專利名稱：人間充質干細胞在制備治療m3型白血病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用。
背景技術：
急性白血病是由于病理的白細胞失去進一步分化成熟的能力而停滯在幼稚期的不同階段。急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL) M3的白細胞分化阻滯于異常的早幼粒細胞階段，是目前臨床上唯一進行誘導分化治療的白血病。使用全反式維甲酸(ATRA)單獨或者與化學藥物聯(lián)合治療可以獲得高達909^95%的完全緩解率，但是存在可能有致死風險的毒副反應如維甲酸綜合癥，它可能引起患者出現(xiàn)高白細胞，不明原因發(fā)熱，呼吸窘迫，間質性肺炎，胸腔或心包積液，間歇性低血壓和急性腎功能衰竭。而 且，持續(xù)性的ATRA單藥治療M3型白血病將導致進行性獲得性耐藥，通常在3 6月內(nèi)幾乎所有的病人均出現(xiàn)復發(fā)。獲得性耐藥的一個可能的原因便是由于反復給藥導致藥物清除加快從而使ATRA的血漿濃度低于有效治療濃度。要解決上述問題，可能的策略是尋找其他具有誘導白血病細胞分化能力的藥物或藥用組合物，單用或與ATRA聯(lián)合誘導，在不降低療效的基礎上減弱ATRA單獨應用所帶來的問題。有不少研究報道了間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)在體內(nèi)外均可促進正常造血干細胞向髓系和淋系分化。起初，有研究發(fā)現(xiàn)小鼠間充質細胞系MS-5和S17均可促進人臍血來源的造血干祖細胞向B淋巴細胞和粒細胞分化。隨后，人骨髓MSC被證實可以在體內(nèi)外促進造血干祖細胞巨核細胞形成。最近研究顯示人MSC可以促進骨髓和臍帶血來源的造血干祖細胞向髓系和淋系細胞分化。不過尚未有研究顯示MSC能夠促進白血病細胞分化。非人類來源的MSC由于生物學和倫理學上存在的種種問題，不宜用于人類疾病的治療。人骨髓來源的MSC可以分離和較大規(guī)模制備獲取，在產(chǎn)業(yè)上具備使用的可能。臍帶來源的間充質干細胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, UC-MSC)是正常妊娠分娩過程的副產(chǎn)品，可用酶消化法等多種成熟手段非常容易地從新生兒臍帶組織中獲取，生物學特性與其他來源的間充質干細胞基本一致，由于其來源的廣泛性、取材的無創(chuàng)性和簡易性、感染的低發(fā)生率和良好的體外擴增能力，在產(chǎn)業(yè)上具有廣闊的應用前景。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術所存在的誘導分化藥物在治療M3型白血病中所存在的復發(fā)率高、毒副反應嚴重、聯(lián)合用藥成本高等缺陷，本發(fā)明通過研究證明MSC可以促進急性早幼粒細胞白血病細胞向粒系成熟分化，和ATRA同時應用時其促分化作用有聯(lián)合增強，并在此基礎上提供了一種將人間充質干細胞應用于制備治療M3型白血病的藥物的技術方案。本發(fā)明所述的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，其中人間充質干細胞可以單獨應用，也可以與全反式維甲酸(ATRA)聯(lián)合應用。
本發(fā)明所述的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，其中人間充質干細胞可以用組織塊酶消化法從新生兒臍帶胎盤當中獲得。本發(fā)明所述的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，解決了單獨使用全反式維甲酸(ATRA)所可能造成的獲得性耐藥問題、提高了 M3白血病誘導分化的效率，減少了可能存在的不良反應。本發(fā)明所述的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，其中所述人間充質干細胞的來源不僅僅限于廢棄的新生兒臍帶胎盤組織，目前隨著相關技術領域技術的發(fā)展，成年人的骨髓、脂肪、子宮內(nèi)膜等組織中均可獲得充足的人間充質干細胞，并且已有大量獲取此類來源的間充質干細胞并儲存用于建立成體間充質干細胞庫的實例。以此為基礎，可知上述來源的人間充質干細胞均可應用于本發(fā)明的技術方案中。本發(fā)明所述的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，其中人間充質干細胞的實際應用方式，應當是以靜脈注射的手段，單獨或與其他促分化藥物聯(lián)合應 用。雖然本發(fā)明中的實施方式不包括對M3白血病患者使用人間充質干細胞進行治療的實際用量，但通過現(xiàn)有技術所公開的大量間充質干細胞臨床治療損傷及免疫性疾病的實例來看，本發(fā)明中所使用的間充質干細胞用量可以參考已公開的其他疾病治療中的用量，為(0. 5 5) X106/kg。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所公開的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，為該類白血病的治療藥物開發(fā)提供了低成本、低不良反應且效果更佳的技術手段。


圖I是形態(tài)學和NBT還原試驗顯示UC-MSC誘導NB4細胞向粒系分化并和ATRA同時使用有誘導作用聯(lián)合增強。圖2是細胞表面分化抗原的調控顯示UC-MSC誘導NB4細胞向粒系分化而非向單核細胞分化，并和小劑量ATRA同時使用有誘導作用聯(lián)合增強。圖3是UC-MSC促進NB4細胞分化的同時伴隨著細胞G0/G1期周期阻滯。圖4是UC-MSC誘導APL患者來源的白血病細胞向粒系分化。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細說明I.利用酶消化法消化足月妊娠剖宮產(chǎn)健康新生兒的臍帶，通過貼壁法取得原代培養(yǎng)的臍帶間充質干細胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清，10_8M地塞米松，10ng/ml EGF (peprotech公司，美國)，2ng/ml bFGF (peprotech公司,美國),100 V- g/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，置37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中，細胞長至80-90%融合后消化傳代，取P4 P6代的細胞實驗用。人APL細胞系NB4細胞由本實驗室液氮凍存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、IOOii g/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，置37°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，每2 3天傳代I次。在6孔板內(nèi)建立NB4細胞與UC-MSC共培養(yǎng)體系，設立4個實驗組，即NB4對照組，UC-MSC處理組，ATRA處理組和UC-MSC/ATRA聯(lián)合處理組。UC-MSC提前接種于6孔板內(nèi)，5 X IO5/孔，置于37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，達到80 90%融合后，銫源30Gy照射終止細胞增殖。NB4細胞起始濃度105/ml接種，4ml/孔。培養(yǎng)一定時間后，收集白血病細胞時輕輕反復吹打，避免破壞下層的UC-MSC細胞層。通過細胞形態(tài),硝基四唑氮藍還原試驗(nitroblue tetrozoliumreduction test，NBT試驗)，細胞表面髓系分化標志⑶IIb和⑶14的檢測評價白血病細胞的分化狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)UC-MSC可以促進NB4細胞向粒系終末分化成熟同時可以導致NB4細胞周期G0/G1期阻滯，而且和小劑量的ATRA (10 nM)聯(lián)合使用時，促分化作用有累加效應。具體為(I) NB4細胞在UC-MSC或/和10 nM ATRA處理培養(yǎng)72小時后收集細胞，經(jīng)甩片機(Cytospin4，山東)將細胞甩至載玻片上，瑞氏吉姆薩染色30分鐘后顯微鏡下觀察各組NB4細胞形態(tài)。如圖I中的A所示，NB4對照組細胞呈典型原始細胞形態(tài)，胞體較大，胞漿深藍染，細胞核核大且圓，核漿比較大，染色質疏松，可見較大的核仁；UC-MSC共培養(yǎng)以后 的細胞形態(tài)上有分化的跡象，細胞體積較前變小，細胞核變小，核漿比變大，核染色質較前濃聚，胞核開始出現(xiàn)凹陷，出現(xiàn)形態(tài)上類似于中幼粒和晚幼粒的細胞；ATRA處理組細胞較UC-MSC處理組形態(tài)上出現(xiàn)更多的晚幼粒；UC-MSC/ATRA聯(lián)合處理組細胞形態(tài)上較ATRA處理組分化更為明顯，出現(xiàn)更多愈加成熟的桿狀核，偶可見分葉核粒細胞。(2)中性粒細胞成熟過程中伴隨細胞內(nèi)的活性氧(reactive oxygenspecies, R0S)生成增多。在ROS形成過程中脫下的氫可以被硝基四唑氮藍接受而使其還原為藍紫色物質沉淀于胞漿內(nèi)。本實驗中，在共培養(yǎng)24小時，48小時和72小時后，分別收集各組NB4細胞，進行NBT試驗衡量胞內(nèi)活性氧形成，即細胞經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后重懸于0. 1%的NBT (Sigma公司，美國)，加入400ng/ml佛波酯(Sigma公司，美國)，37°C水浴I小時。經(jīng)甩片機將細胞甩至載玻片上，番紅0 (Sigma公司，美國)染色后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并計數(shù)400個細胞得到NBT反應陽性細胞的比率，從而判斷粒細胞的分化狀態(tài)，如圖I中的B所示，UC-MSC和ATRA分別作用后的NB4細胞NBT試驗陽性的細胞比例明顯上調，呈時間依賴性，且UC-MSC/ATRA聯(lián)合作用后進一步上調，作用有累加效應。(3)關于細胞表面分化抗原表達的檢測，CDllb為髓系分化標志，當細胞向粒細胞分化和向單核細胞分化時，均出現(xiàn)陽性率增強，在原始粒細胞和早幼粒細胞表面幾乎不表達，從中幼粒細胞開始，陽性率逐漸增強；CD14為單核細胞分化標志。既往有研究顯示，在不同的誘導分化劑作用下，NB4細胞可以向粒系和單核系兩個方向分化，因此我們用流式細胞術同時檢測CDllb和CD14的表達來判斷細胞分化的方向。于培養(yǎng)的24小時，48小時，72小時收集細胞，PBS洗漆后分別加入藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)標記的小鼠抗人⑶Ilb單克隆抗體(BD公司，美國)或⑶14單克隆抗體(BD公司，美國)以及相應的PE-小鼠I gGI同型對照抗體(BD公司，美國)5 u 1,4° C避光孵育40min后，流式細胞術檢測⑶Ilb和⑶14的陽性率。如圖2-左側所示，UC-MSC和ATRA分別上調細胞表面⑶Ilb的表達，且同時應用時作用聯(lián)合增強，該上調作用呈現(xiàn)時間依賴性。對照組NB4細胞陽性率基礎值為
4.35±2. 29%，UC-MSC、ATRA 和 UC-MSC/ATRA 聯(lián)合作用 24 小時陽性率分別為 18. 37±2. 53%,26. 6 ±5. 37% 和 46. 6 ±6. 09% ；48 小時分別為 30. 7±1. 97%, 38. 0±8. 67% 和 65. 5 ±9. 02% ；72小時分別為39. 83±2. 53%,63. 33±14. 59%和88. 7±7. 27%。而對于CD14的檢測如圖2-右側所示，其呈持續(xù)低水平表達，且各組之間沒有統(tǒng)計學差異。據(jù)此我們認為，UC-MSC誘導NB4細胞向粒系分化成熟，而非向單核細胞分化。
(4)于培養(yǎng)的48小時收集各組細胞碘化丙唳(propidium iodide, PI) (sigma公司，美國)摻入法流式細胞術檢測細胞周期分布。具體為各組NB4細胞用70%冷乙醇固定24小時，PBS洗滌后，加入5ul終濃度50ug/ml RNAase (Sigma公司，美國)，37°C孵育30分鐘后，PBS洗去RNAase。再加入50ug/ml PI 500ul，室溫避光孵育5分鐘后，流式細胞儀檢測。如圖3所示，UC-MSC和ATRA分別對NB4細胞產(chǎn)生G0/G1期周期阻滯，兩者聯(lián)用，效果更為明顯。G0/G1期阻滯的同時，伴有S期細胞比例的相應下調，而G2/M期比例沒有明顯變化趨勢。2.經(jīng)知情同意后，采集APL患者骨髓液5ml。患者符合FAB診斷標準，且形態(tài)學證實白血病細胞比例在95%以上。采用淋巴細胞分離液分離骨髓單個核細胞。在6孔板內(nèi)建立白血病細胞與UC-MSC共培養(yǎng)體系，設立4個實驗組，即白血病細胞對照組，UC-MSC處理組，ATRA處理組和UC-MSC/ATRA聯(lián)合處理組。UC-MSC提前接種于6孔板內(nèi)，5 X IO5/孔，置于37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，達到80% 90%融合后，銫源30Gy照射終止細胞增殖。白血病細胞起始濃度105/ml，4ml/孔接種于6孔板，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 u g/ml鏈霉素和100U/ml青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時后，收集白血病細胞時輕 輕反復吹打，避免破壞下層的UC-MSC細胞層。通過檢測白細胞表面分化抗原CDllb，我們證明UC-MSC同樣可以促進急性早幼粒細胞白血病患者的白血病細胞向粒系終末分化，且和小劑量的ATRA (IOnM)聯(lián)合使用時，促分化作用有累加效應。如圖4所示，白血病細胞CDllb基礎表達率為13. 1%，UC-MSC和ATRA分別可以引起CDllb陽性率上調至61. 4%和88. 8%, UC-MSC/ATRA聯(lián)合使用，陽性率進一步上調至95. 1%。⑶14表達的檢測顯示⑶14陽性率始終低于3%。據(jù)此，我們可以斷定UC-MSC可以誘導急性早幼粒細胞白血病細胞向粒系分化。綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實施例中，相同領域內(nèi)的有識之士可以在本發(fā)明的技術指導思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權利要求
1.一種人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用。
2.根據(jù)權利要求I所述的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，其特征在于，人間充質干細胞與誘導白血病細胞分化的藥物聯(lián)合應用。
3.根據(jù)權利要求2所述的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，其特征在于，所述誘導白血病細胞分化的藥物是全反式維甲酸。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，其特征在于，所述人間充質干細胞是用組織酶消化法從廢棄的新生兒臍帶胎盤組織當中獲得。
5.根據(jù)權利要求1、2或3所述的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，其特征在于，所述人間充質干細胞從人骨髓細胞中分離獲得。
6.根據(jù)權利要求1、2或3所述的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，其特征在于，所述人間充質干細胞從人脂肪或子宮內(nèi)膜組織中分離獲得。
7.根據(jù)權利要求1、2或3所述的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，其特征在于，所述人間充質干細胞藥物采用靜脈注射方式。
8.根據(jù)權利要求7所述的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，其特征在于，所述靜脈注射的用量為(O. 5^5) XlO6Ag0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用。其中能夠促使M3型白血病細胞向成熟粒細胞分化的人間充質干細胞可以單獨應用，也可以與全反式維甲酸ATRA聯(lián)合應用。本發(fā)明所公開的人間充質干細胞在制備治療M3型白血病藥物中的應用，為該類白血病的治療藥物開發(fā)提供了低成本、低不良反應且效果更佳的技術手段。
文檔編號A61K35/28GK102793722SQ201210310410
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月28日 優(yōu)先權日2012年8月28日
發(fā)明者韓忠朝, 陳芳 申請人:天津昂賽細胞基因工程有限公司