專利名稱：miR-7表達(dá)抑制劑在制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及miR-7表達(dá)抑制劑在制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是最為經(jīng)典的自身免疫病，幾乎涵蓋了整個(gè)免疫系統(tǒng)的紊亂，免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子組成，免疫反應(yīng)包括固有免疫和適應(yīng)性免疫，近年研究發(fā)現(xiàn)micro RNA (miRNA，微RNA)參與免疫系統(tǒng)的紊亂。miRNAs是ー類20-22個(gè)寡核苷酸的非編碼RNA，成熟miRNA通過核酸序列互補(bǔ)識別特定靶mRNA的3’ UTR區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶mRNA表達(dá)，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。miRNAs廣泛存在于從病毒、線蟲、植物到動物體內(nèi)，參與生物體的生長、發(fā)育、衰老、凋亡的調(diào)控及遺傳背景的穩(wěn)定。2002年，Calin GA等人發(fā)現(xiàn)miR-15/miR_16在人慢性淋巴瘤中表達(dá)下調(diào)，首次將microRNA的研究與人類疾病相聯(lián)。Satoh M等發(fā)現(xiàn)，在冠狀動脈心臟病中，let-7i的表達(dá)與TLR-4信號相關(guān)。在造血干細(xì)胞向免疫細(xì)胞分化的不同階段，miRNA表達(dá)會發(fā)生相應(yīng)的變化，Monticelli S在對小鼠的造血系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞成熟過程中miR-150表達(dá)水平明顯升高，但是在進(jìn)ー步向Thl、Th2亞群分化時(shí)它的表達(dá)水平迅速下降。脾臟來源的成熟B細(xì)胞中可以檢測到miR-150表達(dá)明顯上調(diào)，而在骨髓來源的pro-B細(xì)胞中并無上調(diào)。miR-181a在T細(xì)胞分化早期雙陰性期表達(dá)水平較高，而在雙陽性期及以后時(shí)期其水平又明顯下降。miR-223可抑制粒細(xì)胞的擴(kuò)增及活化，miR-223缺陷的粒細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的氧化耐受和殺傷白色念珠菌的能力。有研究發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，bic/miR-155+小鼠體內(nèi)出現(xiàn)膠原沉積、抗體滴度低、T細(xì)胞反應(yīng)水平低等近似人自身免疫病表現(xiàn)。在人樹突狀細(xì)胞，敲除miR-155后IL-IP等前炎分子的表達(dá)增加。巨噬細(xì)胞中miR-155的生成依賴TLR信號井能抑制DNA損害誘導(dǎo)的凋亡。miR-17-92簇參與胸腺陰性選擇過程，并可通過抑制BM和PTEN表達(dá)延長T細(xì)胞存活期。miR-326通過作用于其靶基因ETSl促進(jìn)Thl7細(xì)胞分化。Dai等通過芯片技術(shù)分析了 SLE及正常人PBMC中miRNA表達(dá)譜差異，發(fā)現(xiàn)16個(gè)SLE相關(guān)miRNA。Tang等應(yīng)用Taqman PCR方法檢測了 156個(gè)成熟miRNAs在SLE和正常對照組間的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)包括miR-146a在內(nèi)的42個(gè)miRNAs在SLE患者中存在表達(dá)差異，并發(fā)現(xiàn)miR-146a通過作用于I型干擾素通路調(diào)節(jié)SLE的病理過程。目前關(guān)于miR-146a與SLE的發(fā)病機(jī)制已有相關(guān)研究，然而對miR_7的研究主要在腫瘤方面，Lu ZJ發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，過表達(dá)Mir-7能夠抑制腫瘤細(xì)胞遷移并抑制腫瘤生成。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化，皮質(zhì)發(fā)育和胚胎干細(xì)胞分化中，miR-7和miR-214特異表達(dá)，并控制突起的生長。在胃炎和胃部腫瘤中，miR-7表達(dá)量下調(diào)，并且與炎癥負(fù)相關(guān)，提示其具有腫瘤抑制作用，在胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Mir-7能夠抑制細(xì)胞増殖和集落形成。在肝細(xì)胞癌中，過表達(dá)miR-7能夠抑制肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，這ー作用是通過Mir-7作用于PI3K/AKT通路實(shí)現(xiàn)的。但是，也有研究表示miR-7促進(jìn)了腫瘤的形成，比如在肺癌中，EGFR能夠通過Ras/ERK/Myc通路，促進(jìn)Mir_7表達(dá)。在肺中異常的miR_7表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，并且使裸鼠的致死率顯著提高。另ー方面，在內(nèi)分泌系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)Mir-7在胰島高表達(dá)，在胚胎發(fā)育早期，利用反義序列抑制miR-7能夠抑制出生后胰島素的生成量，減少beta細(xì)胞的數(shù)量和葡萄糖的耐受水平。miR-7還參與了蛋白合成，在工程細(xì)胞CHO細(xì)胞中過表達(dá)Mir-7會抑制細(xì)胞生長。Doxakis E發(fā)現(xiàn)Alpha-突觸核蛋白的表達(dá)會受到Mir_7與miR-153的負(fù)調(diào)控。然而，miR-7在自身免疫病特別是SLE的發(fā)病中的作用尚無研究。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供miR-7表達(dá)抑制 劑在制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的應(yīng)用。其中，所述的所述的miR-7表達(dá)抑制劑優(yōu)選為miR_7反義單鏈寡核苷酸和/或miR-7-sponge。本發(fā)明中，miR-7的登錄號為 MIMAT0000252 (http://www.miRbase.org)。miR_7的前體為 miR-7-l,登錄號為 MI0000263 (http://www. miRbase. org)。miR-7反義單鏈寡核苷酸可人工合成或直接市售獲得；miR_7海綿(miR-7-sponge)可根據(jù)小RNA sponge技術(shù)構(gòu)建。進(jìn)ー步的，所述的miR-7反義單鏈寡核苷酸還可經(jīng)PNA、LNA或2_0me修飾。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的miR-7表達(dá)抑制劑為Anti-miRTMmiR-7Inhibitor,購自 Ambion 公司。本發(fā)明還提供含有miR-7表達(dá)抑制劑的系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療藥物。其中，所述的miR-7表達(dá)抑制劑優(yōu)選為miR-7反義單鏈寡核苷酸和/或miR-7-sponge。進(jìn)ー步的，所述的所述的miR-7反義單鏈寡核苷酸還可經(jīng)PNA、LNA或2_0me修飾。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的miR-7表達(dá)抑制劑為Anti-miRTMmiR-7Inhibitor,購自 Ambion 公司。檢測初治SLE患者和正常對照PBMC中miR_7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SLE患者miR_7的表達(dá)顯著高于HC，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0. 86±0. 03vs0. 10±0. 08，p=0. 0001)。SLE患者B細(xì)胞中miR-7的表達(dá)顯著高于HC，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0. 59±0. 08vs0. 31 ±0. 06, p=0. 027)，然而SLE患者T細(xì)胞及單核細(xì)胞中miR-7的表達(dá)與HC無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0. 91±0. 18vs0. 99±0. 18，p=0. 78，I. 30±0. 36vs0. 98±0. 02，p=0. 70)，所以miR-7表達(dá)量的差異主要集中在B細(xì)胞。通過生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-7的靶基因，挑選與SLE發(fā)病可能相關(guān)的8個(gè)(PTEN、F0X01、CD200R1、XIAP, RELA, CD72、BCL2L11、IL17RB)，采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證，各組熒光素酶活性均下降(P〈005)，說明miR-7可以通過與PTEN、FOXOU CD200R1、XIAP、RELA、CD72、BCL2L11、IL17RB 的 3' UTR 區(qū)相互作用發(fā)揮功能。比較初治SLE患者及HC的T、B細(xì)胞中PTEN mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在SLE患者B細(xì)胞中表達(dá)較HC下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0. 92±0. 24vs 2. 20±0. 49，p=0. 041)，在T細(xì)胞中的表達(dá)與 HC 相比無明顯差異(I. 23±0. 24vs I. 55±0. 53，p=0. 579)。通過電轉(zhuǎn)染的方法，分別轉(zhuǎn)染Pre-miR miR_7Precursor、Anti-miR miR-7Inhibitor、Pre-miR miRNA Precursors-Negative Control、Anti-miR miRNAInhibitors-Negative Control 至外周血 B 細(xì)胞中，結(jié)果 Pre-miR miR-7Precursor 能夠在B細(xì)胞中有效過表達(dá)miR-7，Anti-miR miR-7Inhibitor能夠在B細(xì)胞中有效抑制表達(dá)miR-7。在B細(xì)胞中過表達(dá)或抑制表達(dá)miR-7后，PTEN的mRNA水平相應(yīng)下調(diào)或上調(diào)，B細(xì)胞增殖功能相應(yīng)增強(qiáng)或減弱，說明在人的B細(xì)胞中，miR-7能夠直接抑制PTEN的表達(dá)水平，井能夠促進(jìn)B細(xì)胞増殖，而抑制表達(dá)miR-7后能促進(jìn)PTEN的表達(dá)水平，并能夠抑制B細(xì)胞増殖。在PBMC中轉(zhuǎn)染Ad-miR-7或Ad-GFP，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Ad-GFP 48小時(shí)后CD200R1的陽性率為25. 13%，平均熒光強(qiáng)度MFI=406. 55，轉(zhuǎn)染Ad_miR-748小時(shí)后CD200R1的陽性率為7. 51%，平均熒光強(qiáng)度MFI=262. 86，說明miR_7能夠直接下調(diào)CD200R1的表達(dá)水平。SLE患者miR-7的表達(dá)水平顯著高于健康對照，并且SLE患者B細(xì)胞中miR_7的表 達(dá)顯著高于健康對照，表明SLE患者高表達(dá)miR-7參與SLE的發(fā)病。另ー方面，SLE患者B細(xì)胞中PTEN的表達(dá)低于健康對照，表明SLE患者低表達(dá)PTEN參與SLE的發(fā)病。本發(fā)明證明PTEN是miR-7的靶基因，又由于SLE患者高表達(dá)miR_7，表明miR_7參與SLE發(fā)病。因此，miR-7表達(dá)抑制劑能夠通過糾正SLE患者PTEN的低表達(dá)，并且抑制B細(xì)胞的增殖而起到治療SLE的作用。通過將miR-7表達(dá)抑制劑，如miR_7反義單鏈核苷酸和/或miR-7-sponge直接注射給患者，使miR-7抑制劑與體內(nèi)miR-7結(jié)合，而阻斷miR_7對其靶基因的作用，進(jìn)而起到治療的目的。


圖ISLE患者及HC不同細(xì)胞亞群中miR_7的相對表達(dá)量。圖2所示為靶基因的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測結(jié)果。圖3所示為SLE患者及HC的T、B細(xì)胞中靶基因PTEN mRNA的表達(dá)。圖 4 所不為轉(zhuǎn)染 Pre-miR miR-7Precursor> Pre-miR miRNAPrecursors-Negative Control、Anti-miR miR-7 Inhibitor、Anti-miR miRNAInhibitors-Negative Control 后，RT-PCR 檢測 miR_7 的表達(dá)。圖5所示為在B細(xì)胞中過表達(dá)或抑制表達(dá)miR-7后，PTEN的mRNA水平的變化。圖 6 所不為轉(zhuǎn)染 Pre-miR miR-7Precursor> Pre-miR miRNAPrecursors-Negative Control、Anti-miR miR-7Inhibitor > Anti-miR miRNAInhibitors-Negative Control 后，B 細(xì)胞的增埴能力。圖7所示為腺病毒轉(zhuǎn)染效率及miR-7對⑶200R1表達(dá)水平的影響。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。共采集20例SLE患者，為北京協(xié)和醫(yī)院2009 2011年門診初治患者，均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1997年修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除患有其它全身性疾病者。正常對照20例來自健康志愿者，年齡、性別與病例匹配，同時(shí)不得具備SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)中的任何一條。實(shí)施例ISLE患者及HC的PBMC、T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞中miR_7的表達(dá)
用Trizol法抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用實(shí)時(shí)定量PCR法擴(kuò)增測定miRNA表達(dá)。采用TaqMan探針法，試劑為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)商品化的引物及試劑盒(反轉(zhuǎn)試劑盒名稱 FG，Taqman (r)microRNA RT Kit 200rxns，貨號 4366596 ;PCR 試劑盒名稱 TaqManGene Expression Master Mix,貨號 4369016 ;反轉(zhuǎn)引物及 PCR 引物名稱 TaC|lV丨MicroRNA Assays 50RT+150PCR，貨號貨號 4427975)。收集初治SLE患者和HC各4例，檢測PBMC中miR_7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SLE患者miR_7的表達(dá)顯著高于HC，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0. 86±0. 03vs0. 10±0. 08, p=0. 0001)，為進(jìn)ー步明確各細(xì)胞亞群上miR-7的表達(dá)差異，收集SLE患者12例及HC6例，通過流式細(xì)胞儀分選T、B細(xì)胞及單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SLE患者B細(xì)胞中miR-7的表達(dá)顯著高于HC，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0. 59±0. 08vs0. 31 ±0. 06，p=0. 027)，然而SLE患者T細(xì)胞及單核細(xì)胞中miR-7的表達(dá)與HC 無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0. 91±0. 18vs0. 99±0. 18，p=0. 78，I. 30±0. 36vs0. 98±0. 02，p=0. 70)，所以miR-7表達(dá)量的差異主要集中在B細(xì)(圖I)。實(shí)施例2雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證預(yù)測的miR-7的靶基因通過Targetscan、PicTar及miRanda三個(gè)軟件對miR_7的祀基因進(jìn)行預(yù)測，根據(jù)這些靶基因的生物學(xué)功能是否與自身免疫病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，選取8個(gè)作為miR-7的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證，分別為 PTEN、F0X01、CD200R1、XIAP, RELA, CD72、BCL2L11、IL17RB?？寺iR-7預(yù)測的靶基因3’ -UTR序列，并在引物兩端加上酶切位點(diǎn)XbaI (5，-TCTAGA-3，)和 NotI (5，-GCGGCCGC-3’)。引物序列如下
權(quán)利要求
1.miR-7表達(dá)抑制劑在制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的miR-7表達(dá)抑制劑為miR-7反義單鏈寡核苷酸和/或miR-7海綿。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的miR-7反義單鏈寡核苷酸經(jīng)PNA、LNA或2-Ome修飾。
4.如權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的miR-7表達(dá)抑制劑為Anti-miR miR-7Inhibitor。
5.含有miR-7表達(dá)抑制劑的系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療藥物。
6.如權(quán)利要求5所述的藥物，其特征在于，所述的miR-7表達(dá)抑制劑為miR-7反義單鏈寡核苷酸和/或miR-7海綿。
7.如權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于，所述的miR-7反義單鏈寡核苷酸經(jīng)PNA、LNA或2-Ome修飾。
8.如權(quán)利要求5或6所述的藥物，其特征在于，所述的miR-7表達(dá)抑制劑為Anti-miR miR-7Inhibitor。
全文摘要
本發(fā)明公開了miR-7表達(dá)抑制劑在制備治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供含有miR-7表達(dá)抑制劑的系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療藥物。在B細(xì)胞中抑制表達(dá)miR-7后，PTEN的mRNA水平上調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞增殖功能減弱，表明miR-7表達(dá)抑制劑可通過調(diào)控PTEN基因的表達(dá)來影響B(tài)細(xì)胞的增殖功能，從而起到治療SLE的作用。同時(shí)，miR-7也通過抑制其靶基因CD200R1參與SLE發(fā)病，因此抑制miR-7的表達(dá)可以起到治療SLE的目的。
文檔編號A61P19/04GK102813926SQ20121028567
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月10日
發(fā)明者張烜, 李揚(yáng), 沈濂, 吳湘妮 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院