一種胚源性雞傳染性支氣管炎病毒的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒的純化方法，具體涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒引起的雞的一種急性高度接觸性呼 吸道傳染病。其臨診特征是呼吸困難、咳嗽、張口呼吸等癥狀。傳染性支氣管炎病毒屬冠狀 病毒科冠狀病毒屬。病毒顆粒略呈球狀，直徑80~120nm，有時(shí)呈多形性，有囊膜及許多梨 狀纖突，呈放射狀排列，纖突長約20nm，核衣殼螺旋狀對(duì)稱。雞傳染性支氣管炎基因組為單 分子線狀正鏈單股RNA，大小為27000~32000nt，是已知RNA病毒中基因組最大的。
[0003] 雞傳染性支氣管炎通常使用疫苗預(yù)防，其疫苗通常對(duì)采用雞胚進(jìn)行繁殖的病毒進(jìn) 行免疫培養(yǎng)制作而成。在雞胚繁殖病毒所獲得雞傳染性支氣管炎病毒抗原通常含有大量的 雞胚蛋白等雜質(zhì)。傳統(tǒng)純化方法通常是通過超高速離心、等密度梯度離心、蔗糖梯度離心、 氯化銫梯度離心、PEG沉淀、硫酸銨沉淀等方法進(jìn)行純化。如專利CN102628032A公開的一 種高速離心的病毒分離方法，這些方法存在較多問題：1.處理量??；2.操作復(fù)雜；3.引入 了外源性雜質(zhì)，如蔗糖、PEG、硫酸銨等問題；4.需使病毒變性，例如硫酸銨沉淀等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種回收率高、不引入外源性 雜質(zhì)、不影響支氣管炎病毒活性的胚源性雞傳染性支氣管炎病毒的純化方法。
[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種胚源性雞傳染性支氣管炎病毒的純化方法，包括以下步驟：
[0007] 1)接種：對(duì)普通受精雞胚接種雞傳染性支氣管炎病毒；
[0008] 2)培養(yǎng)：37°C培養(yǎng)48-96h，雞胚在2-8°C下冷凍8-16h，收集雞胚中尿囊液；
[0009] 3)離心：尿囊液采用4000_6000rpm的速度離心10_50min ;
[0010] 4)超濾：步驟3)獲得的離心液采用濾膜孔徑為30-500KDa的超濾膜進(jìn)行過濾濃 縮至離心液原體積的20% -50% ;
[0011] 5)層析：采用分子篩填料裝柱至柱高為30-120cm，經(jīng)超濾的樣品以填料體積的 5-20%上樣，用PBS緩沖液進(jìn)行洗脫層析，收集第一個(gè)蛋白質(zhì)峰的洗脫液即為傳染性支氣 管炎病毒；
[0012] 6)超濾：步驟5)得到的傳染性支氣管炎病毒的洗脫液采用濾膜孔徑為30-500KDa 的超濾膜進(jìn)行過濾濃縮洗脫液至原體積的20% -50%。
[0013] 作為優(yōu)選，步驟1)中，所述雞胚的孵化日齡為9-11日齡。
[0014] 作為優(yōu)選，步驟2)中，剔除24h內(nèi)死亡的雞胚。
[0015] 作為優(yōu)選，步驟3)中，離心速度為4500-5500rpm。
[0016] 作為優(yōu)選，步驟3)中，離心時(shí)間為20-40min。
[0017] 作為優(yōu)選，步驟5)中，分子篩填料為Superdex? 200。
[0018] 作為優(yōu)選，步驟5)中，上樣量為10-20%。
[0019] 作為優(yōu)選，步驟5)中，洗脫流速為2-3mL/min。
[0020] 利用上述純化方法所獲得的雞傳染性支氣管炎病毒在制備雞傳染性支氣管炎病 毒疫苗中的應(yīng)用。
[0021] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0022] 本發(fā)明提供的胚源性雞傳染性支氣管炎病毒的純化方法，采用普通雞胚培養(yǎng)雞傳 染性支氣管炎病毒，通過依次離心、超濾濃縮、分子篩層析、超濾相結(jié)合的方法，去除雞胚繁 殖的雞傳染性支氣管炎病毒抗原中85%以上雜蛋白，病毒回收率不低于70%，同時(shí)不引入 外源性的雜質(zhì)，且不影響雞傳染性支氣管炎的活性。
[0023] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0024] 圖1為樣品進(jìn)行分子篩層析圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 本發(fā)明提供一種胚源性雞傳染性支氣管炎病毒的純化方法，包括以下步驟：
[0026] 1)接種：對(duì)普通受精雞胚接種雞傳染性支氣管炎病毒；
[0027] 2)培養(yǎng)：37°C培養(yǎng)48-96h，雞胚在2-8°C下冷凍8-16h，收集雞胚中尿囊液；
[0028] 3)離心：尿囊液采用4000-6000rpm的速度離心10_50min ;
[0029] 4)超濾：步驟3)獲得的離心液采用濾膜孔徑為30_500KDa的超濾膜進(jìn)行過濾濃 縮至離心液原體積的30% ;
[0030] 5)層析：采用分子篩填料裝柱至柱高為30-120cm，經(jīng)超濾的樣品以填料體積的 5-20%上樣，用PBS緩沖液進(jìn)行洗脫層析，收集第一個(gè)蛋白質(zhì)峰的洗脫液即為傳染性支氣 管炎病毒；
[0031] 6)超濾：步驟5)得到的傳染性支氣管炎病毒的洗脫液采用濾膜孔徑為30-500KDa 的超濾膜進(jìn)行過濾濃縮至洗脫液原體積的30%。
[0032] 本發(fā)明采用普通雞胚培養(yǎng)雞傳染性支氣管炎病毒，通過依次離心、超濾濃縮、分子 篩層析、超濾相結(jié)合的方法，去除雞胚繁殖的雞傳染性支氣管炎病毒抗原中85%以上雜蛋 白，病毒回收率不低于70%，且雞傳染性支氣管炎的活性不受影響。
[0033] 本發(fā)明對(duì)培養(yǎng)后的雞胚進(jìn)行通過冷凍過夜處理，提高了尿囊液收率。本發(fā)明采用 了較低的離心速度，有效地減少了病毒的損傷。本發(fā)明在層析后再對(duì)樣品進(jìn)行一次超濾操 作，能有效去除分子量小于濾膜孔徑的雜蛋白，尤其彌補(bǔ)上樣量多時(shí)，病毒與其它雜蛋白難 以分離開的缺陷。
[0034] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0035] 實(shí)施例1 :
[0036] 一種胚源性雞傳染性支氣管炎病毒的純化方法，包括以下步驟：
[0037] 1)接種：對(duì)孵化至10日齡的普通受精雞胚，按0. lmL/枚的量接種雞傳染性支氣 管炎病毒；
[0038] 2)培養(yǎng)：37°C培養(yǎng)72h，剔除24h內(nèi)死亡的雞胚，雞胚在2-8°C下冷凍8h，收集雞胚 中尿囊液；
[0039] 3)離心：尿囊液采用4500rpm的速度離心30min;
[0040] 4)超濾：步驟3)獲得的離心液采用濾膜孔徑為lOOKDa的超濾膜進(jìn)行過濾濃縮至 離心液原體積的30% ;
[0041] 5)層析：采用Superde