乳漿大戟提取物及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乳漿大戟提取物及其制備方法和應用。本發(fā)明提供了用有機溶劑提取乳漿大戟得到的乳漿大戟提取物，可用于制備具有如下功能的產品：（1）抑制腫瘤細胞的增殖和/或生長；（2）抑制腫瘤細胞的克隆形成能力；（3）促進腫瘤細胞凋亡；（4）將腫瘤細胞的發(fā)育周期抑制在G0/G1期；（5）治療癌癥。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現乳漿大戟提取物能顯著以時間和劑量依賴的方式抑制宮頸癌細胞的生長和增殖，能使宮頸癌細胞的線粒體膜電位顯著降低、誘導細胞發(fā)生凋亡性細胞死亡。本發(fā)明為開發(fā)乳漿大戟的藥用價值開辟了新的途徑，對宮頸癌的治療具有重要價值。
【專利說明】乳漿大戟提取物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種乳漿大戟提取物及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]乳衆(zhòng)大戟,屬于大戟科,拉丁名為Euphorbia esula Linn.,野生于山坡或路旁,在我國華東、東北到西南各省區(qū)都有分布。
[0003]乳漿大戟是一種有毒多年生草本植物，形態(tài)特征如下:高15-40厘米；有白色乳液；莖直立，下部帶淡紫色；短枝或營養(yǎng)校上的葉密生，線狀倒披針形；長枝或生花的莖上的葉互生，倒披針形或線狀披針形，長1-3.5厘米，寬0.2-0.8厘米，頂端鈍、微凹或有細凸尖；多歧聚傘花序頂生，通常3-5枝呈傘狀，每傘梗再2-3回叉狀分枝；總苞片對生，半圓形，頂端短尖；杯狀總苞頂4裂，腺體4，位于裂片之間，新月形，兩端有短角；蒴果無毛；種子灰褐色或有棕色斑點，長約2毫米。
[0004]在臨床上，內用乳漿大戟可治療四肢浮腫、小便不利、腸炎、瘧疾、慢性氣管炎等，外用乳漿大戟可治頸淋巴結結核、瘡癬、瘙癢等，尚無其它臨床應用的報道。
[0005]宮頸癌是第二常見的婦科惡性腫瘤。在2002年全球癌癥統(tǒng)計中，約有273000人死于宮頸癌，是全球死亡率的一個主要因素。在女性惡性腫瘤中宮頸癌占15%，其中83%發(fā)生在發(fā)展中國家。預防、診斷和治療宮頸癌成了維護婦女健康的首要問題。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種乳漿大戟提取物及其制備方法和應用。
`[0007]本發(fā)明提供的乳漿大戟提取物，是用有機溶劑提取乳漿大戟得到的。
[0008]所述有機溶劑具體可為乙醇或乙醇溶液。所述乙醇溶液具體可為乙醇水溶液，如95% (體積百分含量)乙醇水溶液。
[0009]所述提取的方法具體可為浸提，為了提高有機溶劑的效率，浸提過程中同時進行溶劑回流。
[0010]為了增加提取效率，提取前可將乳漿大戟進行烘干和粉碎。
[0011]所述乳漿大戟可為全植株，也可為根、莖或葉。
[0012]所述提取的方法具體可為將100.0g乳漿大戟干粉加入500mL 95% (體積百分含量)乙醇水溶液，室溫條件下浸提24小時(為了有效利用溶劑，浸提過程中同時進行溶劑回流)。
[0013]為了增加有效成分的濃度，在進行所述提取后，可將整個體系進行濃縮?，F有的濃縮方法均可采用，如旋轉蒸發(fā)。
[0014]以上任一所述乳漿大戟提取物在制備產品中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述產品的功能為如下(I)至(5)中的至少一種:(I)抑制腫瘤細胞的增殖和/或生長；(2)抑制腫瘤細胞的克隆形成能力；(3)促進腫瘤細胞凋亡；(4)將腫瘤細胞的發(fā)育周期抑制在G0/G1期；(5)治療癌癥。所述(I)和/或(2)和/或(3)和/或(4)中，所述腫瘤細胞可為宮頸癌細胞。所述(5)中，所述癌癥可為宮頸癌。
[0015]本發(fā)明還保護一種產品，它的活性成分為以上任一所述的乳漿大戟提取物。所述產品的功能為如下(I)至(5沖的至少一種:(1)抑制腫瘤細胞的增殖和/或生長；(2)抑制腫瘤細胞的克隆形成能力；(3)促進腫瘤細胞凋亡；(4)將腫瘤細胞的發(fā)育周期抑制在GO/Gl期；(5)治療癌癥。所述(I)和/或(2)和/或(3)和/或(4)中，所述腫瘤細胞可為宮頸癌細胞。所述(5)中，所述癌癥可為宮頸癌。
[0016]以上任一所述宮頸癌細胞可為HeLa細胞或caski細胞。以上任一所述宮頸癌具體可為HeLa細胞和/或caski細胞引起的宮頸癌。
[0017]以上任一所述“將腫瘤細胞的發(fā)育周期抑制在G0/G1期”是通過降低細胞中的細胞周期蛋白Cyclin E和周期依賴性激酶⑶K4的表達水平，同時升高P21蛋白的表達水平引起的。
[0018]本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現乳漿大戟提取物能顯著以時間和劑量依賴的方式抑制宮頸癌細胞的生長和增殖，能使宮頸癌細胞的線粒體膜電位顯著降低、誘導細胞發(fā)生凋亡性細胞死亡，能顯著阻滯宮頸癌細胞停留在G0/G1期、降低cyclinDUcyclinE和⑶K4的表達水平，增加P21的表達水平。本發(fā)明為開發(fā)乳漿大戟的藥用價值開辟了新的途徑，對宮頸癌的治療具有重要價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為MTT增殖抑制實驗的結果。
[0020]圖2為細胞克隆形成實驗的結果；A:空白對照；B:乳漿大戟提取物濃度為I μ g/mL ；C:乳漿大戟提取物濃度為2 μ g/mL ；D:乳漿大戟提取物濃度為4 μ g/mL ；E:乳漿大戟提取物濃度為8 μ g/mL ；F:乳 漿大戟提取物濃度為16 μ g/mL。
[0021]圖3為Annexin V-PI雙染細胞凋亡率分析的結果；A:空白對照；B:乳漿大戟提取物濃度為2 μ g/mL ；C:乳漿大戟提取物濃度為8 μ g/mL ；D:乳漿大戟提取物濃度為16 μ g/mL。
[0022]圖4為DAPI染色后細胞核形態(tài)觀察的結果；A:空白對照；B:乳漿大戟提取物濃度為2 μ g/mL ；C:乳漿大戟提取物濃度為8 μ g/mL ；D:乳漿大戟提取物濃度為16 μ g/mL。
[0023]圖5為線粒體膜電位檢測的結果；A:空白對照；B:乳漿大戟提取物濃度為8 μ g/mL。
[0024]圖6為PI單染流式細胞周期分析的結果；A:空白對照；B:乳漿大戟提取物濃度為2 μ g/mL ；C:乳漿大戟提取物濃度為8 μ g/mL ；D:乳漿大戟提取物濃度為16 μ g/mL。
[0025]圖7為Western blot蛋白分析的結果。
【具體實施方式】
[0026]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例中的細胞培養(yǎng)均采用高糖DEME培養(yǎng)基。
[0027]HeLa細胞(宮頸癌細胞):購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，產品目錄號:3142C0001000000009。caski細胞(宮頸癌細胞):購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，產品目錄號:3142C0001000000117。
[0028]乳漿大戟:公眾可從清華大學深圳研究生院獲得；參考文獻:王韌，王建鋒.內蒙古草原乳漿大戟及其天敵.中國草地1992，(2): 16-19.。
[0029]實施例1、乳漿大戟提取物的制備
[0030]1、將乳漿大戟全植株(包括根、莖、葉)洗凈、烘干、粉碎至60目(實際應用中20-100目均可)，得到干粉。
[0031]2、取100.0g步驟I得到的干粉，加入500mL 95%乙醇水溶液，室溫條件下靜置浸提24小時(浸提過程中溶劑連續(xù)回流)。 [0032]3、將完成步驟2的全部液體體系用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至50mL，然后加入無菌蒸餾水并用無菌蒸餾水定容至100ml，即為乳漿大戟提取物，以步驟2中的干粉計，乳漿大戟提取物的濃度為lg/mL。
[0033]實施例2、乳漿大戟提取物抑制宮頸癌細胞的生長和增殖
[0034]分別將HeLa細胞和Caski細胞進行如下實驗(乳漿大戟提取物的濃度以干粉計):
[0035]一、MTT增殖抑制實驗
[0036]將HeLa細胞懸液(細胞密度為I X 104/ml)接種至96孔板中；然后加入實施例1制備的乳衆(zhòng)大戟提取物，使其在各個孔中的濃度分別為I P g/mL>2 μ g/mL>4 μ g/mL>8 μ g/mL或16 μ g/mL (每個濃度設置9個復孔)，設置用等體積液體培養(yǎng)基代替乳漿大戟提取物的空白對照，37°C培養(yǎng)；從加入乳漿大戟提取物開始計時，分別于24h、48h或72h(每個處理時間設置3個復孔)后加入MTT溶液(每孔20ul)，37°C培養(yǎng)4h，棄上清，加入DMSO (每孔150ul)并震蕩反應lOmin，然后于490nm測吸光度(OD49tol)15
[0037]抑制率=(空白對照組的OD49tlnm數值-實驗組的OD49tol數值)+空白對照組的OD49tol數值X 100%。
[0038]各濃度處理實驗組的抑制率結果見圖1和表1。
[0039]表1各濃度處理實驗組的抑制率結果(平均值)
[0040]
【權利要求】
1.一種乳漿大戟提取物，是用有機溶劑提取乳漿大戟得到的。
2.如權利要求1所述的乳漿大戟提取物，其特征在于:所述有機溶劑為乙醇或乙醇溶液。
3.權利要求1或2所述乳漿大戟提取物在制備產品中的應用；所述產品的功能為如下(I)至(5)中的至少一種:(I)抑制腫瘤細胞的增殖和/或生長；(2)抑制腫瘤細胞的克隆形成能力；(3)促進腫瘤細胞凋亡；(4)將腫瘤細胞的發(fā)育周期抑制在G0/G1期；(5)治療癌癥。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于:所述(I)和/或(2)和/或(3)和/或(4)中，所述腫瘤細胞為宮頸癌細胞。
5.如權利要求3所述的應用，其特征在于:所述(5)中，所述癌癥為宮頸癌。
6.一種產品，它的活性成分為權利要求1或2所述乳漿大戟提取物。
7.如權利要求6所述的產品，其特征在于:所述產品的功能為如下(I)至(5)中的至少一種:(I)抑制腫瘤細胞的增殖和/或生長；(2)抑制腫瘤細胞的克隆形成能力；(3)促進腫瘤細胞凋亡；(4)將腫瘤細胞的發(fā)育周期抑制在G0/G1期；(5)治療癌癥。
8.如權利要求7所述的產品，其特征在于:所述(I)和/或(2)和/或(3)和/或(4)中，所述腫瘤細胞為宮頸癌細胞。
9.如權利要求7所述的產品，其特征在于:所述(5)中，所述癌癥為宮頸癌。
【文檔編號】A61P35/00GK103655674SQ201210333567
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月11日 優(yōu)先權日:2012年9月11日
【發(fā)明者】陳紅波, 黃來強, 范強旺, 明平紅, 寧勇 申請人:清華大學深圳研究生院