專利名稱：一種雞傳染性支氣管炎抗原抗體復(fù)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利涉及一種雞傳染性支氣管炎抗原抗體復(fù)合物及其制備方法，屬于生物疫苗領(lǐng)域。背景知識雞傳染性支氣管炎(IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種高度接觸傳染的疾病，主要侵害雞的呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)和消化系統(tǒng)。雛雞發(fā)病后通常表現(xiàn)流鼻液、呼吸困難等呼吸道癥狀，甚至?xí)l(fā)生死亡；此外，該病還可導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋量下降和蛋白品質(zhì)下降，是目前嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重大傳染病之一，給家畜養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì) 損失。目前尚無特效療法，主要采用接種疫苗方式。由于傳染性支氣管炎病毒血清型復(fù)雜且相互之間交叉保護(hù)力弱，而且新的血清型和變異株不斷出現(xiàn)，如果選擇的疫苗不當(dāng)，不但起不到預(yù)防的效果，而且還可能給當(dāng)?shù)卦鎏硇碌牟《局?。所以用疫苗前必須掌握?dāng)?shù)丶膊×餍械牟《狙逍?，并使用與當(dāng)?shù)亓餍卸局昕乖砸恢碌囊呙缙废?，這樣才能達(dá)到有效的免疫預(yù)防目的。目前市場上還是主要以弱毒苗為主，雖然有一定的治療效果，但是，效果還不是很好，針對目前這種狀況，研制出一種安全、有效、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的疫苗就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種雞傳染性支氣管炎抗原抗體復(fù)合物，該復(fù)合物性能穩(wěn)定、免疫作用快、免疫力強(qiáng)。本發(fā)明的目的還在于提供一種雞傳染性支氣管炎抗原抗體復(fù)合物的制備方法，該方法操作簡單，成本低。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)首先按常規(guī)方法制備抗原，然后制得抗體，最后將抗原抗體按最合適的比例進(jìn)行配比。具體實(shí)施方案如下I.抗原的制備(I)病毒的繁殖Massachusetts41病毒株接種雞胚,繁殖溫度為35_37°C,每天照兩次蛋，收獲24-60h死亡的雞胚尿囊液；對于60h的活胚需置2-8°C過夜，然后收獲尿囊液,收獲尿囊液時(shí),需棄去24h之前死亡的雞胚；對收獲的病毒尿囊液進(jìn)行檢驗(yàn),凡菌檢為陽性，毒價(jià)彡IO7EID5tlA). lmL，作為制備疫苗的部分的抗原液。(2)病毒液的濃縮、純化用醋酸鋅沉淀法濃縮病毒液，Sepharose 4FF凝膠層析柱純化病毒液。2.抗體的制備用抗原配制油乳劑滅活疫苗免疫25日齡的SPF雞，胸部肌肉分點(diǎn)注射，免疫3次，每次間隔2周，最后I次免疫是在第3周后用活毒加強(qiáng)免疫I次，第2周后心臟無菌采血分離血清，初步得到的IBV抗血清，首先在54-58°C的水浴鍋中水浴20-40min滅活補(bǔ)體，在3-5°C下以4000-6000r/min離心20_40min，吸取淡黃色上清液作為制備疫苗的抗體。經(jīng)檢驗(yàn)，制備的抗體無菌，血凝抑制價(jià)大于I :28的血清經(jīng)檢驗(yàn)合格后保存?zhèn)溆谩?.抗原抗體復(fù)合物疫苗的配制及檢測用制備好的抗原和抗體按不同的體積比例進(jìn)行復(fù)合，抗原與抗體的體積比分別為3:4 8，加入凍干保護(hù)劑充分混合后進(jìn)行真空凍干。配制成抗原抗體復(fù)合物疫苗用HA試驗(yàn)檢測復(fù)合物的血凝價(jià)，并按常規(guī)方法測定復(fù)合物的EID5(i。制備的抗原抗體復(fù)合物每份所含的抗原量與常規(guī)疫苗所含的抗原量一樣。經(jīng)試驗(yàn)測定，復(fù)合物的HA效價(jià)在抗原抗體的比例在3:4 8時(shí)效價(jià)最大,免疫力效果最好。本發(fā)明獲得的復(fù)合物具有性能穩(wěn)定、安全性好、動物免疫后產(chǎn)生免疫作用快、免疫力強(qiáng)、保護(hù)率高特點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合一些具體實(shí)施方式
對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)介紹。實(shí)施例I(I)病毒的繁殖Massachusetts41病毒株接種雞胚,繁殖溫度為35°C,每天照兩次蛋，收獲24_60h死亡的雞胚尿囊液；對于60h的活胚需置5°C過夜，然后收獲尿囊液，收獲尿囊液時(shí)，需棄去24h之前死亡的雞胚；對收獲的病毒尿囊液進(jìn)行檢驗(yàn)，凡菌檢為陰性，毒價(jià)> IO7EID5tlA). lmL，作為制備疫苗的部分的抗原液。(2)病毒液的濃縮、純化用醋酸鋅沉淀法濃縮病毒液，Sepharose 4FF凝膠層析柱純化病毒液。(3)用抗原配制油乳劑滅活疫苗免疫25日齡的SPF雞，胸部肌肉分點(diǎn)注射，免疫3次，每次間隔2周，最后I次免疫3周后用活毒加強(qiáng)免疫I次，2周后心臟無菌采血分離血清，初步得到雞傳染性支氣管炎病毒IBV血清；(4)56°C水浴30min滅活補(bǔ)體，在4°C以5000r/min離心30min，淡黃色上清液作為制備疫苗的抗體；(5)用制備好的抗原和抗體按體積比3:8進(jìn)行混合，加入凍干保護(hù)劑進(jìn)行真空凍干，得到抗原抗體復(fù)合物。實(shí)施例2(I)病毒的繁殖Massachusetts41病毒株接種雞胚,繁殖溫度為37°C,每天照兩次蛋，收獲24_60h死亡的雞胚尿囊液；對于60h的活胚需置2°C過夜，然后收獲尿囊液，收獲尿囊液時(shí)，需棄去24h之前死亡的雞胚；對收獲的病毒尿囊液進(jìn)行檢驗(yàn)，凡菌檢為陰性，毒價(jià)> IO7EID5tlA). lmL，作為制備疫苗的部分的抗原液。(2)病毒液的濃縮、純化用醋酸鋅沉淀法濃縮病毒液，Sepharose 4FF凝膠層析柱純化病毒液。(3)用抗原配制油乳劑滅活疫苗免疫25日齡的SPF雞，胸部肌肉分點(diǎn)注射，免疫3次，每次間隔2周，最后I次免疫3周后用活毒加強(qiáng)免疫I次，2周后心臟無菌采血分離血清，初步得到雞傳染性支氣管炎病毒IBV血清；(4)54°C水浴40min滅活補(bǔ)體，在3°C下以4000r/min離心40min,淡黃色上清液作為制備疫苗的抗體；(5)用制備好的抗原和抗體按體積比3:5進(jìn)行混合，加入凍干保護(hù)劑進(jìn)行真空凍干，得到抗原抗體復(fù)合物。實(shí)施例3(I)病毒的繁殖Massachusetts41病毒株接種雞胚,繁殖溫度為36°C,每天照兩次蛋，收獲24-60h死亡的雞胚尿囊液；對于60h的活胚需置8°C過夜，然后收獲尿囊液，收獲尿囊液時(shí)，需棄去24h之前死亡的雞胚；對收獲的病毒尿囊液進(jìn)行檢驗(yàn)，凡菌檢為陰性，毒價(jià)> IO7EID5tlA). lmL，作為制備疫苗的部分的抗原液。(2)病毒液的濃縮、純化用醋酸鋅沉淀法濃縮病毒液，Sepharose 4FF凝膠層析柱純化病毒液。(3)用抗原配制油乳劑滅活疫苗免疫25日齡的SPF雞，胸部肌肉分點(diǎn)注射，免疫3次，每次間隔2周，最后I次免疫3周后用活毒加強(qiáng)免疫I次，2周后心臟無菌采血分離血清，初步得到雞傳染性支氣管炎病毒IBV血清； (4)58°C水浴20min滅活補(bǔ)體，在5°C下以6000r/min離心20min,淡黃色上清液作為制備疫苗的抗體；(5)用制備好的抗原和抗體按體積比3:4進(jìn)行混合，加入凍干保護(hù)劑進(jìn)行真空凍干，得到抗原抗體復(fù)合物。免疫效力試驗(yàn)I日齡SPF雛雞200只分成10組，每組20只，分別飼養(yǎng)于隔離器內(nèi)。第I組至第8組分別經(jīng)頸部皮下接種復(fù)合物疫苗I 8 (I 3組接種實(shí)施例I的復(fù)合物疫苗，4 6組接種實(shí)施例2的復(fù)合疫苗，7 8接種實(shí)施例3的復(fù)合物疫苗)；第9組免疫雞傳染性支氣管炎常規(guī)活疫苗;第10組是空白對照組。免疫后觀察記錄雞的疫苗反應(yīng)情況，3周后采血檢測雞傳染性支氣管炎HI抗體水平。結(jié)果疫苗免疫后雞群的臨床癥狀I(lǐng)組 8組雞接種復(fù)合物疫苗后均無任何反應(yīng)，采食飲水正常；第9組雞接種疫苗后，有3只雞出現(xiàn)雞傳染性支氣管炎癥狀，表現(xiàn)有精神萎頓，羽毛松亂，輕微喘氣甚至張口呼吸，3d 4d后癥狀消失;第10組雞一直保持健康，說明隔離器運(yùn)轉(zhuǎn)正常。免疫組的抗體水平比常規(guī)苗的抗體水平要高。攻毒試驗(yàn)免疫接種28d后，即28日齡時(shí)，用雞傳染性支氣管炎病種(M41)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，攻毒劑量為每只雞108_°EID5(I,肌肉注射0. 2mL。攻毒后觀察14d,記錄雞群的發(fā)病癥狀和死亡情況，并剖檢觀察病死雞的病理變化，計(jì)算發(fā)病率和死亡率。其結(jié)果顯示攻毒后各組雞發(fā)病和死亡情況試驗(yàn)I 9組在攻毒后第3天和第4天，雞出現(xiàn)輕微的雞傳染性支氣管炎發(fā)病癥狀，在觀察期內(nèi)，第9組發(fā)病I只；第10組為空白對照組，攻毒后7d內(nèi)全部發(fā)病死亡，剖檢死雞，病程急發(fā)病快的多無典型雞傳染性支氣管炎病變。100%和89%。
權(quán)利要求
1.一種雞傳染性支氣管炎抗原抗體復(fù)合物，其特征在于抗原與抗體按體積比3:4 8進(jìn)行混合后成為保護(hù)機(jī)體的復(fù)合物。
2.如權(quán)利要求I所述的一種雞傳染性支氣管炎抗原抗體復(fù)合物，其特征在于抗原毒價(jià)彡 IO7EID50A). ImL0
3.如權(quán)利要求I所述的一種雞傳染性支氣管炎抗原抗體復(fù)合物，其特征在于抗體血凝抑制價(jià)HA大于I :28。
4.一種如權(quán)利要求I所述的雞傳染性支氣管炎抗原抗體復(fù)合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)病毒的繁殖Massachusetts41病毒株接種雞胚,繁殖溫度為35_37°C,每天照兩次蛋，收獲24-60h死亡的雞胚尿囊液；對于60h的活胚需置2-8°C過夜，然后收獲尿囊液，收獲尿囊液時(shí)，需棄去24h之前死亡的雞胚；對收獲的病毒尿囊液進(jìn)行檢驗(yàn)，凡菌檢為陰性，毒價(jià)> IO7EID5tlA). lmL，作為制備疫苗的部分的抗原液。
(2)病毒液的濃縮、純化用醋酸鋅沉淀法濃縮病毒液，Sepharose4FF凝膠層析柱純化病毒液。
(3)用抗原配制油乳劑滅活疫苗免疫25日齡的SPF雞，胸部肌肉分點(diǎn)注射，免疫3次，每次間隔2周，最后I次免疫3周后用活毒加強(qiáng)免疫I次，2周后心臟無菌采血分離血清，初步得到雞傳染性支氣管炎病毒IBV血清； (4)54-58°C水浴 20-40min 滅活補(bǔ)體，在 3_5°C下以 4000_6000r/min 離心 20_40min，淡黃色上清液作為制備疫苗的抗體； (5)用制備好的抗原和抗體按體積比3:4 8進(jìn)行混合，加入凍干保護(hù)劑進(jìn)行真空凍干，得到抗原抗體復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雞傳染性支氣管炎復(fù)合物，具體是將純化好的抗原的和血凝抑制效價(jià)大于128的抗體按體積比3:4～8時(shí)進(jìn)行配比，制得雞傳染性支氣管炎抗原抗體復(fù)合物，該復(fù)合物穩(wěn)定性好，副作用少，免疫效果好。
文檔編號A61K39/395GK102973938SQ20121030285
公開日2013年3月20日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者吳紅云, 徐進(jìn), 韓改會 申請人:鄭州后羿制藥有限公司