抗人乳頭瘤病毒的三價疫苗及其制法和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗人乳頭瘤病毒的三價疫苗及其制法和用途。具體地，本發(fā)明通過大量篩選和分析kozak序列，發(fā)現(xiàn)具有大幅度提高HPVL1蛋白表達(dá)水平的kozak序列；并對人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1(HPV?L1)的16、18和58基因進(jìn)行重新設(shè)計和序列優(yōu)化，排除影響翻譯的mRNA的二級結(jié)構(gòu)，并據(jù)此構(gòu)建高表達(dá)的HPV?L1基因表達(dá)盒，所述表達(dá)盒尤其適用于在畢赤酵母中表達(dá)，并具有蛋白表達(dá)量高、穩(wěn)定性好的特點。
【專利說明】抗人乳頭瘤病毒的三價疫苗及其制法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程和疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及抗人乳頭瘤病毒的三價疫苗及其制法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]宮頸癌是常見的婦科惡性疾病，在最常見的婦女癌癥中，宮頸癌的發(fā)病率高居第二。HPV (乳頭瘤病毒)病毒感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，人類至今已經(jīng)分離到了至少118種乳頭瘤病毒。目前已證實，在肛生殖系統(tǒng)癌癥中，由HPV感染所誘發(fā)的癌癥占3.7%。
[0003]在已被分離出的HPV病毒亞型中，已發(fā)現(xiàn)有15種具有誘導(dǎo)生殖系統(tǒng)癌癥的發(fā)生，因而被歸為高危性HPV病毒亞型(如HPV16, 18，31，33，52和58)，其中HPV16和HPV18兩種亞型在全世界占所有由HPV感染誘發(fā)宮頸癌的70%。繼HPV16和HPV18之后，HPV58和HPV52在亞洲和非洲具有高患病率，占全世界宮頸癌發(fā)病率的2-3%。大規(guī)模中國婦女HPV病毒亞型分布分析表明，整體上HPV的患病率(包括高危和低危HPV病毒亞型)在侵入性子宮頸癌(ICC)為82.7%，在高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)中為88.5%，在低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)為 69.3%ο
[0004]HPV是一種DNA病毒，直徑約為45_55nm，呈球形，無包膜，衣殼為72個殼微粒組成對稱偏斜的20面體，其病毒顆粒衣殼由主要衣殼蛋白(LI)和次要衣殼蛋白(L2)組成。主要衣殼蛋白LI在細(xì)胞中表達(dá)后能自動組裝成衣殼顆粒，稱為病毒樣顆粒(VLPs)，該顆粒與天然病毒有相似的空間構(gòu)象、免疫特性和生物學(xué)活性，并可以大規(guī)模制備和純化。
[0005]含不同亞型或混合型HPV的VLPs/Ll蛋白預(yù)防性疫苗已相繼被成功研制并開始在臨床實驗上使用。美國默克 公司研究出了含有HPV6、HPV11、HPV16和HPV18的四價疫苗(商品名Gardasil)，已獲FDA批準(zhǔn)并在美國上市，英國的葛蘭素史克公司也研究出了含有HPV16和HPV18的兩價疫苗。
[0006]但是，就目前的HPV疫苗的生產(chǎn)工藝而言，大多采用大腸桿菌、釀酒酵母(如Merk公司)或昆蟲細(xì)胞(如葛蘭素史克公司)作為反應(yīng)器進(jìn)行生產(chǎn)。大腸桿菌表達(dá)的LI蛋白不能被正確折疊和修飾，并以包涵體的形式表達(dá)，因此要組裝成病毒樣顆粒LI蛋白需要經(jīng)過變性和復(fù)性的過程，純化工藝復(fù)雜，同時體外組裝的病毒樣顆粒的免疫原性低于真核表達(dá)并自主組裝的病毒樣顆粒。用釀酒酵母生產(chǎn)HPV的VLP也存在一些明顯的缺點，例如，釀酒酵母中的外源HPVLl基因存在于質(zhì)粒而非染色體上，導(dǎo)致分泌效率差、表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定、在生產(chǎn)過程中易發(fā)生質(zhì)粒丟失等現(xiàn)象。此外，釀酒酵母的分泌蛋白平均每條側(cè)鏈有50-150個甘露糖殘基，這種過度的糖基化導(dǎo)致所生產(chǎn)的VLP在某些個體中產(chǎn)生不利的過敏反應(yīng)；釀酒酵母無法采用高密度發(fā)酵，發(fā)酵成本很高。
[0007]目前為止，還沒有人體對具有不同基因型的各HPV病毒亞型之間存在交叉反應(yīng)的報道，因此針對某一病毒亞型的特異性疫苗通常只能使得接種者對該特定病毒亞型有預(yù)防效果。為使易感人群或患者具有針對抗一種以上病毒亞型(尤其是多種高危HPV)的預(yù)防免疫功能或治療效果，迫切需要對該人群聯(lián)合施用針對幾種相應(yīng)的不同病毒亞型疫苗。[0008]總之，本領(lǐng)域目前尚缺乏低成本、高效率的多種HPV LI蛋白或VLP的制備方法，因此迫切需要開發(fā)新的高效、簡便、低成本地制備HPV的LI蛋白或VLP的方法，尤其是制備同時含有HPV16、HPV18和HPV58的LI蛋白或VLP的方法，以便能夠開發(fā)針對多種特定亞型的疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供非常適于在畢赤酵母中表達(dá)HPVLl蛋白的kozak序列以及HPVLl表達(dá)盒。
[0010]本發(fā)明的另一目的是提供一種優(yōu)化的人乳頭瘤狀病毒16、18和58L1蛋白的核酸序列。
[0011]本發(fā)明的另一目的是提供一種制備抗人乳頭瘤狀病毒的疫苗的制備方法。
[0012]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種編碼人乳頭瘤病毒HPV的主要衣殼蛋白LI的核酸分子，所述的核酸分子選自下組:
[0013](I)核酸分子的序列如SEQ ID N0.: 3所示，或與SEQ ID N0.: 3所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%，更佳地≥99%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.: 2相同或基本相同；
[0014](2)核酸分子的序列如SEQ ID N0.: 6所示或，或與SEQ ID N0.: 6所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%，更佳地≥99%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.: 5相同或基本相同；
[0015](3)核酸分子的序列如SEQ ID N0.: 9所示，或與SEQ ID N0.: 9所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%，更佳地≥99%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.:8相同或基本相同。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的基本相同為氨基酸序列的同源性> 98%，較佳地> 99%。
[0017]在另一優(yōu)選例中，序列如SEQ ID N0.:3所示的核酸分子編碼野生型人乳頭瘤病毒HPV16L1 蛋白。
[0018]在另一優(yōu)選例中，序列如SEQ ID N0.:6所示的核酸分子編碼野生型人乳頭瘤病毒HPV18L1 蛋白。
[0019]在另一優(yōu)選例中，序列如SEQ ID N0.:9所示的核酸分子編碼野生型人乳頭瘤病毒HPV58L1 蛋白。
[0020]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種人乳頭瘤病毒HPV的主要衣殼蛋白HPVLl的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒的5’ -3’依次具有下述元件:kozak序列、HPVLl編碼序列、和終止子。[0021 ]在另一優(yōu)選例中，所述的 kozak 序列為:5 ’ - (A/T) A (A/C) AA (A/C) ATGTC (T/C) _3 ’。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的kozak序列任選自SEQ ID N0.: 10-25，較佳地任選自SEQID NO: 10、12、14 或 22，更佳地為 SEQ ID NO: 10。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述HPVLl編碼序列選自下組:
[0024](I)序列如SEQ ID N0.:3所示，或與SEQ ID N0.:3所示序列的同源性> 95% (較佳地≥98%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.: 2相同或基本相同；
[0025](2)序列如SEQ ID N0.:6所示，或與SEQ ID N0.:6所示序列的同源性> 95% (較佳地≥98%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.: 5相同或基本相同；[0026](3)序列如SEQ ID N0.:9所示，或與SEQ ID N0.:9所示序列的同源性≥95% (較佳地≥98%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.:8相同或基本相同。
[0027]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述載體含有本發(fā)明第一方面所述的核酸分子或本發(fā)明第二方面所述的表達(dá)盒。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述載體為pPIC3.5和pPIC3.5K，較佳地為pPIC3.5K。
[0029]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明的第三方面所述的載體或染色體整合有本發(fā)明第一方面所述的核酸分子或本發(fā)明第二方面所述的
表達(dá)盒。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞的染色體具有1-50個拷貝的本發(fā)明第一方面所述的核酸分子或本發(fā)明第二方面所述的表達(dá)盒。
[0032]在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞的染色體具有2-10個拷貝，較佳地3-7個拷貝的本發(fā)明第一方面所述的核酸分子或本發(fā)明第二方面所述的HPVLl基因表達(dá)盒。
[0033]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種制備人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白的方法，包括步驟:
[0034](i)在適合的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的第四方面所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母，從而表達(dá)出人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白；和
[0035](ii)分離所述蛋白。
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述的人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白選自下組:HPV16L1 ；HPV18L1 ；或 HPV58L1。
[0037]在本發(fā)明的第六方面，提供了一種制備人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒的方法，包括步驟:
[0038](a)在適合的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的第四方面所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母，從而產(chǎn)生人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒；和
[0039](b)分離所述病毒樣顆粒。
[0040]在另一優(yōu)選例中，所述的人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒選自下組:HPV16L1病毒樣顆粒；HPV18L1病毒樣顆粒；*HPV58L1病毒樣顆粒。
[0041]在本發(fā)明的第七方面，提供了一種制備疫苗組合物的方法，包括步驟:
[0042]將本發(fā)明的第五方面所述方法制備的人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白或本發(fā)明的第六方面所述方法制備的人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒與藥學(xué)上可接受的疫苗佐劑混合，從而形成疫苗組合物。
[0043]在另一優(yōu)選例中，所述的人乳頭瘤病毒LI蛋白為HPV16L1 ；HPV18L1 ;*HPV58L1。
[0044]在另一優(yōu)選例中，所述的HPVLl病毒樣顆粒為:HPV16L1病毒樣顆粒；HPV18L1病毒樣顆粒；或HPV58L1病毒樣顆粒。
[0045]在另一優(yōu)選例中，所述的佐劑為鋁佐劑、GLA佐劑，更佳的為GLA佐劑。
[0046]在本發(fā)明的第八方面，提供了一種制備人乳頭瘤三價疫苗的方法，包括步驟:
[0047](a)在適合的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的第四方面所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母，從而分別產(chǎn)生HPV16L1病毒樣顆粒、HPV18L1病毒樣顆粒和HPV58L1病毒樣顆粒；和[0048](b)分離所述HPV16L1病毒樣顆粒、HPV18L1病毒樣顆粒和HPV58L1病毒樣顆粒，將所述病毒樣顆粒與藥學(xué)上可接受的疫苗佐劑混合，從而形成三價疫苗。
[0049]在另一優(yōu)選例中，所述的疫苗佐劑為鋁佐劑、GLA佐劑，更佳的為GLA佐劑。
[0050]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖1顯示kozak序列優(yōu)化結(jié)果，其中，圖1A為16個kozak序列對目的蛋白產(chǎn)量的提高效果，其中，第I個、第3個、第5個和第13個的kozak序列的效果最明顯，分別提高了
1.5倍-2.2倍,最優(yōu)的kozak序列是第I個kozak序列；圖1B為相應(yīng)的Western Blot實驗結(jié)果。
[0052]圖2顯示了宿主細(xì)胞的染色體中HPV16L1基因拷貝數(shù)對目的蛋白產(chǎn)量的影響，其中，圖2A顯示，拷貝數(shù)越多，HPV16L1蛋白的產(chǎn)量越高；圖2B為基因拷貝數(shù)對目的蛋白產(chǎn)量Western Blot實驗結(jié)果。
[0053]圖3顯示了宿主細(xì)胞的染色體中多拷貝HPV18L1基因鑒定結(jié)果見，圖3A顯示不同的基因拷貝數(shù)對目的蛋白產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，在不同的宿主中，HPV18L1基因的拷貝數(shù)為1-3，拷貝數(shù)越多，HPV18L1蛋白的產(chǎn)量越高；圖3B為基因拷貝數(shù)對目的蛋白產(chǎn)量的Western Blot實驗結(jié)果。
[0054]圖4顯示了宿主細(xì)胞的染色體中多拷貝HPV58L1基因鑒定結(jié)果，圖4A顯示，不同的基因拷貝數(shù)對目的蛋白產(chǎn)量的影響，在不同的宿主中，HPV18L1基因的拷貝數(shù)為1-3，拷貝數(shù)越多，HPV18L1蛋白的產(chǎn)量越高；圖4B為基因拷貝數(shù)對目的蛋白產(chǎn)量的Western Blot實驗結(jié)果。
`[0055]圖5顯示體外重組蛋白的表達(dá)結(jié)果；圖5A表明，目的蛋白在12h開始表達(dá)，到48h達(dá)到高峰，在48-96h表達(dá)穩(wěn)定；圖5B顯示優(yōu)化后的HPV16L1的表達(dá)體系在各個時間點其目的蛋白的Western Blot實驗結(jié)果。
[0056]圖6顯示HPV16L1表達(dá)蛋白電泳結(jié)果，泳道1_9分別代表不同洗脫組分，目的蛋白約56kD，其純度約為90.0%。
[0057]圖7顯示自組裝HPV16L1病毒樣顆粒鑒定結(jié)果，組裝HPV16L1病毒樣顆粒大小不均一，顆粒直徑分布在25nm至65nm之間，平均粒徑45nm，與基因序列未優(yōu)化HPV的VLP的顆粒直徑分布相同。
【具體實施方式】
[0058]本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，篩選并優(yōu)化了大量的kozak序列，意外地發(fā)現(xiàn)了可以在畢赤酵母中極大促進(jìn)HPVLl蛋白表達(dá)的kozak序列，并據(jù)此構(gòu)建了含有kozak序列的HPVLl基因表達(dá)盒；本發(fā)明人還對人乳頭瘤狀病毒HPV16L1、HPV18L1和HPV58L1的基因序列進(jìn)行了針對性地優(yōu)化設(shè)計，從而大大提高了目的蛋白產(chǎn)量；本發(fā)明還提供了具有高拷貝HPVLl基因的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞生產(chǎn)HPVLl目的蛋白的能力可以提高16倍以上。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。[0059]術(shù)語
[0060]如本文所用，術(shù)語“病毒樣顆?！被颉癡LP”或“VLPs”指通過體外基因重組技術(shù)獲得的病毒樣顆粒(Virus-like particle, VLP),它具有天然病毒的外部結(jié)構(gòu),但不包含病毒DNA/RNA,因此VLP在體內(nèi)不會復(fù)制，提高了疫苗應(yīng)用的安全性，同時，VLP具有極好的免疫原性。
[0061]如本文所用，術(shù)語“HPVL1”指人乳頭瘤狀病毒HPV的主要衣殼蛋白LI。
[0062]如本文所用，術(shù)語“HPV VLP”指由人乳頭瘤狀病毒HPV的主要衣殼蛋白自組裝形成的病毒樣顆粒。
[0063]如本文所用，術(shù)語“HPV16L1”和“HPV16L1VLP”分別指人乳頭瘤狀病毒HPV16的主要衣殼蛋白LI和由該LI蛋白自組裝形成的病毒樣顆粒。
[0064]如本文所用，術(shù)語“HPV18L1”和“HPV18L1VLP”分別指人乳頭瘤病毒HPV18的主要衣殼蛋白LI和由該LI蛋白自組裝形成的病毒樣顆粒。
[0065]如本文所用，術(shù)語“HPV58L1”和“HPV58L1VLP”分別指人乳頭瘤病毒HPV58的主要衣殼蛋白LI和由該LI蛋白自組裝形成的病毒樣顆粒。
[0066]kozak序列篩選及優(yōu)化
[0067]如本文所用，術(shù)語kozak序列(kozak consensus sequence)是指存在于起始密碼子AUG附近的一段序列，其在翻譯的起始中有重要作用。在真核細(xì)胞中，翻譯的起始位點大多在5'端的AUG密碼子位點。當(dāng)與mRNA的5'端帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合后，核糖體的40S小亞基對mRNA進(jìn)行掃描，直到遇到第一個AUG密碼子。核糖體的40S小亞基對AUG周圍核酸序列的識別在很大程度上引發(fā)翻譯的起始，并影響翻譯效率。
[0068]本發(fā)明提供了一類特別適合在畢赤酵母中調(diào)控HPV LI蛋白表達(dá)的kozak序列，所述的 kozak 序列為:5，- (A/T) A (A/C) AA (A/C) ATGTC (T/C) 3’。
[0069]本發(fā)明人篩選并優(yōu)化了大量的kozak序列，各個kozak序列的信息見表1。并將所述kozak序列與編碼HPV16L1、HPV18L1、或HPV58L1的核苷酸序列連接。
[0070]測試所優(yōu)化和篩選的kozak序列在畢赤酵母中對基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)其中有4個經(jīng)優(yōu)化的kozak序列能夠大幅度提聞目的蛋白的表達(dá)效率(最聞可以達(dá)到2倍以上)。4個經(jīng)優(yōu)化的kozak序列為:第I個kozak序列(SEQ ID N0.10)、第3個kozak序列(SEQ IDN0.12)、第 5 個 kozak 序列(SEQ ID N0.14)、和第 13 個 kozak 序列(SEQ ID N0.22)。
[0071]表1
[0072]
【權(quán)利要求】
1.一種編碼人乳頭瘤病毒HPV的主要衣殼蛋白LI的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子選自下組: (1)核酸分子的序列如SEQID N0.:3所示，或與SEQ ID N0.: 3所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%，更佳地≥99%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.: 2相同或基本相同； (2)核酸分子的序列如SEQID N0.:6所示或，或與SEQ ID N0.:6所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%，更佳地≥99%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.: 5相同或基本相同； (3)核酸分子的序列如SEQID N0.:9所示，或與SEQ ID N0.:9所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%，更佳地≥99%)，且編碼的氨基酸序列與SEQ ID N0.:8相同或基本相同。
2.一種人乳頭瘤病毒HPV的主要衣殼蛋白HPVLl的表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒的5’ -3’依次具有下述元件:kozak序列、HPVLl編碼序列、和終止子。
3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒，其特征在于，所述的kozak序列為:5’-(A/T)A(A/C)AA (A/C)ATGTC(T/C) -3’。
4.一種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求1所述的核酸分子或權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。
5.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求4所述的載體或染色體整合有權(quán)利要求1所述的核酸分子或權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。
6.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞的染色體具有1-50個拷貝的權(quán)利要求1所述的核酸分子或權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒。
7.一種制備人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白的方法，其特征在于，包括步驟: (i)在適合的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母，從而表達(dá)出人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白；和 (?)分離所述蛋白。
8.一種制備人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒的方法，其特征在于，包括步驟: (a)在適合的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母，從而產(chǎn)生人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒；和 (b)分離所述病毒樣顆粒。
9.一種制備疫苗組合物的方法，其特征在于，包括步驟:將權(quán)利要求7所述方法制備的人乳頭瘤病毒HPVLl蛋白或權(quán)利要求8所述方法制備的人乳頭瘤病毒HPVLl病毒樣顆粒與藥學(xué)上可接受的疫苗佐劑混合，從而形成疫苗組合物。
10.一種制備人乳頭瘤三價疫苗的方法，其特征在于，包括步驟: (a)在適合的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母，從而分別產(chǎn)生HPV16L1病毒樣顆粒、HPV18L1病毒樣顆粒和HPV58L1病毒樣顆粒；和 (b)分離所述HPV16L1病毒樣顆粒、HPV18L1病毒樣顆粒和HPV58L1病毒樣顆粒，將所述病毒樣顆粒與藥學(xué)上可接受的疫苗佐劑混合，從而形成三價疫苗。
【文檔編號】A61P31/20GK103667319SQ201210333085
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月10日
【發(fā)明者】潘衛(wèi)慶, 徐新東, 張遠(yuǎn)斌 申請人:同濟(jì)大學(xué)