol/LIPTG 誘導(dǎo)后的細(xì)菌裂解產(chǎn)物；圖4 :免疫小鼠T淋巴細(xì)胞亞類檢測。A:PBS組；B:市售疫苗組；C:25yg組；D: 50 μ g 組。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例I流感病毒表位篩選搜集已發(fā)表的流感表位，從NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)上分別下載 HI、H3、H5、H9亞型流感HA基因、NP基因和Ml基因的氨基酸和核苷酸序列。生物信息學(xué)MHC類分子預(yù)測采用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器SYFPEITHI (http: //www. syfpeithi. de/home, htm )、CTLpred(http://www. imtech. res. in/raghava/ctlpred/ index, html )、Multipre (http://www. i2r. a-star. Edu. Sg);生物信息學(xué) B 細(xì)胞表位預(yù)測米用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器 BepiPred I. O sever (http://www.cbs.dtu.dk/services/ BepiPred/)、Bcepred (http://www. imtech.res. in/raghava/bcepred/bcepred_ submission, html)> SWISS MODEL SIB Service (http://swissmodel. expasy. org/)和 3D-JIGSAW Protein Comparative Modelling Server(http://bmm. cancerresearchuk. org/ 3djigsaw/)。應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，對多種亞型(H1、H3、H5、H9)流感HA、NP和Ml相關(guān)的CTL 和B細(xì)胞表位進(jìn)行了預(yù)測分析，綜合各項(xiàng)表位篩選獲得CTL/B相關(guān)表位共8條，將表位片段 (請參閱表ISEQ ID No :1至SEQ ID No 8所示)拼接起來(由于多表位基因片段獨(dú)立且較小，在每兩個(gè)氨基酸序列之間添加柔性片段GPGPG，以促進(jìn)表達(dá)蛋白進(jìn)行正確折疊，減少由于空間構(gòu)象相互影響而可能產(chǎn)生的對抗原性的影響)，命名為HMN。表I
權(quán)利要求
1.一種抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗的制備方法，其特征在于，采用生物信息學(xué)方法，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器和相關(guān)軟件對流感保護(hù)抗原相關(guān)的NP、Ml和HA功能表位進(jìn)行了預(yù)測，獲得來自HlNl、H3N1、H3N2、H5N1、H5N2亞型CTL表位和B細(xì)胞表位共8條表位，在每兩個(gè)表位之間加入柔性片段GPGPG連接，命名為HMN ;將表位多肽相應(yīng)的核苷酸序列連到質(zhì)粒載體上，原核系統(tǒng)表達(dá)，純化的表達(dá)蛋白配以佐劑制成疫苗，8條表位分別為SEQ ID No 1 至SEQ ID No 8 ；HMN的編碼核苷酸序列為SEQ ID No :9。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法制備的新型流感病毒多表位串聯(lián)多肽序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗甲型流感病毒新型通用表位疫苗的制備方法，采用生物信息學(xué)方法，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器和相關(guān)軟件對流感保護(hù)抗原相關(guān)的NP、M1和HA功能表位進(jìn)行了預(yù)測，獲得來自H1N1、H3N1、H3N2、H5N1、H5N2亞型CTL表位和B細(xì)胞表位共8條表位，在每兩個(gè)表位之間加入柔性片段GPGPG連接，命名為HMN；將表位多肽相應(yīng)的核苷酸序列連到質(zhì)粒載體上，原核系統(tǒng)表達(dá)，純化的表達(dá)蛋白配以佐劑制成疫苗，免疫小鼠。該重組多肽，通過western blot試驗(yàn)，證明目的基因有效表達(dá)且具有抗原性；通過小鼠免疫試驗(yàn)，試驗(yàn)組T淋巴細(xì)胞亞群指數(shù)高于對照組，表明該多肽可誘導(dǎo)BALC/c小鼠產(chǎn)生針對所選表位的特殊性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，證明其具有較強(qiáng)免疫原性。
文檔編號(hào)A61P31/16GK102600466SQ20121007870
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者張玉娟, 許君, 鄭文明, 馬倩, 高振興 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)