專利名稱：蓽茇在制備抑制神經(jīng)炎癥的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蓽茇或其提取物在制備抑制神經(jīng)炎癥的藥物中的應(yīng)用，特別涉及蓽茇或其提取物在制備通過抑制神經(jīng)炎癥來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
免疫系統(tǒng)在維護(hù)組織穩(wěn)態(tài)以及應(yīng)對(duì)感染和傷害中起著重要的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐免疫細(xì)胞，是單核吞噬細(xì)胞家族的成員之一，參與腦內(nèi)的固有免疫反應(yīng)。正常情況下小膠質(zhì)細(xì)胞起免疫監(jiān)視作用，通過簡(jiǎn)單的吞飲起到清除代謝產(chǎn)物，維護(hù)組織穩(wěn)定的凈化作用。在正常的生理?xiàng)l件下，大腦被認(rèn)為是免疫豁免的。實(shí)際上，抗原呈遞被主動(dòng)抑制，小膠質(zhì)細(xì)胞維持在靜息狀態(tài)，而免疫組分被血腦屏障排除在大腦之外。然而，神經(jīng)損傷或有毒物質(zhì)的存在，會(huì)刺激免疫細(xì)胞促炎癥介質(zhì)的釋放，這些促炎性介質(zhì)誘發(fā)了神經(jīng)炎癥反應(yīng)。當(dāng)神經(jīng)炎癥在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)以適當(dāng)?shù)某潭瘸霈F(xiàn)時(shí)，它可以解除誘發(fā)刺激，并恢復(fù)大腦的穩(wěn)態(tài)和功能。有益的急性神經(jīng)炎癥反應(yīng)可修復(fù)已有的損害，并將進(jìn)一步損傷降至最低。然而如果小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生了持續(xù)的過度激活，那么促炎癥因子(如TNF-α，IL-I β和PGE2)的長(zhǎng)時(shí)間無調(diào)控釋放創(chuàng)建了一個(gè)不利的神經(jīng)毒性環(huán)境，損害了神經(jīng)元，并損傷了大腦的正常功能(Block M. L. and Hong J. S. Microgliaand inflammation-mediated neurodegeneration!multiple triggers with a commonmechanism. Prog. Neurobiolj 2005，76:77 - 98.)。近十多年來，臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的證據(jù)說明了腦內(nèi)神經(jīng)炎癥與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，如帕金森病(Parkinson’ s disease, H))、阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease，AD)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)、痛癇(epilepsy)和腦缺血(cerebral ischemia)等(Zipp F，Aktas 0. The brain as a target ofinflammation:common pathways link inflammatory and neurodegenerative diseases.Trends Neurosci，2006，29:518 - 527)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病往往伴有神經(jīng)元細(xì)胞的大量壞死以及凋亡，而這些壞死病灶周圍聚集大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，并且可以檢測(cè)到其分泌的各種免疫因子和細(xì)胞毒因子，包括花生四烯酸代謝產(chǎn)物前列腺素E2 (prostaglandinE2，PGE2X 細(xì)胞因子(cytokine)、炎性趨化因子(inflammatory chemokines)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、活性氧自由基(reactive oxygen species，R0S)和興奮性氨基酸如谷氨酸等(Brown GC，Bal-Price A. Inflammatory neurodegeneration mediated bynitric oxide, glutamate, and mitochondria. Mol Neurobiolj 2003，27:325-355)，它們對(duì)周圍神經(jīng)元的存亡起著決定性的作用，更為重要的是這些因子之間相互作用和相互調(diào)節(jié)，當(dāng)它們過度產(chǎn)生時(shí)，彼此擴(kuò)大各自的毒性，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷、變性甚至死亡(BlockML,Zecca Lj Hong JS. Microglia-mediated neurotoxicity:uncovering the molecularmechanisms. Nat Rev Neuroscij 2007, 8: 57 - 69) □因此小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病情進(jìn)程中的作用逐漸被人們所重視。所以針對(duì)神經(jīng)炎癥尋找能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活、阻斷神經(jīng)毒性物質(zhì)釋放的藥物為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了一個(gè)富有吸引力的藥物研發(fā)方向(Klegeris A, McGeer EG, McGeer PL. Therapeutic approaches toinflammation in neurodegenerative disease. Curr Opin Neurol, 2007，20:351 - 357)。蓽茇是中、蒙、藏醫(yī)習(xí)慣用藥，味辛、性熱，臨床用于治療胃腹冷痛、食欲不振、消化不良、腎寒、寒瀉、嘔吐等癥狀。蓽茇中含有豐富的生物堿、酰胺類、木脂素類、萜類、甾醇類及其它類的化合物，其中生物堿和酰胺類約35種，尤其是胡椒堿的含量不少于2. 5%。目前文獻(xiàn)中還未見報(bào)道蓽茇提取物及胡椒堿可以抑制神經(jīng)炎癥，并據(jù)此對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面的相關(guān)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供蓽茇或其提取物在制備抑制神經(jīng)炎癥的藥物中的應(yīng)用。并提供蓽茇或其提取物在制備通過抑制神經(jīng)炎癥來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供蓽茇或其提取物在制備抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活作用的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供蓽茇或其提取物在制備減輕多巴胺神經(jīng)元損傷的藥物中的應(yīng)用。其中，蓽茇提取物是以醇為提取液進(jìn)行提取獲得的提取物，蓽茇提取物的制備方法，包括如下步驟I)取蓽茇干燥果實(shí)，用重量是所述蓽茇干燥果實(shí)的8-10倍的70-95% (是體積百分比)乙醇水溶液作為提取劑對(duì)所述蓽茇干燥果實(shí)進(jìn)行提取，得到提取液；2)將步驟I)得到的提取液濃縮成相對(duì)密度為1-1. I的濃縮液；3)將步驟2)得到的濃縮液用水稀釋，離心，將離心后的上清液經(jīng)過DlOl大孔吸附樹脂柱吸附；4)將步驟3)得到的吸附過所述上清液的DlOl大孔吸附樹脂柱用5_15倍柱體積的10-20%乙醇水溶液(體積百分比)洗脫，5)將步驟4)洗脫過的DlOl大孔吸附樹脂柱用10_20倍柱體積的60_70%乙醇水溶液(體積百分比)洗脫，收集第3至20個(gè)柱體積的洗脫液，即得到蓽茇提取物。在步驟I)中，為了提取充分，蓽茇干燥果實(shí)可以先粉碎，再提取，上述提取的次數(shù)可以為3次，所述提取劑是85% (體積百分比)的乙醇水溶液。在步驟2)中，所述濃縮是在50_70°C下減壓濃縮，優(yōu)選是在60°C、真空度0. OlPa下濃縮；所述濃縮液的相對(duì)密度是I. 08。在步驟3 )中，所述稀釋是指將步驟2 )的濃縮液加水稀釋，濃縮液加水后的總重量與所述蓽茇干燥果實(shí)質(zhì)量的比例是I: I ;所述離心是1000g-2000g下，離心10分鐘。在步驟4)中，所述5-15倍柱體積的10-20%乙醇水溶液洗脫優(yōu)選是10倍柱體積的20%乙醇水溶液洗脫；步驟5 )中，10-20倍柱體積的60-70%乙醇水溶液洗脫優(yōu)選是20倍柱體積的70 %乙醇水溶液洗脫。所述步驟5)得到第3至20個(gè)柱體積的洗脫液后，可進(jìn)行干燥，干燥的步驟如下將收集的洗脫液減壓濃縮，然后真空冷凍干燥。本發(fā)明還提供一種藥物，其有效成分為上述蓽茇提取物；所述藥物為抑制神經(jīng)炎·癥和/或抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活作用和/或減輕多巴胺神經(jīng)元損傷和/或治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。
上述抑制神經(jīng)炎癥和/或抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活作用和/或減輕多巴胺神經(jīng)元損傷和/或治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入機(jī)體。需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等。上述藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜?jiǎng)┑榷喾N形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。本發(fā)明采用的細(xì)胞模型是小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型，是100ng/ml脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)對(duì)BV2細(xì)胞系形成的細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)證明加入LPS (終濃度100ng/ml)和蓽茇提取物(終濃度O. 25mg/ml)共培養(yǎng)24h，蓽茇提取物能夠顯著減輕LPS引起的BV2細(xì)胞激活，降低細(xì)胞內(nèi)環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2, C0X-2)的蛋白水平，減少炎癥因子前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)的釋放。為進(jìn)一步確定蓽茇提取物抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用機(jī)制，通過對(duì)NF- K B信號(hào)通路的研究，蓽茇提取物能夠通過抑制LPS引起的I K B降解，從而減輕核轉(zhuǎn)錄因子NF- K B的p65亞基核轉(zhuǎn)位水平，進(jìn)而減少炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。為進(jìn)一步確定蓽茇提取物通過抑制神經(jīng)炎癥來起到神經(jīng)保護(hù)作用，又采用小鼠炎癥動(dòng)物模型。上述小鼠炎癥動(dòng)物模型是通過對(duì)C57小鼠腹腔注射5mg/kg的LPS形成的動(dòng)物模型。蓽茇提取物治療組是C57小鼠腹腔注射LPS后2h進(jìn)行120mg/kg的蓽茇提取物灌胃給藥，之后7d持續(xù)給藥、每日給藥I次。實(shí)驗(yàn)證明通過觀察對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CDlIb的免疫染色，發(fā)現(xiàn)蓽茇提取物E能夠減輕LPS引起的中腦黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細(xì)胞的激活；通過對(duì)多巴胺能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物酪氨酸輕化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)的免疫染色及蛋白免疫印跡方法檢測(cè),蓽發(fā)提取物對(duì)抗LPS引起的免疫炎癥損傷的神經(jīng)保護(hù)藥效與LPS模型組有顯著性差異。上述實(shí)驗(yàn)表明，蓽茇提取物可以抑制神經(jīng)炎癥、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，從而可以通過抑制神經(jīng)炎癥來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。


圖I為實(shí)施例I制備的蓽茇提取物的HPLC的圖譜。圖2為不同藥物處理BV2細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察來檢測(cè)蓽茇提取物抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的藥效。圖3為BV2細(xì)胞NADPH氧化酶p67及MHC II類分子0X-6的表達(dá)情況。圖示為不同藥物處理BV2細(xì)胞24h，進(jìn)行免疫熒光染色p67和0X-6。圖4為在BV2細(xì)胞系中藥物處理24h后，C0X-2的表達(dá)情況及PGE2釋放水平。圖示為不同藥物處理BV2細(xì)胞24h，通過免疫熒光染色和Western blot方法檢測(cè)C0X-2蛋白水平的變化情況，收集細(xì)胞上清通過ELISA法檢測(cè)PGE2釋放水平。**代表與Control組相比，Ρ〈0· 001 ；#代表與LPS模型組相比，Ρ〈0· 05。
圖5為在BV2細(xì)胞系中藥物處理Ih后，I K B及NF- K B亞基p65蛋白水平變化情況。圖示為不同藥物處理BV2細(xì)胞lh，通過免疫熒光染色檢測(cè)I K B、p65蛋白水平的變化情況，通過突光強(qiáng)度分析p65的核轉(zhuǎn)位情況；通過Western blot方法檢測(cè)I κ B蛋白水平的變化情況。**代表與Control組相比，P〈0. 001 ；#代表與LPS模型組相比，P〈0. 05 ；##代表與LPS模型組相比，P〈0. 001。圖6為在小鼠炎癥模型中7d進(jìn)行中腦黑質(zhì)部位小膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物CDllb免
疫組化結(jié)果。圖7為在小鼠炎癥模型中7d進(jìn)行中腦黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)志物TH免疫組化結(jié)果，及中腦黑質(zhì)紋狀體部位TH蛋白含量的水平。**代表與Control組相比，P〈0. 001 ；##代表與LPS模型組相比，P〈0. 001。
具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中使用的細(xì)胞系如下小膠質(zhì)瘤細(xì)胞系BV2是小鼠源的小膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心(3111C0001CCC000063)。 下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法如下I.蛋白免疫印跡 Western blotI. I蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(I)在Bio-Rad公司的灌膠模具上組裝gel sandwich,把用75%酒精擦干凈的兩玻璃板和中間I. Omm厚的隔板的下緣處于同一直線上，組裝嚴(yán)密以防漏膠；(2)按下表I中SDS-PAGE分離膠配方，制成10%的分離膠；表I. SDS-PAGE分離膠配方
ItMio%分離膠
H2O(Inl)4
~I. 5M Tri s-HCl, pH 8. 8 (ml)H
30% (g/ml) polyacrylamide (ml)3. 3
~10%SDS( μ I)100
~10%APS( μ I)100
TEMED(μ I)5 7(3)立即將分離膠注入膠槽的兩玻璃板之間，后注入去離子水，室溫靜置45-60min,使膠聚合；(4)待分離膠聚合后，吸出上層無離子水，并用濾紙吸干殘余水分；并再用無離子水洗凝膠頂部數(shù)次，以去除可能未完全聚合的丙烯酰胺，最后濾紙吸干殘余水分；(5)按下表2中SDS-PAGE濃縮膠配方，制成5%的濃縮膠； 表2. SDS-PAGE濃縮膠配方
權(quán)利要求
1.蓽茇或其提取物在制備抑制神經(jīng)炎癥的藥物中的應(yīng)用。
2.蓽茇或其提取物在制備抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活作用的藥物中的應(yīng)用。
3.蓽茇或其提取物在制備減輕多巴胺神經(jīng)元損傷的藥物中的應(yīng)用。
4.蓽茇或其提取物在制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中所述的應(yīng)用，其特征在于所述蓽茇提取物是以醇為提取液進(jìn)行提取獲得的提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述蓽茇提取物的制備方法，包括如下步驟 1)取蓽茇干燥果實(shí)，用重量是所述蓽茇干燥果實(shí)的8-10倍的體積百分比是70-95%的乙醇水溶液作為提取劑對(duì)所述蓽茇干燥果實(shí)進(jìn)行提取，得到提取液； 2)將步驟I)得到的提取液濃縮成相對(duì)密度為1-1.I的濃縮液； 3)將步驟2)得到的濃縮液用水稀釋，離心，將離心后的上清液經(jīng)過DlOl大孔吸附樹脂柱吸附； 4)將步驟3)得到的吸附過所述上清液的DlOl大孔吸附樹脂柱用5-15倍柱體積的體積百分比是10-20%的乙醇水溶液洗脫，將洗脫過的DlOl大孔吸附樹脂柱用10-20倍柱體積的體積百分比是60-70%的乙醇水溶液洗脫，收集第3至20個(gè)柱體積的洗脫液，即得到來自蓽茇的提取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述蓽茇提取物的制備方法中 步驟I)中，所述提取的次數(shù)為3次，所述提取劑是體積百分比是85%的乙醇水溶液； 步驟2)中，所述濃縮是在50-70°C下減壓濃縮，優(yōu)選是在60°C、真空度O. OlPa下濃縮；所述濃縮液的相對(duì)密度是I. 08。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述蓽茇提取物的制備方法中步驟3)中，所述稀釋是指將步驟2)的濃縮液加水稀釋，濃縮液加水后的總重量與所述蓽茇干燥果實(shí)質(zhì)量的比例是1:1 ;所述離心是在1000g-2000g下，離心10分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述蓽茇提取物的制備方法中步驟4)中，所述5-15倍柱體積的10-20%乙醇水溶液洗脫優(yōu)選是10倍柱體積的20%乙醇水溶液洗脫；步驟5)中，10-20倍柱體積的60-70%乙醇水溶液洗脫優(yōu)選是20倍柱體積的70%乙醇水溶液洗脫。
10.一種藥物，其有效成分為權(quán)利要求5-9中任意一項(xiàng)所述的蓽茇提取物；所述藥物為抑制神經(jīng)炎癥和/或抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活作用和/或減輕多巴胺神經(jīng)元損傷和/或治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了蓽茇或其提取物在抑制神經(jīng)炎癥的藥物中的應(yīng)用。所述蓽茇提取物是以醇為提取液進(jìn)行提取獲得的提取物。實(shí)驗(yàn)證明，蓽茇或其提取物可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減輕神經(jīng)炎癥的發(fā)生，從而達(dá)到治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的效果。
文檔編號(hào)A61K36/67GK102908401SQ20121035676
公開日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者楊慧, 吳霞, 曲鵬程, 段春禮, 魯鈴鈴, 張建亮 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)