專利名稱：穩(wěn)定化免疫調(diào)控性rna(simra)化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及免疫學(xué)和使用寡核糖核苷酸作為免疫調(diào)控劑的免疫療法應(yīng)用的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及免疫調(diào)控性RNA組合物和使用它們經(jīng)由Toll樣受體8 (TLR8)、Toll樣受體7 (TLR7)及TLR7和TLR8 二者調(diào)控免疫應(yīng)答的方法。
背景技術(shù)：
基于應(yīng)答中牽涉的細(xì)胞子集，免疫應(yīng)答牽涉先天性和適應(yīng)性應(yīng)答兩者。例如，經(jīng)典的細(xì)胞介導(dǎo)的功能(諸如遲發(fā)型超敏感性和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活化)中牽涉的T輔助(Th)細(xì)胞是Thl細(xì)胞，而作為B細(xì)胞活化的輔助細(xì)胞牽涉的Th細(xì)胞是Th2細(xì)胞。免疫應(yīng)答的類型受到響應(yīng)抗原暴露而生成的細(xì)胞因子和趨化因子的影響。細(xì)胞因子通過影響T輔助細(xì)胞I (Thl)和T輔助細(xì)胞2 (Th2)的平衡(其直接影響發(fā)生的免疫應(yīng)答的類型)而為控制免疫應(yīng)答提供一種手段。若平衡朝向更高數(shù)目的Thl細(xì)胞，則發(fā)生細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)活化。在平衡朝向更高數(shù)目的Th2細(xì)胞時(shí)，則發(fā)生體液的或抗體的免疫應(yīng)答。這每一種免疫應(yīng)答導(dǎo)致不同的一組細(xì)胞因子自Thl和Th2細(xì)胞分泌。由Thl和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的差異可能是這兩種T細(xì)胞子集的不同生物學(xué)功能的結(jié)果。Thl細(xì)胞牽涉身體對(duì)抗原(例如病毒感染、細(xì)胞內(nèi)病原體、和腫瘤細(xì)胞)的先天性應(yīng)答。對(duì)抗原的初始應(yīng)答可以是自抗原呈遞細(xì)胞(例如活化的巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞)分泌IL-12和伴隨的Thl細(xì)胞活化?；罨疶hl細(xì)胞的結(jié)果是某些細(xì)胞因子(例如IL-2、IFN-Y和其它細(xì)胞因子)的分泌和伴隨的抗原特異性CTL的活化。已知Th2細(xì)胞響應(yīng)細(xì)菌、寄生物、抗原和變應(yīng)原而活化，并且可經(jīng)由分泌某些細(xì)胞因子(例如IL-3、IL-4、IL-5、IL_6、IL-9、IL-10、IL-13和其它細(xì)胞因子)和趨化因子而介導(dǎo)身體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答(例如免疫球蛋白生成和嗜曙紅細(xì)胞活化)。這些細(xì)胞因子中某些的分泌可導(dǎo)致B細(xì)胞增殖和抗體生成升高。另外，這些細(xì)胞因子中的某些可刺激或抑制其它細(xì)胞因子的釋放(例如IL-10抑制自Thl細(xì)胞分泌IFN- Y和自樹突細(xì)胞分泌IL-12)。最后，Thl和Th2細(xì)胞之間的平衡及響應(yīng)選定的刺激物而釋放的細(xì)胞因子和趨化因子能在身體的免疫系統(tǒng)如何響應(yīng)疾病中具有重要的作用。例如，IFN-α可抑制丙型肝炎，而MIP-Ia和ΜΙΡ_1 β (分別也稱為CCL3和CCL4)可抑制HIV-I感染。Thl/Th2免疫應(yīng)答的最佳平衡呈現(xiàn)使用免疫系統(tǒng)治療和預(yù)防多種疾病的機(jī)會(huì)。
在哺乳動(dòng)物中，可以通過例如引入細(xì)菌或含有非甲基化CpG 二核苷酸的合成DNA來誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答源自于特定寡核苷酸序列(例如非甲基化的CpG)被呈遞給某些免疫細(xì)胞上稱為樣式識(shí)別受體(PRR)的受體。這些PRR中的某些是Toll樣受體(TLR)。在響應(yīng)微生物感染而誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答中緊密牽涉TLR。在脊椎動(dòng)物中，TLR由已知識(shí)別病原體相關(guān)分子樣式的十種蛋白質(zhì)(TLR1至TLR10)的一個(gè)家族組成。在這十種蛋白質(zhì)中，已知TLR3、7、8、和9位于細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體中，而且識(shí)別核酸(DNA和RNA )和小分子諸如核苷和核酸代謝物。已知TLR3和TLR9分別識(shí)別存在于病毒的和細(xì)菌的和合成的DNA中的核酸諸如dsRNA和非甲基化CpG 二核苷酸。已經(jīng)顯示了，細(xì)菌DNA活化免疫系統(tǒng)，并產(chǎn)生抗腫瘤活性(Tokunaga T等，J. Natl. Cancer Inst.(1984)72:955-962;Shimada S 等，Jpn. H cancer Res,1986,77,808-816;Yamamoto
S等，Jpn. J. Cancer Re s.，1986，79，866-7 3 ; Me s s i na, J 等，J.Immunolo·(1991) 147:1759-1764)。使用含有CpG 二核苷酸的反義寡核苷酸的其它研究已經(jīng)顯示了免疫應(yīng)答的刺激(Zhao Q 等，Biochem. Pharmacol. 1996，26，173-82)。隨后的研究顯示了 TLR9識(shí)別存在于細(xì)菌的和合成的DNA中的非甲基化CpG基序(Hemmi H等，Nature. (2000) 408:740-5)。對(duì)含有CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸的其它修飾也能影響它們經(jīng)由TLR9起作用和調(diào)控免疫應(yīng)答的能力(參見例如Zhao等，Biochem.Pharmacol. (1996)51:173-182;Zhao 等,Biochem Pharmacol. (1996)52:1537-1544;Zhao等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997)7:495-502;Zhao 等，Bioorg. Med. Chem.Lett. (1999)9:3453-3458;Zhao 等,Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051-1054;Yu等，Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10 : 2585-2588 ; Yu 等，Bioorg. Med. Chem. Lett.
(2001)11:2263-2267;及 Kandimalla 等，Bioorg. Med. Chem. (2001)9:807-813)。另外，結(jié)構(gòu)活性關(guān)系研究已經(jīng)容許鑒定如下的合成基序和新的基于DNA的結(jié)構(gòu)，它們誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答序型(profile)與那些源自于非甲基化CpG 二核苷酸的截然不同(KandimallaER 等，Proc Natl Acad Sci USA. (2005) 102:6925-30. Kandimalla ER 等，Proc NatlAcad Sci USA. (2003) 100:14303-8. Cong YP 等，Biochem Biophys Res Commun.(2003)310:1133-9. Kandimalla ER等，Biochem Biophys Res Commun. (2003)306:948-53.Kandimalla ER 等，Nucleic Acids Res. (2003)31:2393-400. Yu D 等，Bioorg Med Chem.(2003) 11:459-64. Bhagat L 等，Biochem Biophys Res Commun. (2003)300:853-61. Yu D等，Nucleic Acids Res. (2002) 30:4460-9. Yu D 等，J Med Chem. (2002) 45:4540-8. Yu D等，Biochem Biophys Res Commun. (2002)297:83-90. Kandimalla ER等，Bioconjug Chem.
(2002)13:966-74. Yu D, K 等,Nucleic Acids Res. (2002)30:1613—9. Yu D 等,BioorgMed Chem. (2001)9:2803-8.Yu D 等，Bioorg Med Chem Lett. (2001) 11:2263-7.Kandimalla ER 等，Bioorg Med Chem. (2001)9:807-13. Yu D 等，Bioorg Med Chem Lett.(2000) 10:2585-8. Putta MR等，Nucleic Acids Res. (2006)34:3231-8)。然而，直到最近，TLR7和TLR8的天然配體仍是未知的。已經(jīng)顯示了，TLR7和8識(shí)別病毒的和合成的單鏈RNA及小分子，包括多種核苷(Diebold, S. S.等，Science v:303，1529-1531 (2004))。Diebold 等(Science, 303:1529-1531 (2004))顯示了，對(duì)流感病毒的IFN-α應(yīng)答要求流感基因組RNA的內(nèi)體識(shí)別及通過TLR7和MyD88的信號(hào)傳導(dǎo)，而且鑒定了 ssRNA為一種TLR7配體。某些合成化合物，即咪唑喹諾酮(imidazoquinolones)、咪喹莫特(imiquimod) (R-837)和雷西莫特(resiquimod) (R-848)是 TLR7 和 TLR8 的配體(Hemmi H 等,(2002)Nat Tmmunol3:196-200; Jurk M等，(2002)Nat Immunol3:499)。另外，已經(jīng)顯示了某些鳥苷類似物諸如脫氣_G、7-硫-8-氧-G(TOG)、和7-稀丙基-8-氧-G (洛索立賓(Ioxoribine))在高濃度時(shí)活化 TLR7(Lee J 等，Proc Natl Acad Sci USA. 2003，100:6646-51)。然而，還已知這些小分子例如咪喹莫特經(jīng)由其它受體起作用(Schon MP等，(2006) J. InvestDermatol. , 126, 1338-47)。TLR7或TLR8識(shí)別和潛在地廣泛范圍的刺激性ssRNA分子缺乏任何已知的特定ssRNA基序提示，TLR7和TLR8能識(shí)別自身的和病毒的RNA兩者。最近顯示了，某些富含⑶的寡核糖核苷酸在與N-[l-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨甲基硫酸鹽(DOTAP)或其它脂質(zhì)劑復(fù)合時(shí)是免疫刺激性的，并且經(jīng)由TLR7和TLR8起作用(Heil等，Science，303:1526-1529(2004) ; Lipford 等,W003/086280; Wagner 等,W098/32462)。然而，RNA 分子已經(jīng)被使用了很多年，例如作為核酶和更新近地，作為siRNA和微小RNA,而且作為核酶、siRNA、和微小RNA采用的RNA含有⑶二核苷酸。另外，已經(jīng)顯示了，多種這些RNA分子在脂質(zhì)存在的情況中經(jīng)由TLR刺激而引起免疫應(yīng)答(Kariko等，Immunity (2005) 23:165-75;MaZ 等，Biochem Biophys Res Commun. , (2005)330,755-9)。然而，這些 RNA 分子的不穩(wěn)定性阻礙了許多領(lǐng)域(例如人類疾病的預(yù)防和治療)中使用和應(yīng)用這些分子的進(jìn)展。含有核糖或脫氧核糖的寡核苷酸和寡脫氧核苷酸已經(jīng)在極其多種領(lǐng)域中使用，包括但不限于診斷探測(cè)、PCR引發(fā)、基因表達(dá)的反義抑制、siRNA、微小RNA、適體、核酶、和基于Toll樣受體(TLR)的免疫治療劑。最近，許多出版物已經(jīng)證明了寡脫氧核苷酸作為免疫調(diào)控劑的用途，以及它們?cè)趯?duì)許多疾病諸如變態(tài)反應(yīng)、哮喘、自身免疫、癌癥和傳染病的免疫療法應(yīng)用中單獨(dú)的或作為佐劑的用途。DNA寡核苷酸受到TLR9識(shí)別，而RNA寡核苷酸受到TLR7和/或TLR8識(shí)別的實(shí)情最可能是由于DNA和RNA之間的結(jié)構(gòu)構(gòu)造差異。然而，DNA和RNA之間的化學(xué)差異也使DNA在化學(xué)和酶方面遠(yuǎn)比RNA更穩(wěn)定。RNA被普遍存在的胞外核糖核酸酶(RNA酶)快速降解，這確保少許的(若有的話)自體ssRNA到達(dá)抗原呈遞細(xì)胞。外切核酸酶對(duì)核酸的降解主要是3’ -核酸酶消化的，及較小比例經(jīng)由5’ -外切核酸酶作用的。在外切核酸酶消化外，RNA還能被RNA酶的內(nèi)切核酸酶活性降解。目前為止，基于RNA的分子不得不與脂質(zhì)復(fù)合來提供針對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性。雖然這些核糖核酸酶提供預(yù)防自身免疫反應(yīng)性的必要功能，但是它們還給為用于免疫療法而設(shè)計(jì)的任何合成ssRNA分子呈現(xiàn)了一個(gè)實(shí)質(zhì)性問題，即核糖核酸酶會(huì)快速降解合成的和天然的ssRNA兩者。為了克服此障礙，已經(jīng)如下嘗試了保護(hù)ssRNA分子免于降解，即在脂質(zhì)體中包囊ssRNA，用聚乙撐亞胺將其縮合(condense)，或?qū)⑵渑c諸如^[1-(2，3-二油酰氧基)-丙基]-隊(duì)隊(duì)^三甲基銨甲基硫酸鹽(DOTAP)等分子復(fù)合。然而，這些保護(hù)措施是對(duì)仍然不穩(wěn)定的ssRNA應(yīng)用的第二手措施，而且這些保護(hù)措施對(duì)ssRNA(天然的或合成的)的體內(nèi)效力和免疫調(diào)控活性的影響仍然不清楚。Agrawal等(11/697，422)記載了一類新的SIMRA組合物。然而，開發(fā)別的化合物仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)，所述化合物保留裸RNA，使得其繼續(xù)被識(shí)別為TLR7和/或TLR8的配體，同時(shí)改善其穩(wěn)定性，使得它能成為在體內(nèi)有用的分子。理想地，可以經(jīng)由設(shè)計(jì)天性穩(wěn)定的基于RNA的分子來應(yīng)對(duì)此挑戰(zhàn)，所述分子能充當(dāng)新型免疫治療劑，其會(huì)在許多臨床相關(guān)應(yīng)用中找到應(yīng)用，諸如在共施用時(shí)改善疫苗接種的效果或者在引起或增強(qiáng)免疫應(yīng)答有益時(shí)，治療和/或預(yù)防疾病，例如癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘或由病原體引起的疾病。發(fā)明概述在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了新型穩(wěn)定化免疫調(diào)控性RNA(“SIMRA”)化合物(下文有進(jìn)一步定義)及其用于誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的用途。依照本發(fā)明的新型化學(xué)實(shí)體提供了誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的化合物，其在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答方面實(shí)質(zhì)上更有效且對(duì)于降解實(shí)質(zhì)上更不敏感。依照本發(fā)明的方法使得能夠?yàn)槊庖忒煼☉?yīng)用使用SIMRA來改變細(xì)胞因子和/或趨化因子序型。在第一個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種作為TLR8激動(dòng)劑的SIMRA化合物。在第一個(gè)方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種作為TLR7和TLR8 二者激動(dòng)劑的SIMRA化合物。在第一個(gè)方面的又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種作為TLR7激動(dòng)劑的SIMRA化合物。在第一個(gè)方面的又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種作為佐劑的SIMRA化合物。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥物組合物。這些組合物包含本發(fā)明的任一種SIMRA組合物和生理學(xué)可接受的或藥學(xué)可接受的載體。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于在脊椎動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給所述脊椎動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的至少一種依照本發(fā)明的SIMRA化合物。在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于治療性處理患有會(huì)受益于誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的疾病或病癥(例如癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘或由病原體引起的疾病)的脊椎動(dòng)物的方法，該方法包括給患有此類病癥或疾病的患者施用藥學(xué)有效量的至少一種依照本發(fā)明的SIMRA化合物。在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于在脊椎動(dòng)物中預(yù)防會(huì)受益于誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的疾病或病癥(例如癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘或由病原體引起的疾病)的方法，該方法包括給易患此類病癥或疾病的脊椎動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的至少一種依照本發(fā)明的SIMRA化合物。在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種如下的方法，即分離能夠生成細(xì)胞因子或趨化因子的細(xì)胞(例如免疫細(xì)胞、PBMC)，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)此類細(xì)胞，用至少一種本發(fā)明的SIMRA化合物離體處理此類細(xì)胞，使得所分離的細(xì)胞生成或分泌水平升高的細(xì)胞因子或趨化因子，并給需要細(xì)胞因子或趨化因子療法以預(yù)防或治療疾病的患者施用或再施用經(jīng)處理的細(xì)胞。在本發(fā)明這個(gè)方面的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，給需要細(xì)胞因子或趨化因子療法以預(yù)防或治療疾病的患者施用與一種或多種SMRA化合物組合的分離的、經(jīng)SMRA處理的細(xì)胞。
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具體地，本發(fā)明涉及下述I. 一種SMRA化合物，其選自由SMRA#1至SMRA#189組成的組。2. 一種組合物，其包含項(xiàng)I的SMRA化合物和生理學(xué)可接受載體。3. 一種用于在脊椎動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給所述脊椎動(dòng)物施用依照項(xiàng)I的SIMRA化合物。4. 一種用于治療性處理患有會(huì)受益于調(diào)控免疫應(yīng)答的疾病或病癥的脊椎動(dòng)物的方法，該方法包括給所述脊椎動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的依照項(xiàng)I的SIMRA化合物。5.項(xiàng)4的方法，其中所述疾病或病癥是癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘或由病原體引起的疾病。6.依照項(xiàng)4的方法，其進(jìn)一步包括施用一種或多種化療化合物。7.依照項(xiàng)4的方法，其進(jìn)一步包括施用靶向治療劑。8.依照項(xiàng)4的方法，其進(jìn)一步包括施用抗體。9.依照項(xiàng)4的方法，其進(jìn)一步包括施用DNA疫苗。10.依照項(xiàng)4的方法，其進(jìn)一步包括施用蛋白質(zhì)疫苗。11.依照項(xiàng)4的方法，其進(jìn)一步包括施用肽疫苗。12.依照項(xiàng)4的方法，其進(jìn)一步包括施用抗原。13.依照項(xiàng)4的方法，其進(jìn)一步包含佐劑。14. 一種用于預(yù)防性處理患有會(huì)受益于調(diào)控免疫應(yīng)答的疾病或病癥的脊椎動(dòng)物的方法，該方法包括給所述脊椎動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的依照項(xiàng)I的SIMRA化合物。15.項(xiàng)14的方法，其中所述疾病或病癥是脊椎動(dòng)物中的癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘或由病原體引起的疾病。16.依照項(xiàng)15的方法，其進(jìn)一步包括施用一種或多種化療化合物。
17.依照項(xiàng)15的方法，其進(jìn)一步包括施用靶向治療劑。
18.依照項(xiàng)15的方法，其進(jìn)一步包括施用抗體。
19.依照項(xiàng)15的方法，其進(jìn)一步包括施用DNA疫苗。
20.依照項(xiàng)15的方法，其進(jìn)一步包括施用蛋白質(zhì)疫苗。
21.依照項(xiàng)15的方法，其進(jìn)一步包括施用肽疫苗。
22.依照項(xiàng)15的方法，其進(jìn)一步包括施用抗原。
23.依照項(xiàng)15的方法，其進(jìn)一步包括施用佐劑。
附圖
簡述依照實(shí)施例I合成本發(fā)明的SIMRA化合物。圖I是用于本發(fā)明SIMRA化合物的平行合成的合成方案。DMTr=4，4’ - 二甲氧基三苯甲基；CE=氰乙基。圖2A描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞中的NF- κ B活性。簡言之，用150 μ g/ml TLR8激動(dòng)劑刺激HEK293細(xì)胞達(dá)18小時(shí)，并使用SEAP (分泌型人胚胎堿性磷酸酶)測(cè)定法來測(cè)定NF-K B水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖2B描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞中的NF- κ B活性。簡言之，用150 μ g/ml TLR8激動(dòng)劑刺激HEK293細(xì)胞達(dá)20小時(shí)，并使用SEAP測(cè)定法來測(cè)定NF-κ B水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖2C-圖2E描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞中的NF- κ B活性。簡言之，用150 μ g/ml TLR8激動(dòng)劑刺激HEK293細(xì)胞達(dá)18小時(shí)，并使用SEAP測(cè)定法來測(cè)定NF- κ B水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖2F描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞中的NF- κ B活性。簡言之，用O、20、50、100、200、或300 μ g/ml激動(dòng)劑刺激表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞達(dá)18小時(shí)。使用SEAP測(cè)定法來測(cè)定NF- κ B 7K平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖2G描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR7的HEK293細(xì)胞中的NF- κ B活性。簡言之，用O、20、50、100、200、或300 μ g/ml激動(dòng)劑刺激表達(dá)人TLR7的HEK293細(xì)胞達(dá)18小時(shí)。使用SEAP測(cè)定法來測(cè)定NF- κ B 7K平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖2H、圖2J和圖2L描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞中的NF-κΒ活性。簡言之，用0、20、50、100、200、或300 μ g/ml激動(dòng)劑刺激表達(dá)人TLR8的HEK293細(xì)胞達(dá)18小時(shí)。使用SEAP測(cè)定法來測(cè)定NF- κ B水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖21、圖2Κ和圖2Μ描繪了依照實(shí)施例2處理和分析的表達(dá)人TLR7的ΗΕΚ293細(xì)胞中的NF-κΒ活性。簡言之，用0、20、50、100、200、或300 μ g/ml激動(dòng)劑刺激表達(dá)人TLR7的HEK293細(xì)胞達(dá)18小時(shí)。使用SEAP測(cè)定法來測(cè)定NF- κ B水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的免疫應(yīng)答序型。圖3Α-圖3C描繪了來自依照實(shí)施例3處理和分析的人PBMC的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液分離PBMC，并用50 μ g/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖4A-圖4C描繪了來自依照實(shí)施例3處理和分析的人PBMC的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液分離PBMC，并用200 μ g/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖4D-圖4AA描繪了來自依照實(shí)施例3處理和分析的人PBMC的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液分離PBMC，并用濃度漸增的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的、劑量依賴性的、TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖5A-圖5C描繪了來自依照實(shí)施例3分離、處理、和分析的人類漿細(xì)胞樹突細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液PBMC分離pDC，并用50 μ g/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖描繪了來自依照實(shí)施例3分離、處理、和分析的人類漿細(xì)胞樹突細(xì)胞(pDC)的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液PBMC分離pDC，并用50 μ g/ml或200 μ g/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖6A、圖6B、圖6C、圖6E和圖6F描繪了來自依照實(shí)施例3處理和分析的人類漿細(xì)胞樹突細(xì)胞(PDC)的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液PBMC分離pDC，并用200 μ g/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖6D描繪了來自依照實(shí)施例3處理和分析的人類漿細(xì)胞樹突細(xì)胞(pDC)的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液PBMC分離pDC，并用100 μ g/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖7A-圖7C描繪了來自依照實(shí)施例3處理和分析的人髓樣樹突細(xì)胞(myeloiddendritic cell,mDC)的細(xì)胞因子和趨化因子濃度。簡言之，自新鮮獲得的健康人志愿者的血液PBMC分離mDC，并用50 μ g/ml劑量的TLR7/8激動(dòng)劑培養(yǎng)24小時(shí)，收集上清液，并通過Luminex多重測(cè)定法來分析細(xì)胞因子和趨化因子水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖8A和圖8B描繪了依照實(shí)施例4處理和分析C57BL/6小鼠后2小時(shí)，C57BL/6小鼠(n=3)中的血清細(xì)胞因子誘導(dǎo)。簡言之，給C57BL/6小鼠皮下注射25mg/kg劑量的TLR7/8激動(dòng)劑，并在施用激動(dòng)劑后2小時(shí)，對(duì)血清分析細(xì)胞因子和趨化因子水平，并呈現(xiàn)IL-12水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的體內(nèi)施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因
子序型。圖9A和圖9B描繪了依照實(shí)施例4處理和分析BALB/c小鼠后2小時(shí)，BALB/c小鼠(n=3)中的血清細(xì)胞因子誘導(dǎo)。簡言之，給BALB/c小鼠皮下注射25mg/kg劑量的TLR7/8激動(dòng)劑，并在施用激動(dòng)劑后2小時(shí)，對(duì)血清分析細(xì)胞因子和趨化因子水平，并呈現(xiàn)IL-12水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的體內(nèi)施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因
子序型。圖9C-圖9F描繪了依照實(shí)施例4處理和分析BALB/c小鼠后2小時(shí)，BALB/c小鼠(n=3)中的血清細(xì)胞因子誘導(dǎo)。簡言之，給BALB/c小鼠皮下注射10mg/kg或25mg/kg劑量的TLR7/8激動(dòng)劑，并在施用激動(dòng)劑后2小時(shí)，對(duì)血清分析細(xì)胞因子和趨化因子水平，并呈現(xiàn)IL-12水平。數(shù)據(jù)表明，依照本發(fā)明的SIMRA的體內(nèi)施用產(chǎn)生獨(dú)特的TLR介導(dǎo)的細(xì)胞因子和趨化因子序型。圖IOA-圖IOH描繪了依照實(shí)施例5處理的來自表2的例示性SMRA化合物的血清穩(wěn)定性。簡言之，將約O. 5個(gè)OD的例示性SMRA化合物個(gè)別地在含1%人血清的PBS中于37° C溫育30分鐘。30分鐘溫育結(jié)束時(shí)，在陰離子交換HPLC上分析SMRA化合物以測(cè)定保留的全長SMRA化合物與血清處理前存在的SMRA化合物量相比的百分比。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及寡核糖核苷酸作為免疫調(diào)控劑用于免疫療法應(yīng)用的治療用途。具體地，本發(fā)明提供了具有改善的體內(nèi)穩(wěn)定性的基于RNA的寡核苷酸，其經(jīng)由單獨(dú)的TLR7、TLR7和TLR8 二者、或單獨(dú)的TLR8調(diào)控免疫應(yīng)答(SMRA化合物)。通過啟動(dòng)多種多樣的先天性和獲得性免疫應(yīng)答機(jī)制，例如經(jīng)由用穩(wěn)定的TLR7和/或TLR8激動(dòng)劑或者SMRA化合物活化樹突細(xì)胞和其它抗原呈遞細(xì)胞，所得的細(xì)胞因子序型能導(dǎo)致對(duì)病原體、受感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的破壞以及抗原特異性抗體和CTL應(yīng)答的發(fā)生。如此，本發(fā)明提供了一組多種多樣的SMRA化合物，每種具有其自己的獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)特征。因此，能針對(duì)不同醫(yī)學(xué)適應(yīng)證定制免疫應(yīng)答的范圍和性質(zhì)，即提供具有針對(duì)該適應(yīng)證的想要的一組免疫調(diào)控特征的SIMRA化合物。通過提及而將本文中所引用的授權(quán)專利、專利申請(qǐng)、和參考文獻(xiàn)收入本文，其程度如同具體地和個(gè)別地指明通過提及而收錄每一篇一樣。在本文中所引用的任何參考文獻(xiàn)的任何教導(dǎo)與本說明書之間不一致的情況中，對(duì)本發(fā)明來說以后者為準(zhǔn)。本發(fā)明提供了用于使用SIMRA化合物來增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法。此類方法會(huì)在免疫療法應(yīng)用中找到應(yīng)用，諸如但不限于成年和兒科人類和獸醫(yī)應(yīng)用中癌癥、自身免疫性病癥、哮喘、呼吸變態(tài)反應(yīng)、食物變態(tài)反應(yīng)、皮膚變態(tài)反應(yīng)、和細(xì)菌、寄生物和病毒感染的治療。如此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了對(duì)免疫療法具有最佳水平的免疫調(diào)控效果的新型SIMRA化合物及用于制備和使用此類化合物的方法。另外，本發(fā)明的SIMRA化合物作為佐劑或者與可用于治療疾病或狀況且不降低SIMRA化合物的免疫調(diào)控效果的藥劑組合用于預(yù)防和治療疾病是有用的。定義術(shù)語“2’ -取代的核糖核苷”或“2’ -取代的阿拉伯糖苷(arabinoside)” 一般包括如下的核糖核苷或阿拉伯糖核苷，其中戊糖模塊2’位置的羥基被取代而生成2’-取代的或2’ -O-取代的核糖核苷。在某些實(shí)施方案中，所述取代是用含有1-6個(gè)飽和的或不飽和的碳原子的低級(jí)烴基、用鹵素原子、或用具有6-10個(gè)碳原子的芳基進(jìn)行的，其中所述烴基或芳基可以是未取代的或者可以是取代的，例如用鹵素、羥基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、羰烷氧基(carboalkoxy)、或氨基取代。本發(fā)明的阿拉伯糖核苷包括但不限于阿拉伯糖-G、阿拉伯糖-C、阿拉伯糖-U、阿拉伯糖-A。2’ -O-取代的核糖核苷或2’ -O-取代的阿拉伯糖苷的例子包括但不限于2’ -氨基、2’ -氟、2’ -烯丙基、2’ -O-烴基和2’ -炔丙基核糖核苷或阿拉伯糖苷、2’ -O-甲基核糖核苷或2’ -O-甲基阿拉伯糖苷和2’ -O-甲氧基乙氧基核糖核苷或2’ -O-甲氧基乙氧基阿拉伯糖苷。術(shù)語“3’ ”在用于方向時(shí)一般指多核苷酸或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸中另一區(qū)域或位置3’(朝向糖的3’位置)的區(qū)域或位置。術(shù)語“5’ ”在用于方向時(shí)一般指多核苷酸或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸中另一區(qū)域或位置5’(朝向糖的5’位置)的區(qū)域或位置。術(shù)語“約” 一般意味著確切的數(shù)目不是至關(guān)重要的。如此，寡核糖核苷酸中核糖核苷殘基的數(shù)目不是至關(guān)重要的，而且涵蓋少一個(gè)或兩個(gè)核糖核苷或阿拉伯糖苷殘基或者多一個(gè)至數(shù)個(gè)核糖核苷或阿拉伯糖苷殘基的寡核糖核苷酸作為上文所述每一個(gè)實(shí)施方案的等同方案。術(shù)語“佐劑” 一般指如下物質(zhì)，其在被添加至諸如疫苗或抗原等免疫原性劑時(shí)在暴露于該混合物的受體宿主中增強(qiáng)或加強(qiáng)針對(duì)所述藥劑的免疫應(yīng)答。術(shù)語“氣道炎癥” 一般包括但不限于由傳染性變應(yīng)原引起的呼吸道炎癥，包括哮喘。術(shù)語“變應(yīng)原”一般指抗原或在暴露于受試者后引發(fā)變態(tài)反應(yīng)的分子(通常是蛋白質(zhì))的抗原性部分。典型的是,受試者對(duì)變應(yīng)原是過敏的,如通過例如風(fēng)團(tuán)(wheal)和潮紅(flare)測(cè)試或本領(lǐng)域已知的任何方法所指出的。即使只有一小部分受試者在暴露于該分子后展現(xiàn)出變應(yīng)性(例如IgE)免疫應(yīng)答，也說該分子是變應(yīng)原。術(shù)語“變態(tài)反應(yīng)” 一般包括但不限于食物變態(tài)反應(yīng)、呼吸變態(tài)反應(yīng)和皮膚變態(tài)反應(yīng)。術(shù)語“抗原” 一般指受到抗體或T細(xì)胞抗原受體識(shí)別和選擇性結(jié)合的物質(zhì)?？乖梢园ǖ幌抻陔?、蛋白質(zhì)、核苷、核苷酸及其組合?？乖梢允翘烊坏幕蚝铣傻?，而且一般誘導(dǎo)對(duì)該抗原特異性的免疫應(yīng)答。術(shù)語“自身免疫性病癥” 一般指其中“自身”抗原遭受免疫系統(tǒng)攻擊的病癥。阻斷3’或5’降解或者“帽”或“加帽”意味著寡核糖核苷酸的3’或5’端附著于另一分子(例如接頭或其它非RNA核苷酸)以充分抑制核酸酶降解(例如3’外切核酸酶降解)。術(shù)語“載體” 一般涵蓋任何賦形劑、稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、油、脂、含脂的囊泡、微球體、脂質(zhì)體封裝、或本領(lǐng)域公知用于藥物配制劑的其它物質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解，載體、賦形劑、或稀釋劑的特征會(huì)取決于用于特定應(yīng)用的施用路徑。含有這些物質(zhì)的藥學(xué)可接受配制劑的制備記載于例如《Remington’s Pharmaceutical Sciences》,第18版,A. Gennaro 編，Mack Publishing Co. , Easton, PA, 1990。術(shù)語“共施用”一般指在足夠近的時(shí)間里施用至少兩種不同物質(zhì)以調(diào)控免疫應(yīng)答。共施用包括同時(shí)施用至少兩種不同物質(zhì)。術(shù)語“互補(bǔ)的”一般意味著具有與核酸雜交的能力。所述雜交通常是互補(bǔ)鏈之間氫鍵鍵合的結(jié)果(優(yōu)選形成Watson-Crick或Hoogsteen堿基對(duì)),雖然其它模式的氫鍵鍵合以及堿基堆積也能導(dǎo)致雜交。術(shù)語“免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸” 一般指在給諸如魚類、鳥類或哺乳類等脊椎動(dòng)物施用時(shí)誘導(dǎo)或遏制免疫應(yīng)答的寡核糖核苷酸。術(shù)語“與...組合” 一般意味著在治療同一患者的同一疾病的過程中，而且包括以任意次序施用SIMRA化合物和可用于治療疾病或狀況且不降低SIMRA化合物的免疫調(diào)控效果的藥劑，包括同時(shí)施用或共施用，以及相隔幾秒鐘至數(shù)天的時(shí)間上有間隔的次序。此類組合處理還可包括超過一次的SMRA化合物和/或獨(dú)立的所述藥劑的施用。SMRA化合物和所述藥劑的施用可以是通過相同或不同的路徑的。術(shù)語“個(gè)體”或“受試者” 一般指哺乳動(dòng)物，諸如人。哺乳動(dòng)物一般包括但不限于人、非人靈長類、大鼠、小鼠、貓、犬、馬、牛(cattle)、奶牛(cows)、豬、綿羊和家兔。術(shù)語“線性合成” 一般指在免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸的一端開始并線性進(jìn)展至另一端的合成。線性合成容許將相同或不同(就所摻入的長度、堿基組成和/或化學(xué)修飾而言)
11的單體單元摻入免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸。術(shù)語“接頭”一般指能借助共價(jià)或非共價(jià)鍵合經(jīng)由糖、堿基、或主鏈附著至寡核糖核苷酸的任何模塊。接頭可用于附著兩個(gè)或更多個(gè)核苷，或者可附著至寡核糖核苷酸的5’和/或3’末端核苷酸。所述接頭可以是非核苷酸接頭或核苷酸接頭。術(shù)語“經(jīng)過修飾的核苷” 一般是包括經(jīng)過修飾的雜環(huán)堿基、經(jīng)過修飾的糖模塊、或其任意組合的核苷。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的核苷是非天然嘧啶或嘌呤核苷，如本文所述。為了本發(fā)明，經(jīng)過修飾的核苷、嘧啶或嘌呤類似物或非天然存在的嘧啶或嘌呤可互換使用，指包括非天然存在的堿基和/或非天然存在的糖模塊的核苷。為了本發(fā)明，如果某堿基不是鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶，那么認(rèn)為該堿基是非天然的。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的核苷是2’ -取代的核糖核苷和阿拉伯糖核苷或2’ -脫氧-2’ -取代的阿拉伯糖苷，可以將它們替代入寡核糖核苷酸的選定位置中以提高穩(wěn)定性而不干擾TLR7或TLR8活性。術(shù)語“調(diào)控”或“刺激” 一般指變化，諸如響應(yīng)的升高或響應(yīng)的定性差異，這可以源于對(duì)響應(yīng)的引發(fā)和/或增強(qiáng)。術(shù)語“非核苷酸接頭”一般指能借助共價(jià)或非共價(jià)鍵合附著至寡核糖核苷酸的、核苷酸連接以外的化學(xué)模塊。優(yōu)選的是，所述非核苷酸接頭的長度是約2埃至約200埃，而且可以是順式或反式取向。術(shù)語“核苷酸連接” 一般指經(jīng)由它們的糖(例如3’ _3’、2’ _3’、2’ _5’、3’ _5’)接合兩個(gè)核苷的化學(xué)連接，其由相鄰核苷間的磷酸酯、非磷酸酯、帶電荷的、或中性的基團(tuán)(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)組成。術(shù)語“肽”一般指長度和組成足以影響生物學(xué)應(yīng)答(例如抗體生成或細(xì)胞因子活性，無論該肽是否是半抗原)的多肽。術(shù)語“肽”可以包括經(jīng)過修飾的氨基酸(無論是天然存在的還是非天然存在的)，其中所述修飾包括但不限于磷酸化、糖基化、PEG化、脂化(Iipidization)和甲基化。術(shù)語“藥學(xué)可接受的”或“生理學(xué)可接受的”一般指不干擾依照本發(fā)明的化合物的效力和與生物學(xué)系統(tǒng)(諸如細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、或生物體)相容的物質(zhì)。優(yōu)選的是，所述生物學(xué)系統(tǒng)是活的生物體，諸如脊椎動(dòng)物。術(shù)語“藥學(xué)有效量”一般指足以實(shí)現(xiàn)期望生物學(xué)效應(yīng)(諸如有益結(jié)果)的量。如此，“藥學(xué)有效量”會(huì)取決于施用它的背景。藥學(xué)有效量可以在一次或多次預(yù)防性或治療性施用中施用。術(shù)語“SIMRA” 一般指由TLR7和/或TLR8識(shí)別為配體的穩(wěn)定化的免疫調(diào)控性RNA化合物，其中所述化合物可含有單鏈RNA(ssRNA)和/或雙鏈RNA (dsRNA)，和用于保護(hù)或穩(wěn)定其3’末端的修飾(例如通過阻斷3’降解或通過為3’末端加帽或通過連接兩條或更多條寡核糖核苷酸的3’末端)，倘若SMRA在體內(nèi)比未經(jīng)修飾的寡核糖核苷酸更加穩(wěn)定且如此實(shí)現(xiàn)(affect)它的免疫調(diào)控能力。SMRA可含有經(jīng)過修飾的寡核糖核苷酸。SMRA化合物還可含有用于保護(hù)其5’末端以進(jìn)一步改善寡核糖核苷酸穩(wěn)定性的修飾(例如通過阻斷5’降解或給5’末端加帽)。SIMRA可以是線性的或分支的，其中核酸是經(jīng)由例如磷酸二酯、硫代磷酸酯或備選連接相連接的核糖核苷聚合物。SIMRA可以由共價(jià)附著至核糖殘基或其衍生物的嘌呤(腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)或其衍生物(例如7-脫氮-G、阿拉伯糖-G和阿拉伯糖-A))或嘧啶(胞嘧啶(C)或尿嘧啶⑶或其衍生物(例如阿拉伯糖-C和阿拉伯糖-U))喊基組成。術(shù)語“治療”或“處理”一般指旨在獲得有益的或期望的結(jié)果(其可以包括癥狀的緩和或者疾病進(jìn)展的延遲或改善)的辦法。術(shù)語“病毒性疾病” 一般指具有病毒作為其起病性因子的疾病，包括但不限于乙肝、丙肝、流感、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、和帶狀皰疹。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了新的SMRA化合物。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了修飾免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸以保護(hù)其3’末端(例如通過阻斷3’降解或者給3’末端加帽或者通過連接兩條或更多條寡核糖核苷酸的3’末端)令人驚訝地影響其免疫調(diào)控能力。另外，已確定這種保護(hù)令人驚訝地改善寡核糖核苷酸的穩(wěn)定性，不再需要脂質(zhì)聯(lián)合或其它保護(hù)手段。進(jìn)一步地，在保護(hù)3’末端外或者與保護(hù)3’末端組合，阻斷5’降解或給5’末端加帽還能改善寡核糖核苷酸的穩(wěn)定性。在本發(fā)明中，演示了用新型SIMRA化合物活化TLR8，并誘導(dǎo)獨(dú)特的免疫應(yīng)答(例如細(xì)胞因子和/或趨化因子序型的變化)。此外，在此類人TLR8活化性RNA中摻入某些化學(xué)修飾還能活化TLR7，導(dǎo)致獨(dú)特的免疫應(yīng)答和細(xì)胞因子和/或趨化因子序型的變化。如此，本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)了，通過使用經(jīng)修飾的化學(xué)結(jié)構(gòu)(包括經(jīng)修飾的堿基、經(jīng)修飾的糖、主鏈、接頭、連接和/或帽)作為免疫調(diào)控性寡核糖核苷酸的一部分能經(jīng)由活化TLR8和/或TLR7來調(diào)控與之相關(guān)的細(xì)胞因子和/或趨化因子序型。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種免疫調(diào)控性化合物，其包含至少兩條基于RNA的寡核苷酸，這些寡核苷酸在它們的3’末端、或核苷間連接、或者官能化的核堿基或糖處與非核苷酸接頭連接。本發(fā)明的此實(shí)施方案可以具有至少一個(gè)易接近的5’末端，其可以是加帽的或未加帽的。已經(jīng)確定了，此結(jié)構(gòu)為SMRA化合物提供了進(jìn)一步的穩(wěn)定性(例如抑制外切核酸酶活性)而無需脂質(zhì)聯(lián)合或其它保護(hù)?！耙捉咏?’末端”意味著SIMRA的5’端不以阻止SMRA化合物經(jīng)由TLR7和/或TLR8調(diào)控免疫應(yīng)答的方式修飾。本發(fā)明這個(gè)方面的另一個(gè)實(shí)施方案包含至少兩條寡核糖核苷酸，其中所述免疫調(diào)控性化合物具有如下的結(jié)構(gòu)，包括但不限于那些如表I式I-X中所詳述的。表I :寡核糖核苷酸式I-X
權(quán)利要求
1.選自下組的SIMRA化合物(a)5，-AUGCUGCGCUG-M-GUCGCGUCGUA-5，;(b)5，-UG1CUG1CUUUUG1-X-G1UUUUCG1UCG1U-5>;(c)5’ -UG1UUG1UUUG1UG1-X-G1UG1UUUG1UUG1U-5> ;和(d)5，-UGiAUGiAAGiCUU-X-UUCGiAAGLU-5，; 其中為7-脫氮-rG，M為順，順-環(huán)己烷三醇，且X為甘油接頭。
2.一種組合物,其包含權(quán)利要求I的SMRA化合物和生理學(xué)可接受的載體。
3.權(quán)利要求I的SIMRA化合物在制備用于在脊椎動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的用途，其中產(chǎn)生免疫應(yīng)答包括對(duì)所述脊椎動(dòng)物施用權(quán)利要求I的SIMRA化合物。
4.權(quán)利要求3的用途，其中所述治療還包括施用一種或多種化療化合物、靶向治療劑、抗體、DNA疫苗、蛋白疫苗、肽疫苗、抗原、或佐劑。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述佐劑是明礬。
6.權(quán)利要求I的SIMRA化合物在制備用于治療性處理患有會(huì)受益于調(diào)控免疫應(yīng)答的疾病或病癥的脊椎動(dòng)物的藥物中的用途，其中所述處理包括對(duì)所述脊椎動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的權(quán)利要求I的SIMRA化合物。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述疾病或病癥是癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、或由病原體引起的疾病。
8.權(quán)利要求6的用途，其中所述處理進(jìn)一步包括施用一種或多種化療化合物、靶向治療劑、抗體、DNA疫苗、蛋白疫苗、肽疫苗、抗原、或佐劑。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述佐劑是明礬。
10.權(quán)利要求I的SIMRA化合物在制備用于預(yù)防性處理患有會(huì)受益于調(diào)控免疫應(yīng)答的疾病或病癥的脊椎動(dòng)物的藥物中的用途，其中所述處理包括對(duì)所述脊椎動(dòng)物施用藥學(xué)有效量的權(quán)利要求I的SIMRA化合物。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述疾病或病癥是癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、傳染病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、或由病原體引起的疾病。
12.權(quán)利要求10的用途，其中所述處理進(jìn)一步包括施用一種或多種化療化合物、靶向治療劑、抗體、DNA疫苗、蛋白疫苗、肽疫苗、抗原、或佐劑。
13.權(quán)利要求12的用途，其中所述佐劑是明礬。
14.權(quán)利要求2的組合物，還包含一種或多種化療化合物、靶向治療劑、抗體、DNA疫苗、蛋白疫苗、肽疫苗、抗原、或佐劑。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述佐劑是明礬。
全文摘要
本發(fā)明涉及穩(wěn)定化免疫調(diào)控性RNA(SIMRA)化合物。更具體地，本發(fā)明提供新型穩(wěn)定化寡核糖核苷酸作為免疫調(diào)節(jié)劑用于免疫療法應(yīng)用的治療用途。本發(fā)明提供了新的基于RNA的寡核糖核苷酸，其具有改善的核酸酶和RNA酶穩(wěn)定性，而且具有經(jīng)由TLR7和/或TLR8的免疫調(diào)控活性。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102921003SQ20121031996
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2008年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月9日
發(fā)明者?？舶?R.坎迪馬拉, 蘭濤, 王大慶, 萊克什米.巴加特, 蘇迪爾.阿格拉沃爾 申請(qǐng)人:艾德拉藥物股份有限公司