專利名稱：一種猴頭菌多糖及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食用菌提取及深加工領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種猴頭菌多糖及其制備方
法
背景技術(shù)：
猴頭菌(Zferici仰？ erinaceus)隸屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、猴頭菌科、猴燕菌屬，是著名的藥食兩用菌，早在1200年前我國(guó)人民就將其列為“山珍”，與熊掌、海參、魚翅并架齊驅(qū)，有“山珍猴頭，美味燕窩”之說(shuō)。猴頭菌多糖是猴頭菌中最重要的活性成份之一，具有多種生物活性和藥理作用，能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)溶血素的形成，抗白細(xì)胞下降，降血糖，抗凝血，抗血栓、抗突變和抗衰老等。猴頭多糖具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，它對(duì)由ConA誘導(dǎo)的T 一淋巴細(xì)胞有増殖作用，促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞的増殖，對(duì)脂多糖(LPS)刺激的B淋巴細(xì)胞也有協(xié)同作用；此外，猴頭菌多糖對(duì)胃腸粘膜具有保護(hù)及損傷修復(fù)作用。目前常用的提取猴頭菌中多糖的方法主要是常規(guī)的水提醇沉，但是這樣得到的猴頭菌多糖中含有大量的色素，色素的存在不僅影響多糖色澤，且使粗多糖易吸潮；同時(shí)影響多糖的純度及其生物活性，對(duì)產(chǎn)品開發(fā)帶來(lái)不利影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先提供了ー種猴頭菌多糖，其是用如下方法制備得到的
①水提醇沉的方法提取猴頭菌，干燥后得到粗多糖；
②將猴頭菌粗多糖水溶液加入大孔樹脂D315，進(jìn)行脫色，干燥后得到猴頭菌多糖。其中所述的脫色為靜態(tài)脫色，或?yàn)閯?dòng)態(tài)脫色。其中靜態(tài)脫色是將粗多糖水溶液中直接加入大孔樹脂D315，室溫下，粗多糖濃度為 13. 9 mg/ml，pH 為 4，搖床 120rpm,脫色 6h,即可；
其中動(dòng)態(tài)脫色是采用濕法裝柱的方式裝柱，層析柱規(guī)格為3. 5 X 60cm,濃度為13. 9 mg/ml的粗多糖水溶液4000rpm離心30分鐘，上清用鹽酸調(diào)pH至4. 00，流速為0. 6BV/h,上樣量為3.7 g多糖/100 ml樹脂。該樹脂動(dòng)態(tài)脫色完成后，用IL lmol/L的NaCl沖洗柱子，可連續(xù)上樣八次以上。本發(fā)明使用的大孔弱堿性陰離子交換樹脂為丙烯酸-ニこ烯苯共聚體骨架，功能基團(tuán)為E N，具體是購(gòu)自上海華震科技有限公司的D315樹脂。所述的大孔弱堿性陰離子交換樹脂D315在進(jìn)行脫色前，最好先進(jìn)行下述步驟的預(yù)處理先用蒸餾水清洗至無(wú)泡沫，無(wú)渾濁，再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小時(shí)，然后倒出堿液，用蒸餾水漂洗至中性。接著將樹脂用3-5%的HCl溶液浸泡4小時(shí)，然后倒出酸液，用蒸餾水漂洗至中性；再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小時(shí)，然后倒出堿液，用蒸餾水漂洗至弱堿性備用。脫色后的猴頭菌粗多糖水溶液，使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥處理，最終得到顏色較淺的猴頭菌多糖產(chǎn)品。
本發(fā)明還提供了制備上述猴頭菌多糖的方法，該方法包括如下步驟
①水提醇沉的方法提取猴頭菌，干燥后得到粗多糖；
②將猴頭菌粗多糖水溶液加入大孔樹脂D315，進(jìn)行脫色，干燥后得到猴頭菌多 糖。本發(fā)明提供的經(jīng)過脫色的猴頭菌多糖，制備方法簡(jiǎn)便、適用于大規(guī)模生產(chǎn)。脫色率可達(dá)到70%以上，多糖保留率達(dá)到75%以上，并且該猴頭菌多糖的免疫活性顯著提高，優(yōu)于未脫色的猴頭菌多糖和其他方法脫色的猴頭菌多糖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I水提醇沉法制備猴頭菌粗多糖
將猴頭菌子實(shí)體用粉碎機(jī)粉碎成顆粒，按照液料比15 1 (體積升比重量公斤)加入相應(yīng)體積的蒸餾水，加熱煮沸持續(xù)2h，之后用濾布(100目)過濾，濾渣重復(fù)上述步驟再提取ー次后過濾，合并兩次提取的濾液。濾液按濃縮比I :1濃縮后，70%こ醇沉淀，棄上清，沉淀溶于水，噴霧干燥最終得到猴頭菌粗多糖干品。實(shí)施例2體外刺激巨噬細(xì)胞生成NO實(shí)驗(yàn)
將實(shí)施例I制備得到的猴頭菌粗多糖干品配制成10mg/ml的粗多糖水溶液，然后分別進(jìn)行如下三種方法脫色。①雙氧水脫色粗多糖溶液濃度為10mg/ml，用氨水調(diào)pH至8. O，加入3%的30%的雙氧水，60で水浴180分鐘，調(diào)pH至7. O，取樣。②D315樹脂脫色粗多糖溶液濃度為10mg/ml，體積為100ml，加入20ml的大孔樹脂，搖床中120rpm， 25 °C，9小時(shí)，取樣。雙氧水脫色、D315樹脂脫色及未脫色粗多糖溶液于分子截流量為3500的透析袋透析除去小分子。將脫色后的猴頭菌多糖水溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后先放置于_20°C冷凍12h，然后置于-80攝氏度冷凍12h，之后轉(zhuǎn)到冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥處理，最后得到脫色的猴頭囷多糖。供試樣品的配制
精確稱取以上得到的猴頭菌多糖樣品于滅過菌的印pendorf管中，用PBS緩沖液配置成濃度5mg/mL。充分溶解后以12000 rpm/min離心30分鐘,無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌eppendorf管中，將樣品稀釋成25、50、100 u g/mL待用?？瞻讓?duì)照為PBS緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照為 10 ii g/mL LPS 溶液。小鼠RAW264. 7巨噬細(xì)胞的制備
用DMEM培養(yǎng)基在37°C、5% CO2條件下傳代培養(yǎng)后，用0. 05%胰蛋白酶消化，混懸液300 X g離心3min后收集細(xì)胞，用無(wú)色RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋到一定濃度備用。巨噬細(xì)胞釋放NO活性的測(cè)定
由于NO極不穩(wěn)定,在體內(nèi)很快生成亞硝酸基(NO2-)和硝酸基(NO3-),故采用Griess法測(cè)定樣品中的NO2- /NO3-作為衡量NO水平的指標(biāo)。( I)用亞硝酸鈉制標(biāo)準(zhǔn)曲線
配成不同濃度的亞硝酸鈉溶液，濃度梯度為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100iiM共11個(gè)；取100 y L于96孔板，加入50 i! L Griess試劑，測(cè)定543nm吸光值，標(biāo)準(zhǔn)曲線每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2) NO產(chǎn)量測(cè)定
吸掉巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)液，加PBS 2 ml，震蕩再吸棹。用0.05%胰酶或5% EDTA溶液在培養(yǎng)箱37°C中3-5min消化巨噬細(xì)胞。消化完畢，加入ImL DMEM完全培養(yǎng)基+胎牛血清終止反應(yīng)，離心，吸掉消化液，加入ImL無(wú)色RPMI1640 (10%胎牛血清+1%抗生素液體)，計(jì)數(shù)。用無(wú)色RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至5 X 105/ml，加入96孔板，每孔加入180 y L，然后再加入20 ii L待測(cè)樣品，37°C培養(yǎng)48h。取100 y L上清于96孔板，加入50 u LGriess試劑，顯色I(xiàn)Omin后，于波長(zhǎng)543nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的NO量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
雙氧水脫色猴頭多糖與未脫色猴頭多糖測(cè)定的巨噬細(xì)胞中NO的含量(単位iimoL/5. OXlO8Cells)分別為17.30、7. 95 (樣品濃度 25 y g/mL) ;23. 61 ,12. 60 (樣品濃度50 ii g/mL); 13. 49 ,15.71 (樣品濃度100 y g/mL)?？梢钥闯?，實(shí)施例2中的雙氧水脫色猴頭菌多糖與實(shí)施例I中的相比，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的活性降低。樹脂D315脫色猴頭菌多糖與未脫色猴頭菌多糖測(cè)定的巨噬細(xì)胞中NO的含量(單位ymoL/5. OXlO8ceIls)分別為26. 29、8. 64 (樣品濃度 10 u g/mL) ；34. 92,24. 70 (樣品濃度 25 u g/mL) ；42. 42>31. 89 (樣品濃度50ii g/mL)，可以看出，實(shí)施例2中的樹脂D315脫色猴頭多糖與實(shí)施例I中的相比，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的活性顯著增強(qiáng)。實(shí)施例3
將實(shí)施例I得到的猴頭菌粗多糖配制成10mg/ml的水溶液。取瓜202，1206，335，0315，0303(購(gòu)自上海華震科技有限公司)，脫色ー號(hào)(購(gòu)自滄州寶恩吸附材料科技有限公司)六種大孔樹脂各20ml，和IOOml 10mg/ml離心后的猴頭多糖(4000rpm，30min)溶液混和，迅速搖勻后取樣，為初樣，將三角瓶放到搖床中，溫度設(shè)為25°C，120rpm。吸附9小時(shí)，用濾布過濾，IOOml蒸餾水清洗，過濾，再用50ml蒸餾水清洗，過濾，合并濾液，旋蒸儀濃縮，定容至100ml，取50ml凍干，另50ml透析。測(cè)多糖含量，算出得率。體外刺激巨噬細(xì)胞生成NO實(shí)驗(yàn)的操作方法同實(shí)施例2。體外刺激淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的操作步驟如下
供試樣品的配制
精確稱取多糖樣品(實(shí)施例I、實(shí)施例2中得到的猴頭多糖)于滅過菌的印pendorf管中，用PBS緩沖液配置成濃度10 mg/mL。充分溶解后以12000 rpm/min離心30分鐘，無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌eppendorf管中，將樣品稀釋成200、500、1000 u g/mL待用。空白對(duì)照為PBS緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照為60 u g/mL PHA溶液。小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備
小鼠頸椎脫臼處死，取脾臟，用PBS沖洗:T4次。用100目篩在培養(yǎng)皿中將脾臟磨碎，磨碎后的混懸液以400 Xg離心6 min,吸去上清液，加入濃度為0. 83%氯化氨溶液裂解紅細(xì)胞，反復(fù)沖打，靜置10 min后400Xg離心6 min，收集的細(xì)胞用PBS緩沖液沖洗數(shù)遍后，臺(tái)朌藍(lán)檢查活力在95%以上。用RPMI1640將細(xì)胞稀釋成2X IO6個(gè)/mL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5%的CO2下培養(yǎng)。
淋巴細(xì)胞増殖率的測(cè)定
將180 UL每mL含2X IO6個(gè)淋巴細(xì)胞的懸浮液加至96孔板中，同時(shí)加入20 y L樣品，于37°C、含5%的CO2條件下培養(yǎng)3 d，用酶標(biāo)儀測(cè)定其570 nm和600 nm處的吸光度，然后加入20 uL Alamar Blue試劑，再培養(yǎng)，變色后再測(cè)定570 nm和600 nm處的吸光度，然后根據(jù)Alamar Blue試劑的公式計(jì)算各種樣品對(duì)細(xì)胞増殖的影響。計(jì)算公式
淋巴細(xì)胞增殖率(%) = [117216XA157Q(sample)-80586XA 麵(sample)]
/ [117216 X A1570 (control) -80586 X A1600 (control) ] X 100%
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
六種大孔樹脂HZ202、JK206、335、D315、D303、脫色一號(hào)脫色后猴頭菌多糖測(cè)定的巨噬細(xì)胞中 NO 的含量(單位u moL/5. OXlO8Cells)分別為:18. 46,12. 77 ,22. 77,26. 59、27. 24,23. 18 (樣品濃度 25u g/mL)；24. 32、18. 71、27. 00,31. 63,26. 59,26. 67 (50 u g/mL)；30. 01,22. 53、34. 15、37. 89、35. 86、33. 83 (IOOu g/mL) 可以看出，各樹脂脫色猴頭多糖相比，D315刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的活性最高。五種大孔樹脂HZ202，335，D315，D303，脫色一號(hào)脫色后猴頭多糖測(cè)定的淋巴細(xì)胞增值率(％)分別為230%, 226%, 234%, 271%, 251% (樣品濃度 50 u g/mL) ;239%，261%, 251%,265%, 308% (100 u g/mL) ；204%, 250%, 273%, 266%, 247% (200 u g/mL)。各樹脂脫色后的猴頭菌多糖相比，D315，D303，脫色一號(hào)脫色后猴頭多糖都具有較好的刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性。實(shí)施例4
實(shí)施例I的猴頭粗多糖干品配成13. 8mg/ml的猴頭菌粗多糖溶液，離心除去沉淀部分。大孔弱堿性陰離子交換樹脂D315的預(yù)處理
先用蒸餾水清洗至無(wú)泡沫，無(wú)渾濁，再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小時(shí)，然后倒出堿液，用蒸餾水漂洗至中性。接著將樹脂用3-5%的HCl溶液浸泡4小時(shí)，然后倒出酸液，用蒸餾水漂洗至中性；再用3-5%的NaOH溶液浸泡4小時(shí)，然后倒出堿液，用蒸餾水漂洗至弱堿性備用。IOOmL 13. 85mg/ml的猴頭菌粗多糖水溶液加入37mL已預(yù)處理好的大孔弱堿性陰離子交換樹脂D315，于250mL三角燒瓶中，置于搖床中震蕩，120rpm, 25°C、pH4. 0條件下脫色6h，然后用濾布(100目)過濾，收集脫色后的猴頭菌多糖水溶液，進(jìn)行脫色的測(cè)定以及多糖保留率的測(cè)定。猴頭菌多糖水溶液，稀釋100倍后用苯酚硫酸法在490nm下測(cè)定脫色前后多糖含量，在450nm下測(cè)定脫色前后色素含量。計(jì)算公式
f Mfe mm. mt ^J
Sfi色寒.<%> = -
脫色_ ItIS-空白義吸光度
脫色翁多■含色湯多糖含蹙r
多纏—窗孿(%) = - *100%
—Ift色鋳多糖含ft _I結(jié)果脫色率達(dá)到69. 35%，多糖保留率達(dá)到80. 16%。3.冷凍干燥
將脫色后的猴頭粗多糖水溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后先放置于_20°C冷凍12h，然后置于-80攝氏度冷凍12h，之后轉(zhuǎn)到冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥處理，最后得到顏色較淺的猴頭囷多糖。實(shí)施例5
實(shí)施例I的猴頭粗多糖干品配成13. 9mg/ml的猴頭菌粗多糖溶液，離心除去沉淀部分。陰離子交換樹脂D315的預(yù)處理(樹脂預(yù)處理方法同實(shí)施例4)
取IOOml預(yù)處理好的大孔樹脂D315，采用濕法裝柱的方式裝柱，層析柱規(guī)格為
3.5X60cm，配置濃度為13. 9 mg/ml的粗多糖，4000rpm離心30分鐘，取上清，用鹽酸調(diào)PH至4. 00，流速為0. 6BV/h,上樣量為3. 7g多糖/IOOml樹脂，該樹脂脫色完成后，用IL Imol/L的NaCl沖洗柱子，可連續(xù)上樣八次以上。脫色后的猴頭菌多糖水溶液，使用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥處理，最終可得到顏色較淺的猴頭菌多糖產(chǎn)品。測(cè)定其多糖含量和色素，與實(shí)施例I的相比，計(jì)算得到其脫色率為75. 7%，多糖保留率為77. 8%。
權(quán)利要求
1.ー種猴頭菌多糖，其特征在于其是用如下方法制備得到的 ①水提醇沉的方法提取猴頭菌，干燥后得到粗多糖； ②將猴頭菌粗多糖水溶液加入大孔樹脂D315，進(jìn)行脫色，干燥后得到猴頭菌多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的猴頭菌多糖，其特征在于步驟②中所述的脫色的方法為 將粗多糖水溶液中加入大孔樹脂D315，室溫下，pH為4，搖床120rpm，脫色6h，即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的猴頭菌多糖，其特征在于步驟②中所述的脫色的方法為采用濕法裝柱的方式裝柱，層析柱規(guī)格為3. 5 X 60cm,濃度為13. 9 mg/ml的粗多糖水溶液4000rpm離心30分鐘，上清用鹽酸調(diào)pH至4. 00，流速為0. 6BV/h,上樣量為3. 7 g多糖/100 ml樹脂。
4.ー種制備權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述猴頭菌多糖的方法，其特征在于包括如下步驟 ①水提醇沉的方法提取猴頭菌，干燥后得到粗多糖； ②將猴頭菌粗多糖水溶液加入大孔樹脂D315，進(jìn)行脫色，干燥后得到猴頭菌多糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種猴頭菌多糖及其制備方法。該猴頭菌多糖是采用先水提醇沉，然后用大孔樹脂進(jìn)行脫色的方法制備得到。本發(fā)明得到的猴頭菌多糖保留率達(dá)到75%以上，并且該猴頭菌多糖的免疫活性高。
文檔編號(hào)A61P37/04GK102643359SQ201210103089
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月10日
發(fā)明者劉艷芳, 吳迪, 周帥, 唐慶九, 張勁松, 楊焱, 汪雯瀚, 蔣俊 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院