一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒，包括有雞傳染性支氣管炎N重組蛋白包被微孔反應(yīng)板/條、終止液、陽性對照和陰性對照、酶結(jié)合物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、顯色液A和顯色液B。應(yīng)用于大批量檢測和逐個/組手動檢測中，具有靈敏度、準(zhǔn)確度高，再現(xiàn)性好的特點。
【專利說明】一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及雞傳染性支氣管炎病毒檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]禽傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的禽傳染性支氣管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，IBV主要侵害雞的呼吸道、消化道、生殖系統(tǒng)及腎，IBV對不同日齡的雞產(chǎn)生不同程度的危害。其特征為病雞出現(xiàn)呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋數(shù)量和品質(zhì)下降以及腎臟病變等。IBV還往往引起混合感染(如新城疫、慢性呼吸道病等)，并可繼發(fā)細(xì)菌性疾病如大腸桿菌病、沙門氏菌病等，從而加重對雞群的危害。
[0003]IBV核衣殼蛋白又稱核蛋白(N蛋白)，具有很好的抗原性和免疫原性，在細(xì)胞免疫和體液免疫中起著重要作用。體外表達(dá)的N蛋白能引起免疫應(yīng)答，能使免疫雞增速產(chǎn)生抗IBV抗體，可誘導(dǎo)雞對IBV氣管感染的免疫保護(hù)作用。用N蛋白免疫雞后，可激活T輔助細(xì)胞，同時可增強B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力。加上N蛋白的具有高保守性，這使得N蛋白及其抗體在IBV診斷方面顯示出優(yōu)勢。核蛋白占病毒總蛋白量大，而且核蛋白為非糖基化蛋白，由于它能檢測群抗體應(yīng)答，可以作為IBV群特異性診斷抗原。
[0004]目前，雞傳染性支氣管炎病毒的檢測方法大多耗時長、操作繁瑣、敏感性、穩(wěn)定性差。PCR法具有特異性強、靈敏度高和速度快等優(yōu)點，但因RT-PCR容易交叉污染、操作繁瑣、需要的熱循環(huán)設(shè)備價格昂貴等缺點而很難得到推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就是針對上述存在的缺陷而提供一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒。應(yīng)用于大批量檢測和逐個/組手動檢測中，具有靈敏度、準(zhǔn)確度高，再現(xiàn)性好的特點。
[0006]本發(fā)明的一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒技術(shù)方案為，該試劑盒包括有雞傳染性支氣管炎N重組蛋白包被微孔反應(yīng)板/條、終止液、陽性對照和陰性對照、酶結(jié)合物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、顯色液A和顯色液B。
[0007]雞傳染性支氣管炎N重組蛋白包被微孔反應(yīng)板/條制備方法為:用pH8的0.1mol/L Tris-HCl緩沖液作包被液，將雞傳染性支氣管炎N重組蛋白稀釋為5 u g/mL,按50 y L/孔加入ELISA反應(yīng)板中，37°C封閉2h，4°C包被過夜，拍干，用I %牛血清白蛋白37°C封閉l-3h，以含吐溫-20的20%NaCl溶液洗滌，拍干，再加入20%蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保持2h。
[0008]所述樣品稀釋液為含吐溫-20的10%NaCl溶液；所述濃縮洗滌液為含吐溫_20的20%NaCl 溶液。
[0009]所述酶結(jié)合物為HRP-兔抗雞IgG。[0010]所述顯色液A為0.2mg/L的四甲基聯(lián)苯胺溶液，顯色液B為含過氧化氫尿素的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液。
[0011]終止液為3mol/L硫酸溶液.陽性對照為經(jīng)雞傳染性支氣管炎重組蛋白免疫獲得的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，其0D450nm≥1.0，然后加入5mg/mL的鏈霉素，經(jīng)無菌過濾后獲得；陰性對照為SPF雞標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，其0D450nm ( 0.25，加入5mg/mL的鏈霉素，經(jīng)無菌過濾后獲得。
[0012]將待檢血清用樣品稀釋液作1:500稀釋，按25-100 μ L/孔加入抗體檢測板中，同時設(shè)陰性對照、陽性對照，3 7 °C孵育3 O -6 Om i η ;棄去反應(yīng)孔中的液體，每孔加經(jīng)過純水1:20稀釋后的濃縮洗滌液200 μ L，洗滌5次，拍干；每孔加，50-150 μ L的酶結(jié)合物工作液，37°C孵育30-60min ;洗滌5次，拍干；依次加入50 μ L顯色液A和50 μ L顯色液B，37°C避光孵育15min dPSOyL終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定各孔吸光度A值；以待檢樣本0D450nm值與標(biāo)準(zhǔn)陰性0D450nm值的比值大于2，且待檢樣本0D450nm值大于0.5判為陽性。
[0013]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的試劑盒使用方便，檢測范圍寬廣，靈敏度高。應(yīng)用于大批量檢測和逐個/組手動檢測中，具有靈敏度、準(zhǔn)確度高，再現(xiàn)性好的特點。
[0014]【具體實施方式】:
為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實例來詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0015]實施例1
本發(fā)明的一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒包括:雞傳染性支氣管炎N重組蛋白包被微孔反應(yīng)板/條、終止液、陽性對照和陰性對照、酶結(jié)合物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、顯色液A和顯色液B。
[0016]雞傳染性支氣管炎N重組蛋白包被微孔反應(yīng)板/條制備方法為:用pH8的0.1mol/L Tris-HCl緩沖液作包被液，將雞傳染性支氣管炎N重組蛋白稀釋為5 μ g/mL,按50 μ L/孔加入ELISA反應(yīng)板中，37°C封閉2h，4°C包被過夜，拍干，用I %牛血清白蛋白37°C封閉3h，以含吐溫-20的20%NaCl溶液洗滌，拍干，再加入20%蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保持2h。
[0017]所述樣品稀釋液為含吐溫-20的10%NaCl溶液；所述濃縮洗滌液為含吐溫_20的20%NaCl 溶液。
[0018]所述酶結(jié)合物為HRP-兔抗雞IgG。
[0019]所述顯色液A為0.2mg/L的四甲基聯(lián)苯胺溶液，顯色液B為含過氧化氫尿素的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液。
[0020]終止液為3mol/L硫酸溶液.陽性對照為經(jīng)雞傳染性支氣管炎重組蛋白免疫獲得的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，其0D450nm≥1.0，然后加入5mg/mL的鏈霉素，經(jīng)無菌過濾后獲得；陰性對照為SPF雞標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，其0D450nm ( 0.25，加入5mg/mL的鏈霉素，經(jīng)無菌過濾后獲得。
[0021]將待檢血清用樣品稀釋液作1:500稀釋，按50 μ L/孔加入抗體檢測板中，同時設(shè)陰性對照、陽性對照，37°C孵育30-60min ;棄去反應(yīng)孔中的液體，每孔加經(jīng)過純水1:20稀釋后的濃縮洗滌液200 μ L，洗滌5次，拍干；每孔加，100 μ L的酶結(jié)合物工作液，37°C孵育30-60min ;洗滌5次，拍干；依次加入50 μ L顯色液A和50 μ L顯色液B，37°C避光孵育15min ΑΡδΟμ?終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定各孔吸光度A值；以待檢樣本0D450nm值與標(biāo)準(zhǔn)陰性0D450nm值的比值大于2，且待檢樣本0D450nm值大于0.5判為陽性。
[0022]應(yīng)用本發(fā)明試劑盒對50份疑似雞傳染性支氣管炎病毒感染病雞的血清樣品進(jìn)行了雞傳染性支氣管炎抗體水平檢測，陽性率達(dá)100%。
[0023]實施例2
本發(fā)明的一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒包括:雞傳染性支氣管炎N重組蛋白包被微孔反應(yīng)板/條、終止液、陽性對照和陰性對照、酶結(jié)合物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、顯色液A和顯色液B。
[0024]雞傳染性支氣管炎N重組蛋白包被微孔反應(yīng)板/條制備方法為:用pH8的0.1mol/L Tris-HCl緩沖液作包被液，將雞傳染性支氣管炎N重組蛋白稀釋為5 μ g/mL,按50 μ L/孔加入ELISA反應(yīng)板中，37°C封閉2h，4°C包被過夜，拍干，用I %牛血清白蛋白37°C封閉2h，以含吐溫-20的20%NaCl溶液洗滌，拍干，再加入20%蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保持2h。
[0025]所述樣品稀釋液為含吐溫-20的10%NaCl溶液；所述濃縮洗滌液為含吐溫_20的20%NaCl 溶液。
[0026]所述酶結(jié)合物為HRP-兔抗雞IgG。[0027]所述顯色液A為0.2mg/L的四甲基聯(lián)苯胺溶液，顯色液B為含過氧化氫尿素的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液。
[0028]終止液為3mol/L硫酸溶液.陽性對照為經(jīng)雞傳染性支氣管炎重組蛋白免疫獲得的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，其0D450nm≥1.0，然后加入5mg/mL的鏈霉素，經(jīng)無菌過濾后獲得；陰性對照為SPF雞標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，其0D450nm ( 0.25，加入5mg/mL的鏈霉素，經(jīng)無菌過濾后獲得。
[0029]將待檢血清用樣品稀釋液作1:500稀釋，按100μ L/孔加入抗體檢測板中，同時設(shè)陰性對照、陽性對照，37°C孵育30-60min ;棄去反應(yīng)孔中的液體，每孔加經(jīng)過純水1:20稀釋后的濃縮洗滌液200 μ L，洗滌5次，拍干；每孔加，IOOyL的酶結(jié)合物工作液，37°C孵育30-60min ;洗滌5次，拍干；依次加入50 μ L顯色液A和50 μ L顯色液B，37°C避光孵育15min ΑΡδΟμ?終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定各孔吸光度A值；以待檢樣本0D450nm值與標(biāo)準(zhǔn)陰性0D450nm值的比值大于2，且待檢樣本0D450nm值大于0.5判為陽性。
[0030]應(yīng)用本發(fā)明試劑盒對50份疑似雞傳染性支氣管炎病毒感染病雞的血清樣品進(jìn)行了雞傳染性支氣管炎抗體水平檢測，陽性率達(dá)99.6%。
【權(quán)利要求】
1.一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括有雞傳染性支氣管炎N重組蛋白包被微孔反應(yīng)板/條、終止液、陽性對照和陰性對照、酶結(jié)合物、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、顯色液A和顯色液B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒，其特征在于，雞傳染性支氣管炎N重組蛋白包被微孔反應(yīng)板/條制備方法為:用pH8的0.lmol/LTris-HCl緩沖液作包被液，將雞傳染性支氣管炎N重組蛋白稀釋為5 u g/mL,按50 y L/孔加入ELISA反應(yīng)板中，37°C封閉2h，4°C包被過夜，拍干，用1%牛血清白蛋白37°C封閉l-3h，以含吐溫 -20的20%NaCl溶液洗滌，拍干，再加入20 %蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保持2h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液為含吐溫-20的10%NaCl溶液；所述濃縮洗滌液為含吐溫-20的20%NaCl 溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述酶結(jié)合物為HRP-兔抗雞IgG。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述顯色液A為0.2mg/L的四甲基聯(lián)苯胺溶液，顯色液B為含過氧化氫尿素的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒，其特征在于，終止液為3mol/L硫酸溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒，其特征在于，陽性對照為經(jīng)雞傳染性支氣管炎重組蛋白免疫獲得的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，其0D450nm≥1.0，然后加入5mg/mL的鏈霉素，經(jīng)無菌過濾后獲得；陰性對照為SPF雞標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，其0D450nm≤0.25，加入5mg/mL的鏈霉素，經(jīng)無菌過濾后獲得。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的一種雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測試劑盒，其特征在于，將待檢血清用樣品稀釋液作1:500稀釋，按25-100 y L/孔加入抗體檢測板中，同時設(shè)陰性對照、陽性對照，37°C孵育30-60min ;棄去反應(yīng)孔中的液體，每孔加經(jīng)過純水1:20稀釋后的濃縮洗滌液200 iiL，洗滌5次，拍干；每孔加，50-150 ii L的酶結(jié)合物工作液，37°C孵育30-60min ;洗滌5次，拍干；依次加入50 y L顯色液A和50 y L顯色液B，37°C避光孵育15min ;W50iiL終止液，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定各孔吸光度A值；以待檢樣本0D450nm值與標(biāo)準(zhǔn)陰性0D450nm值的比值大于2，且待檢樣本0D450nm值大于0.5判為陽性。
【文檔編號】G01N33/569GK103698517SQ201310744847
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】陳申秒, 馬景霞, 賈紅梅, 董新榮, 吳雪莉 申請人:山東濱州博萊威生物技術(shù)有限公司