專利名稱:使用muc1拮抗劑抑制炎癥的制作方法
使用MUC1拮抗劑抑制炎癥
背景技術(shù):
本申請(qǐng)要求2009年5月27日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/181,530、2009年10月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/253,730和2010年2月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/303,997的優(yōu)先權(quán),上述每個(gè)申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容均通過(guò)引用并入本文。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)。具體而言,已證明來(lái)源于MUCl細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域特定區(qū)域的MUCl肽抑制MUCl與NF- K B的相互作用,從而抑制NF- k B介導(dǎo)的炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外,已證明了針對(duì)STAT3介導(dǎo)的炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的類似作用。2.相關(guān)技術(shù) NF-k B 蛋白(RelA/p65、RelB、c-Rel、NF-k Bl/p50 和 NF-k B2/p52)是普遍表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。在無(wú)刺激時(shí),NF-K B蛋白與IKBa和IkB抑制蛋白家族的其他成員形成復(fù)合物定位于細(xì)胞質(zhì)中(Hayden&Ghosh,2008)。高分子量I k B激酶(IKKa、IKKP、IKKy)復(fù)合物對(duì)IKBa的磷酸化誘導(dǎo)IicBa的泛素化和降解,從而釋放NF- k B進(jìn)行核轉(zhuǎn)位。繼而NF-k B靶基因的激活通過(guò)調(diào)節(jié)炎性應(yīng)答、細(xì)胞增殖和存活促進(jìn)腫瘤發(fā)生(Karin&Lin,2002)。NF-kB p65與家族其他成員一樣包含負(fù)責(zé)二聚化和DNA結(jié)合的N端Rel同源結(jié)構(gòu)域(Rel homology domain, RHD)。RHD還作為IKBa蛋白中錨蛋白重復(fù)序列(ankyrinrepeats)的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮作用,其阻斷NF-k B p65的核定位信號(hào)(nuclear localizationsignal,NLS)。NF-k B_I k B a復(fù)合物在核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭(Hayden&Ghosh, 2008)。典型NF-K B通路的激活(例如在對(duì)腫瘤壞死因子a (TNFa)的細(xì)胞應(yīng)答中)誘導(dǎo)IKK-P介導(dǎo)的I K B a磷酸化和降解,同時(shí)NF- K B p65的平衡向核推移。核NF- k B 二聚體占據(jù)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域中的K B共有序列以及簡(jiǎn)并變體(Hoffman等,2006 ;Gilmore, 2008)。NF-k B靶基因的激活還通過(guò)NF-K B p65的翻譯后修飾及其與轉(zhuǎn)錄共激活因子相互作用而進(jìn)一步調(diào)節(jié)(Hayden&Ghosh,2008)。許多NF- k B靶基因中的一個(gè)是I^Ba,其的激活導(dǎo)致I k B a的重新合成和NF- K B轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的終止。粘蛋白是具有大量0-糖基化的蛋白質(zhì),其主要由上皮細(xì)胞表達(dá)。分泌的和膜結(jié)合的粘蛋白形成物理屏障,其保護(hù)上皮細(xì)胞的頂邊界不受由毒素、微生物和其他形式壓力(發(fā)生在與外界環(huán)境的交界處)所引起的損害??缒ふ车鞍譏(MUCl)也可通過(guò)其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)⑿盘?hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)部。除具有海膽精子的蛋白-腸激酶-agrin(protein-enterokinase-agrin, SEA)結(jié)構(gòu)域外,MUCl沒(méi)有與其他膜結(jié)合粘蛋白相似的序列(Duraisamy等,2006)。因此,MUCl翻譯為單一多肽,然后在SEA結(jié)構(gòu)域經(jīng)歷自切割(JBC,1992 ;Macao,2006)??缒UCl的C端亞基(MUCl-C)作為受體起作用(Ramasamy等,2007),并包含足以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的72個(gè)氨基酸的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(MUCKD) (Huang等,2005)。MUCl-C亞基還通過(guò)依賴于其寡聚化的過(guò)程靶向核(Leng等,2007)。MUCl-⑶作為被表皮生長(zhǎng)因子受體(Li等,2001)、c-Src (Li 等 2001)、糖原合酶激酶 3 ^ (GSK3 ^ ) (Li 等,1998)和 c-AbI (Ahmad 等
2006)磷酸化的底物起作用。MUCl-⑶還通過(guò)直接相互作用穩(wěn)定Wnt效應(yīng)物、P -聯(lián)蛋白,因此有助于轉(zhuǎn)化(Huang等,2005)。其他研究已證明MUCl-⑶直接與IKK P和IKK Y相互作用,并有助于激活I(lǐng)KK復(fù)合物(Ahmad等,2007)。顯然,沉默MUCl下調(diào)NF-k B p65在人癌細(xì)胞內(nèi)的組成型激活,提示MUCl-⑶在NF- K B p65通路的調(diào)節(jié)中起功能性作用(Ahmad等,2007)。這些發(fā)現(xiàn)也暗示,小分子可以靶向MUCl-⑶的功能來(lái)干擾癌細(xì)胞中的NF-k B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而,至今沒(méi)有有關(guān)影響NF- K B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的MUCl拮抗劑的報(bào)道。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signaltransducer and activator oftranscription, STAT)家族成員也參與轉(zhuǎn)化、腫瘤細(xì)胞存活、侵襲和轉(zhuǎn)移(Yu和Jove,2004)。STAT3轉(zhuǎn)錄因子被鑒定為白介素-6(IL-6)炎性應(yīng)答的效應(yīng)物(Wegenka,1994)。STAT3 通過(guò)以下來(lái)激活Janus-激活激酶(Janus-activated kinase, JAK) - I 磷酸化 IL-6受體,募集STAT3,之后磷酸化STAT3的705位保守酪氨酸(Yu和Jove,2004)。表皮生長(zhǎng)因子受體的激活也與STAT3Tyr-705的直接磷酸化相關(guān)。然后磷酸化的STAT3經(jīng)歷二聚化,易位至核并誘導(dǎo)STAT3靶基因的激活,所述靶基因編碼細(xì)胞周期進(jìn)展調(diào)節(jié)物(細(xì)胞周期蛋白Dl 和 c-Myc)和凋亡抑制物(生存素和 Bcl-xL) (Alvarez, 2005, Alvarez, 2006)。激活的STAT3誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化(Bromberg,1999)。而且,STAT3激活在多種癌和血液惡性腫瘤中被檢測(cè)到(Aaronson 和 Horvath, 2002 ;Bowman, 2000 ;Yu 和 Jove, 2004),這與 STAT3 參與控制生長(zhǎng)和 存活之基因的轉(zhuǎn)錄相符。對(duì)此,JAK-I — STAT3通路的小分子抑制劑在體外和動(dòng)物模型中有抗癌活性(Song, 2005 ;Siddiquee,2007 ;Ahmad, 2008 ;Germain 和 Frank,2007)。另外,阻斷EGFR至STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的適體抑制惡性上皮和血液細(xì)胞的生長(zhǎng)(Buerger,2003)。這些發(fā)現(xiàn)共同支持STAT3通路在聯(lián)系炎癥與腫瘤發(fā)生中的重要性。發(fā)明概述因此,按照本發(fā)明,提供了在表達(dá)MUCl的細(xì)胞中抑制炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法,其包括將細(xì)胞與具有至少4個(gè)連續(xù)MUCl殘基但不多于20個(gè)連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆蓋。所述肽可包含至少5、6或7個(gè)連續(xù)MUCl殘基,而且所述序列可更具體地包含 CQCR(SEQ ID NO :54)、CQCRR(SEQ ID NO :50)、CQCRRR(SEQ ID NO :51)、CQCRRRR (SEQ ID NO : 52)、CQCRRK (SEQ ID NO 4)或 CQCRRKN(SEQ ID NO :53)。所述肽可包含MUCl的不多于10個(gè)連續(xù)殘基、11個(gè)的連續(xù)殘基、12個(gè)連續(xù)殘基、13個(gè)連續(xù)殘基、14個(gè)連續(xù)殘基、15個(gè)連續(xù)殘基、16個(gè)連續(xù)殘基、17個(gè)連續(xù)殘基、18個(gè)連續(xù)殘基或19個(gè)連續(xù)殘基。MUCl陽(yáng)性細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或炎性細(xì)胞,例如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、骨髓源性抑制細(xì)胞、NK細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞。所述肽可以與細(xì)胞遞送結(jié)構(gòu)域融合,例如聚D-R、聚D-P或聚D-K。所述方法還可包括將細(xì)胞與第二抗炎劑接觸,例如類固醇或C0X-2抑制劑。第二抗炎劑的接觸可在肽之前、之后或與其同時(shí)進(jìn)行。所述肽包含的可以全部是L氨基酸、全部是D氨基酸或者包含L和D氨基酸的混合物。炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可包括NF-K B介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或STAT介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),例如STAT3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。NF-k B介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可包括NF-K B激活選自Bcl-xL和MUCl的靶基因。STAT3介導(dǎo)的炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可包括STAT3激活選自以下的靶基因細(xì)胞周期蛋白D1、生存素、Idpl、Idp2、CdknlC, Leftyl、Mest、Aesl、Zfp57、Zfp3611、Sh3bpl、Ccnd3 和 MUCl。在另一實(shí)施方案中,提供了在表達(dá)MUCl的細(xì)胞中抑制MUCl與NF-k B或STAT結(jié)合的方法,其包括將細(xì)胞與具有至少4個(gè)連續(xù)MUCl殘基但不多于20個(gè)連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆蓋。在另一實(shí)施方案中,提供了在表達(dá)MUCl的細(xì)胞中抑制MUCl與IKBa競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NF- K B的方法,其包括將細(xì)胞與具有至少4個(gè)連續(xù)MUCl殘基但不多于20個(gè)連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆蓋。在另一實(shí)施方案中,提供了在表達(dá)MUCl的細(xì)胞中抑制MUCl誘導(dǎo)的NF-K B核轉(zhuǎn)位的方法,其包括將細(xì)胞與具有至少4個(gè)連續(xù)MUCl殘基但不多于20個(gè)連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆蓋。在又一實(shí)施方案中,提供了抑制對(duì)象中的炎性應(yīng)答的方法,包括向所述對(duì)象施用具有至少4個(gè)連續(xù)MUCl殘基但不多于20個(gè)連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC (SEQ ID NO 4)的MUCl肽,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆蓋。所述肽可包含至少5、6或7個(gè)連續(xù)MUCl殘基,而且所述序列可更具體地包含CQCR、CQCRR、CQCRRR、CQCRRRR、CQCRRK或CQCRRKN。所述肽可包含MUCl的不多于10個(gè)連續(xù)殘基、11個(gè)連續(xù)殘基、12個(gè)連續(xù)殘基、13個(gè)連續(xù)殘基、14個(gè)連續(xù)殘基、15個(gè)連續(xù)殘基、16個(gè)連續(xù)殘基、17個(gè)連續(xù)殘基、18個(gè)連續(xù)殘基或19個(gè)連續(xù)殘基。炎性應(yīng)答可由NF- K B介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或STAT介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如STAT3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))引起。肽可與細(xì)胞遞送結(jié)構(gòu)域融合,例如聚D-R、聚D-P或聚D-K。施用可包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、口服、瘤內(nèi)、皮下、表面或腹腔內(nèi)施用,或者局部、區(qū)域、系統(tǒng)或持續(xù)施用。抑制可包括抑制或解除炎性應(yīng)答。所述方法還包括向?qū)ο笫┯玫诙寡字委?,例如類固醇或C0X2抑制劑。第二抗炎治療的施用可在肽之前、之后或與其同時(shí)進(jìn)行。對(duì)象可以是人。所述肽可以以0. l-500mg/kg/天施用,或更特別地,以10-100mg/kg/天施用。所述肽可以每日施用,例如施用7天、2周、3周、4周、I個(gè)月、6周、8周、2個(gè)月、12周或3個(gè)月。所述肽可以每周施用,例如施用2周、3周、4周、6周、8周、10周或12周。所述肽包含的可以全部是L氨基酸、全部是D氨基酸或者包含L和D氨基酸的混合物。在又一實(shí)施方案中,提供了藥物組合物,其包含⑴具有至少4個(gè)連續(xù)MUCl殘基但不多于20個(gè)連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆蓋;和(ii)除(i)外的第二抗炎劑。第二抗炎劑是類固醇或C0X-2抑制劑??紤]本文描述的任何方法或組合物都可參照本文描述的任何其他方法或組合物實(shí)施。當(dāng)在權(quán)利要求和/或說(shuō)明書(shū)中無(wú)數(shù)量詞與術(shù)語(yǔ)“包含”一起使用時(shí),可以表示“一”,但也具有“一或更多”、“至少一”和“一或多于一”的含義。詞“約”是指所示數(shù)值加或減5%。根據(jù)下述詳細(xì)說(shuō)明,本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。然而應(yīng)當(dāng)理解,指出本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述和具體實(shí)施例僅僅以說(shuō)明的方式給出,因?yàn)閷?duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,根據(jù)該詳細(xì)描述,在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修飾將變得顯而易見(jiàn)。
下述附圖構(gòu)成本發(fā)明說(shuō)明書(shū)的一部分,包括它們以進(jìn)一步闡明本發(fā)明的某些方面。參照一幅或多幅這些附圖并結(jié)合詳細(xì)說(shuō)明可以更好地理解本發(fā)明。圖IA-Dp65相關(guān)聯(lián)。(圖1A-C)所示細(xì)胞的裂解物用抗_p65或?qū)φ誌gG進(jìn)行免疫沉淀。沉淀物用抗-MUCl-C和抗-p65 進(jìn)行免疫印跡。(圖1D)將ZR-75-1細(xì)胞的裂解物用結(jié)合了谷胱甘肽珠的GST或GST-MUC1-CD孵育。吸附物用抗-p65進(jìn)行免疫印跡。通過(guò)考馬斯亮蘭染色評(píng)估引入物GST蛋白。圖2A-D =MUCl減弱I k B a和NF- k B p65的結(jié)合。(圖2A-C)用抗-p65或?qū)φ誌gG 對(duì)所示 ZR-75-1/ 載體、ZR-75-1/MUC1 siRNA(圖 2A)、Hela/ 載體、Hela/MUCl (圖 2B)、3Y1/載體和3Y1/MUC1-⑶(圖2C)細(xì)胞的胞漿裂解物進(jìn)行免疫沉淀。沉淀物用抗I k B a和抗P65的抗體進(jìn)行免疫印跡。(圖2D)在存在或不存在遞增量的MUCl-CD的情況下,將結(jié)合了谷胱甘肽珠的GST和GST-I KBa用p65 (186-306)孵育。吸附物用抗-p65進(jìn)行免疫印跡(上)。引入物(input) MUCl-CD通過(guò)用抗-MUCl-C進(jìn)行免疫印跡來(lái)評(píng)估(中)。引入物GST和GST-I KBa蛋白通過(guò)考馬斯亮蘭染色評(píng)估(下)。圖3么-0:1^(1-(促進(jìn),-1^ 65對(duì)此111基因啟動(dòng)子的占據(jù)。(圖3A)固定ZR-75-1/ 載體和 ZR-75-l/MUClsiRNA 細(xì)胞并用抗-MUCl-C (綠色)和抗-NF- k B p65 (紅色)雙染色。細(xì)胞核用T0-PR0-3染色。(圖3B和3C)將ZR-75-1/載體、ZR-75-1/MUC1siRNA (圖3B) ,HeLa/載體和HeLa/MUCl (圖3C)細(xì)胞的可溶性染色質(zhì)用抗p65或IgG對(duì)照進(jìn)行免疫沉淀。最終的DNA提取物用覆蓋Bcl-xL啟動(dòng)子NF- k B-RE (-597至-304)或?qū)φ諈^(qū)域(-1001至-760)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(圖3D)將ZR-75-1細(xì)胞的可溶性染色質(zhì)用抗MUCl-C或?qū)φ誌gG進(jìn)行免疫沉淀,并分析Bcl-xL NF- k B-RE或?qū)φ諈^(qū)域序列(左)。在Re-ChIP實(shí)驗(yàn)中,抗MUCl-C沉淀物被釋放,用抗p65再免疫沉淀,然后分析Bcl-xL啟動(dòng)子序列(右)。圖4A-D :在MCF-10A細(xì)胞對(duì)TNF a的應(yīng)答中MUC1-C與NF- k B p65相互作用。(圖4A)將MCF-10A細(xì)胞用20ng/ml TNFa刺激所示時(shí)間。將裂解物用抗MUCl-C和抗¢-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行免疫印跡。(圖4B)將未處理或用20ng/ml TNFa刺激24小時(shí)的MCF-10A細(xì)胞裂解物用抗P65或?qū)φ誌gG進(jìn)行免疫沉淀。沉淀物用所示抗體進(jìn)行免疫印跡。(圖4C)將未處理或用20ng/ml TNFa刺激24小時(shí)的MCF-10A細(xì)胞可溶染色質(zhì)用抗MUCl-C進(jìn)行免疫沉淀,然后分析MUCl NF-k B結(jié)合基序啟動(dòng)子序列。(圖4D)在Re-ChIP實(shí)驗(yàn)中,抗MUCl-C沉淀物被釋放,用抗P65再免疫沉淀,然后分析MUCl NF- K B結(jié)合基序啟動(dòng)子序列。圖5A-D :1^(1-(促進(jìn),-1^ p65 介導(dǎo)的 MUCl 啟動(dòng)子激活。(圖 5A 和 5B)MCF_10A細(xì)胞用對(duì)照或p65siRNA合并物轉(zhuǎn)染72小時(shí)。不處理轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或?qū)⑵溆肨NF a刺激24小時(shí)。將裂解物用所示抗體進(jìn)行免疫印跡(圖5A)。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞以表達(dá)NF-K B-Luc報(bào)告物或MUCl啟動(dòng)子-Luc報(bào)告物(pMUCl-Luc)和SV-40-Reni I Ia-Luc質(zhì)粒(作為對(duì)照)(圖5B)。(圖5C和5D)將MCF-10A細(xì)胞用對(duì)照或MUClsiRNA合并物轉(zhuǎn)染72小時(shí)。不處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞或?qū)⑵溆肨NFa刺激24小時(shí)。將裂解物用所示抗體進(jìn)行免疫印跡(圖5C)。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞以表達(dá) NF- K B-Luc 報(bào)告物或 MUCl 啟動(dòng)子-Luc 報(bào)告物(pMUCl-Luc)和 SV-40-Reni I Ia-Luc質(zhì)粒(作為對(duì)照)(圖OT)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)測(cè)量螢光素酶的活性。結(jié)果表示為與用對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的未處理細(xì)胞(值指定為I)所得相比的激活倍數(shù)(三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。圖6A-D MUCI/CQC肽阻斷MUCl和NF-k B p65之間的相互作用。(圖6A)具有聚-dArg轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的MUC1/CQC(G0-201)和MUCI/AQA (CP-1)肽的序列。在存在MUC1/CQC或MUC1/AQA的情況下,在室溫下將GST-MUCl-⑶用純化的NF- k B p65孵育I小時(shí)。將谷胱甘肽珠的吸附物用抗p65進(jìn)行免疫印跡(左)。不處理MCF-10A細(xì)胞,或者在存在5 u MMUCI/CQC或MUC1/AQA肽(每24小時(shí)添加)的情況下將其用TNF a刺激72小時(shí)。將抗p65沉淀物用所示抗體進(jìn)行免疫印跡(右)。(圖6B和6C)不處理MCF-10A細(xì)胞,或者在存在5uM MUCI/CQC或MUCI/AQA肽(每24小時(shí)添加)的情況下將其用TNF a刺激72小時(shí)。將可溶染色質(zhì)用抗MUCl-C(左)或抗p65(右)進(jìn)行沉淀,然后分析MUCl NF-K B結(jié)合基序啟動(dòng)子序列(圖6B)。將裂解物用所示抗體進(jìn)行免疫印跡(圖6C)。(圖6D)MUCl-C以自誘導(dǎo)調(diào)節(jié)回路通過(guò)IKK與p65的相互作用激活NF- K B通路的預(yù)計(jì)作用的模型。
圖7A-E =MUCl-C細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與NF- k B p65和p65RHD結(jié)合。(圖7A-B)將所示細(xì)胞的裂解物用抗P65或?qū)φ誌gG進(jìn)行免疫沉淀。將沉淀物用抗MUCl-C和抗p65進(jìn)行免疫印跡。(圖7C)將ZR-75-1細(xì)胞的裂解物用結(jié)合了谷胱甘肽珠的GST或GST-MUCl-⑶孵育。將吸附物用抗P65進(jìn)行免疫印跡。引入物GST蛋白通過(guò)考馬斯亮蘭染色評(píng)估。(圖7D-E)用純化的 p65 (1-180)(圖 7D)或 p65 (186-306)(圖 7E)孵育 GST、GST-MUCI-CD 和GST-I K Ba。吸附物和引入物用抗p65進(jìn)行免疫印跡。圖8 :ZR-75_1乳腺癌細(xì)胞中的MUCl沉默。使用BLOCK-iT靶點(diǎn)篩選系統(tǒng)(Invitrogen)產(chǎn)生小干擾 RNA (siRNA),其靶向 MUCl 序列(AAGITCAGTGCCCAGCTCTAC (SEQ IDNO 55))和對(duì)照序列(CGCTTACCGAITCAGAATGG (SEQ ID NO :56))。siRNA 盒用于產(chǎn)生所述慢病毒(Kawano等,2007)。在存在聚凝胺(Sigma)時(shí)以感染復(fù)數(shù)5用慢病毒感染ZR-75-1細(xì)胞。選擇表達(dá)EGFP的細(xì)胞克隆。裂解物用所示抗體進(jìn)行免疫印跡。圖9A-D =MUCl-C 直接與 STAT3DBD 結(jié)合。(圖 9A)將 ZR-75-1 (左)和 MCF-7 (右)細(xì)胞的裂解物用抗STAT3或?qū)φ誌gG進(jìn)行免疫沉淀。將沉淀物用所示抗體進(jìn)行免疫印跡。(圖9B)將ZR-75-1細(xì)胞的裂解物用結(jié)合了谷胱甘肽珠的GST和GST-MUCl-⑶孵育。將吸附物用抗STAT3進(jìn)行免疫印跡。引入物GST和GST-MUCl-⑶蛋白通過(guò)考馬斯亮蘭染色評(píng)估。(圖9C)顯示MUCl細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列,指示了磷酸化和結(jié)合位點(diǎn)。用純化的重組STAT3孵育結(jié)合了谷胱甘肽珠的GST、GST-MUCl-CD、GST-MUCI-CD (1-45)和GST-MUC1-CD(46-72)。將吸附物用抗-STAT3進(jìn)行免疫印跡。引入物GST和GST-MUC1-CD融合蛋白質(zhì)通過(guò)考馬斯亮蘭染色評(píng)估。(圖9D)STAT3的結(jié)構(gòu)。用純化的MUCl-⑶孵育結(jié)合了谷胱甘肽珠的GST、GST-STAT3(全長(zhǎng);1-770位氨基酸)、GST-MUCl-CD (N端;1-257位氨基酸)、GST-MUC1-CD (DBD ;257_514 位氨基酸)和 GST-MUCl-CD (C 端;514_770 位氨基酸)。將吸附物用抗MUCl-C進(jìn)行免疫印跡。引入物GST和GST-STAT3融合蛋白通過(guò)考馬斯亮蘭染色評(píng)估。圖10A-D =MUCl-C與STAT3轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相關(guān)聯(lián)。(圖10A-B)表示STAT結(jié)合位點(diǎn)(SBS)位置的MUCl啟動(dòng)子區(qū)域略圖。將ZR-75-l(圖10A)和MCF-7 (圖10B)細(xì)胞的可溶染色質(zhì)用抗STAT3 (左)和抗MUCl-C (右)進(jìn)行免疫沉淀。最終的DNA提取物用覆蓋MUCl 啟動(dòng)子STAT結(jié)合位點(diǎn)(SBS ;-689至-414)和對(duì)照區(qū)域(CR ;+4524至+4745)的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(圖10C-D)將所示細(xì)胞的可溶染色質(zhì)用抗STAT3沉淀,并分析MUCl啟動(dòng)子SBS和CR序列。在re-ChIP實(shí)驗(yàn)中,抗STAT3沉淀物被釋放,用抗MUCl-C再免疫沉淀,然后分析MUCl啟動(dòng)子序列。圖IlA-D :在MCF-10A細(xì)胞對(duì)IL-6的應(yīng)答中MUC1-C與STAT3相互作用。(圖11A)將MCF-10A細(xì)胞用IL-6刺激所示時(shí)間。將全細(xì)胞裂解物(左)和核裂解物(右)用所示抗體進(jìn)行免疫印跡。(圖11B)用IL-6刺激MCF-10A細(xì)胞24小時(shí)。將裂解物用抗STAT3或?qū)φ誌gG進(jìn)行免疫沉淀。將沉淀物用 所示抗體進(jìn)行免疫印跡。(圖11C)將被IL-6刺激所示時(shí)間的MCF-10A細(xì)胞的可溶染色質(zhì)用抗STAT3或?qū)φ誌gG進(jìn)行沉淀。分析沉淀物的MUCl啟動(dòng)子SBS和CR序列。(圖11D)將對(duì)照和IL-6刺激的MCF-10A細(xì)胞的可溶染色質(zhì)用抗STAT3沉淀,并分析MUCl啟動(dòng)子SBS和CR序列。在re_ChIP實(shí)驗(yàn)中,釋放抗STAT3沉淀物,用抗MUCl-C再免疫沉淀,然后分析MUCl啟動(dòng)子序列。圖12A-D IL-6對(duì)MUCl啟動(dòng)子的激活由STAT3介導(dǎo)。(圖12A和B)MCF_10A細(xì)胞用對(duì)照或STAT3 siRNA合并物轉(zhuǎn)染72小時(shí)。然后不處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞或?qū)⑵溆肐L-6刺激24小時(shí)。裂解物用所示抗體進(jìn)行免疫印跡(圖12A)。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞以表達(dá)MUCl啟動(dòng)子-Luc報(bào)告物(pMUCl-Luc)和Renilla-Luc質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)測(cè)量螢光素酶的活性(圖12B)。結(jié)果表示為與用對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的未處理細(xì)胞(值指定為I)所得相比的激活倍數(shù)(三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。(圖12C)轉(zhuǎn)染MCF-10A以表達(dá)野生型或在STAT結(jié)合位點(diǎn)突變(mSBS)的pMUCl-Luc以及ReniIIa-Luc。24小時(shí)后,不處理細(xì)胞或用IL-6刺激24小時(shí),然后測(cè)定螢光素酶活性。結(jié)果表示為與用野生型pMUCl-Luc轉(zhuǎn)染的未處理細(xì)胞(值指定為I)所得相比的激活倍數(shù)(三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。(圖12D)用對(duì)照或STAT3siRNA處理MCF-10A。24小時(shí)后,不處理細(xì)胞或?qū)⑵溆肐L-6刺激24小時(shí),然后分析螢光素酶活性。結(jié)果表示為與用對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的未處理細(xì)胞(值指定為I)所得相比的激活倍數(shù)(三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。圖13A-D =MUCl-C促進(jìn)STAT3占據(jù)MUCl啟動(dòng)子。(圖13A和B)MCF_10A細(xì)胞用對(duì)照或MUClsiRNA合并物轉(zhuǎn)染72小時(shí)。然后不處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞或?qū)⑵溆肐L-6刺激24小時(shí)。用抗STAT3沉淀可溶染色質(zhì),并分析MUCl啟動(dòng)子SBS和CR序列(圖13A)。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞以表達(dá)MUCl啟動(dòng)子-Luc報(bào)告物(pMUCl-Luc)和Renilla-Luc質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)測(cè)量螢光素酶的活性(圖13B)。結(jié)果表示為與用對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的未處理細(xì)胞(值指定為I)所得相比的激活倍數(shù)(三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。(圖13C)用抗STAT3沉淀ZR-75-1/載體和ZR-75-1/MUC1 siRNA細(xì)胞的可溶染色質(zhì),并分析MUCl啟動(dòng)子SBS和CR序列。(圖13D)轉(zhuǎn)染 ZR-75-1/ 載體和 ZR-75-1/MUC1 siRNA 細(xì)胞以表達(dá) pMUCl-Luc 和 Reni I Ia-Luc。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)測(cè)量螢光素酶的活性。結(jié)果表示為與ZR-75-1/MUC1 siRNA細(xì)胞(值指定為I)所得相比的激活倍數(shù)(三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。圖14A-D :在IL-6刺激的MCF-10A細(xì)胞中G0-201阻斷MUC1-C和STAT3之間的相互作用。(圖14A)在室溫中在G0-201或CP-I的存在下與純化的MUCl-CD孵育GST-STAT31小時(shí)。谷胱甘肽珠的吸附物用抗MUCl-C進(jìn)行免疫印跡(圖14B-C)。在5mM G0-201或CP-I (每24小時(shí)添加)的存在下用IL-6刺激MCF-10A細(xì)胞72小時(shí)??筍TAT3沉淀物用所示抗體進(jìn)行免疫印跡(圖14B)。用抗STAT3或抗MUCl-C沉淀可溶性染色質(zhì),并分析MUCl啟動(dòng)子 SBS 和 CR 序列(圖 14C)。(圖 14D)pMUCl-Luc。
圖15 :MUC1_CD 吻合妝(Stapled Peptide)的序列。圖16A :MUC1-⑶吻合肽對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1650生長(zhǎng)的作用。為評(píng)價(jià)對(duì)MUCl功能抑制的敏感性,用I和5iiM MUCl CQC吻合肽(G0-200-1B)處理H1650NSCLC細(xì)胞7天。用5 ii M G0-200-1B處理H1650細(xì)胞與生長(zhǎng)的顯著抑制和細(xì)胞數(shù)降低相關(guān)。圖16B G0-200-2B對(duì)細(xì)胞增殖的作用。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H-1975培養(yǎng)在含有10%熱失活胎牛血清、100單位/mL青霉素、100 u g/ml鏈霉素和2mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM。細(xì)胞在處理前一天重新接種。用5iiM G0-200-2B處理細(xì)胞3天,細(xì)胞活力由臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)定。圖17 :不同MUCl-⑶CQC區(qū)域肽對(duì)激素依賴性乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。為確定暴露于包含不同MUCl-⑶CQC區(qū)域的肽是否影響生長(zhǎng),用5iiM不同的肽處理ZR-75-1乳腺癌細(xì)胞4天并監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖。顯著地,與未處理的細(xì)胞相比有極大的生長(zhǎng)抑制。圖18 :不同MUCl-CD CQC區(qū)域肽對(duì)非小細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。用5 y M G0-203、G0-203-2或G0-203cyc處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A5497天。第7天的活細(xì)胞數(shù)通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)定,通過(guò)比較未處理細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)計(jì)算生長(zhǎng)抑制百分比。圖19 :不同MUCl-⑶CQC區(qū)域肽對(duì)非小細(xì)胞癌細(xì)胞H1975生長(zhǎng)的作用。用5yM不同的MUCl-⑶CQC區(qū)域肽處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H19756天。第6天的活細(xì)胞數(shù)通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)定。結(jié)果證明,用5 u M不同肽處理H1975細(xì)胞與顯著的生長(zhǎng)抑制相關(guān)。圖20 :不同MUCl-⑶CQC區(qū)域肽對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。用5 ii M不同的MUCl-CD CQC區(qū)域肽處理三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-2316天。第6天的活細(xì)胞數(shù)通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法確定。結(jié)果證明,用不同肽處理MDA-MB-231細(xì)胞與顯著的生長(zhǎng)抑制相關(guān)。圖21 :更短的G0-203肽對(duì)ZR-75-1乳腺癌細(xì)胞增殖的作用。將人ZR-75-1乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充了 10%熱失活胎牛血清、100單位/mL青霉素、100 u g/ml鏈霉素的RPMI1640中。每天用5 ii M的不同肽處理細(xì)胞4天,細(xì)胞活力通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法確定。與G0-210相比,每天用 5iiMG0-203(SEQ ID NO :53)、G0_207 (SEQ ID NO :4)、G0_208 (SEQ ID NO :50)和G0-209 (SEQ ID NO :54)處理ZR-75-1乳腺癌細(xì)胞4天與顯著的生長(zhǎng)抑制相關(guān)。說(shuō)明性實(shí)施方案的描述本發(fā)明人和其他人已對(duì)MUCl在癌癥中的作用進(jìn)行了廣泛研究。如上所述,人MUCl是異源二聚體糖蛋白,其作為單一多肽翻譯,并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被切割成N端和C端亞基(Ligtenberg 等,1992 ;Macao 等,2006 ;Levitin 等,2005)。MUCl 的異常過(guò)表達(dá)在大多數(shù)人癌中被發(fā)現(xiàn)(Kufe等,1984),其賦予非錨定依賴性生長(zhǎng)和致瘤性(Li等,2003a ;Huang等,2003 ;Schroeder等,2004 ;Huang等,2005)。其他研究已證明MUCl的過(guò)表達(dá)賦予對(duì)氧化應(yīng)激和基因毒性抗癌劑所誘導(dǎo)凋亡的抗性(Yin和Kufe,2003 ;Ren等,2004 ;Raina等,2004 ;Yin 等,2004 ;Raina 等,2006 ;Yin 等,2007)。栓系(tethered)和分泌的粘蛋白家族的作用是在上皮細(xì)胞表面提供保護(hù)性屏障。在上皮層有損壞時(shí),鄰近細(xì)胞間的緊密連接被破壞,由于細(xì)胞開(kāi)始heregulin誘導(dǎo)的修復(fù)程序而喪失極性(Vermeer等2003)。MUCl-N從細(xì)胞表面脫落(Abe和Kufe, 1989),剩余 MUCl-C的作用是作為將環(huán)境壓力信號(hào)傳至細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)物。對(duì)此,MUCl-C與ErbB受體家族成員形成細(xì)胞表面復(fù)合物,而且MUCl-C應(yīng)答于heregulin刺激而靶向核(Li等,2001 ;Li等,2003c) JUCl-C還通過(guò)MUCl細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(⑶)與聯(lián)蛋白家族成員的直接相互作用從而將ErbB受體和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路整合來(lái)發(fā)揮作用(Huang等,2005 ;Li等,2003c ;Yamamoto等,1997 ;Li等,1998 ;Li等,2001 ;Li和Kufe, 2001)。其他研究已證明,MUCl-CD被糖原合酶激酶3 0、^1^、蛋白激酶〇8和c-Abl磷酸化(Raina等,2006 ;Li等,1998 ;Li等,2001 ;Ren 等,2002)。負(fù)責(zé)MUCl-C核靶向的機(jī)制未知。包含典型核定位信號(hào)(NLS)的蛋白質(zhì)通過(guò)首先結(jié)合至輸入蛋白a (importin a ),然后結(jié)合至輸入蛋白0而輸入核(Weis, 2003)。乘載物(cargo)-輸入蛋白a/0復(fù)合物通過(guò)與核孔蛋白結(jié)合而??吭诤丝祝⑶彝ㄟ^(guò)依賴于RanGTPase的機(jī)制轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)核孔。典型的NLS是單組分(monopartite)的,其帶有4_5個(gè)堿性氨基酸的單一簇;或者是雙組分(bipartite)的,帶有由10-12個(gè)氨基酸的接頭分隔開(kāi)的兩簇堿性氨基酸。MUCl-⑶包含并不符合單組分NLS原型的RRK基序(Hodel等,2002)。然而,包含非典型NLS的某些蛋白質(zhì)通過(guò)直接結(jié)合至輸入 蛋白P轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)核孔(Kau等,2004)。輸入蛋白P與一些核孔蛋白相關(guān)聯(lián)(Ryan和Wente, 2000),所述核孔蛋白包括Nup62,其位于核孔復(fù)合物的細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)兩面(Percipalle等,1997)。其他研究已表明,¢-聯(lián)蛋白通過(guò)不依賴于輸入蛋白和核孔蛋白的機(jī)制輸入核中(Suh和Gumbiner, 2003)。2006年,本發(fā)明人報(bào)道MUCl通過(guò)涉及與Nup62結(jié)合的機(jī)制輸入核(Leng等,
2007)。他們也證明MUCl通過(guò)MUCl細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的CQC基序形成寡聚體,而且MUCl寡聚化是核輸入所必需的。2007年,他們還證明MUCl在人癌細(xì)胞內(nèi)的過(guò)表達(dá)與NF-k B p65的組成型激活相關(guān)(Ahmad等,2007)。已表明MUCl在體內(nèi)與高分子量I k B激酶(IKK)復(fù)合物相互作用,而且MUCl細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與IKKP和IKKy直接結(jié)合。MUCl與IKK3和IKKy 二者的相互作用對(duì)IKKP激活是必需的,其導(dǎo)致IKBa的磷酸化和降解。這些發(fā)現(xiàn)表明,MUCl對(duì)IKKP的生理激活是重要的,而且如在人癌癥中所發(fā)現(xiàn)的,MUCl過(guò)表達(dá)賦予IKK P -NF- K B p65通路的持續(xù)誘導(dǎo)。在另外的未發(fā)表工作中,本發(fā)明人已將其研究擴(kuò)展至進(jìn)一步闡明CQC基序在寡聚體形成中的作用。他們還證明對(duì)應(yīng)于這一區(qū)域的短肽能夠以干擾MUCl寡聚體形成,阻止其轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞核中。這些肽能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),而且誘導(dǎo)這些細(xì)胞的凋亡甚至腫瘤組織的壞死。考慮到MUCl在炎癥疾病狀態(tài)中的新作用,本發(fā)明人試圖研究這些肽是否能用于治療炎癥疾病。目前的研究證明,MUCl-⑶與NF-K B p65直接結(jié)合并阻斷NF-K B p65和IkBq之間的相互作用。本發(fā)明人現(xiàn)在證明,MUCl-C亞基與NF-k B靶基因啟動(dòng)子上的NF-kB p65相關(guān)聯(lián),并促進(jìn)NF-k B介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果還證明MUCl-C寡聚化抑制劑阻斷MUCl與NF- K B p65的相互作用并且阻斷炎性NF- k B通路的組成型激活。此外,已證明與STAT3(另一個(gè)炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子)的類似相互作用,MUCl對(duì)該過(guò)程的參與甚至更多。 下面更詳細(xì)地描述本發(fā)明的這些和另一些方面。I. MUClA.結(jié)構(gòu)MUCl是粘蛋白型糖蛋白,其表達(dá)于正常分泌性上皮細(xì)胞的頂邊界(Kufe等,1984)。MUCl作為單一肽合成并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中將前體切割成兩個(gè)亞基,之后形成異源二聚體(Ligtenberg等,1992)。切割可通過(guò)自催化過(guò)程介導(dǎo)(Levitan等,2005)。大于250kDa的MUClN端(MUClN-ter,MUCI-N)亞基包含數(shù)量可變的20個(gè)氨基酸的串聯(lián)重復(fù),其因高度保守變化而不完全并且被O-連接聚糖修飾(Gendler等,1988 ;Siddiqui等,1988)。MUCl-N通過(guò)與約23kDa的C端亞基(MUClC-ter,MUCl-C) 二聚化而栓系于細(xì)胞表面,所述C端亞基包含58個(gè)氨基酸的胞外區(qū)、28個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)和72個(gè)氨基酸的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CD ;SEQID NO: I) (Merlo等,1989)。人MUCl序列在以下顯示GSVVVQLTLA FREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGffG I ALLVLVCVLVALA I VYL I ALAV COCRRKNYGOLPIFPAR
DTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAA TSANL (SEQID NO 2)加粗序列表示⑶,下劃線部分是寡聚化抑制肽(SEQ ID NO :3)。隨著正常上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞,MUCl在胞質(zhì)內(nèi)和整個(gè)細(xì)胞膜上異常過(guò)表達(dá)(Kufe等,1984 ;Perey等,1992)。與細(xì)胞膜結(jié)合的MUCl通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用靶向內(nèi)涵體(Kinlough等,2004)。另夕卜,MUCl-C 而不是 MUCl-N 靶向核(Baldus 等,2004 ;Huang 等,2003 ;Li 等,2003a ;Li 等,2003b ;Li 等,2003c ;ffei 等,2005 ;ffen 等,2003)和線粒體(Ren 等,2004)。B.功能MUCl 與 ErbB 受體家族成員(Li 等,2001b ;Li 等,2003c ;Schroeder 等,2001)以及Wnt效應(yīng)子、¢-聯(lián)蛋白(Yamamoto等,1997)相互作用。表皮生長(zhǎng)因子受體和c_Src將MUCl細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(MUCl-CD)的Y-46磷酸化,從而增加MUCl和P -聯(lián)蛋白的結(jié)合(Li等,2001a ;Li等,2001b)。MUCl和P -聯(lián)蛋白的結(jié)合也被糖原合酶激酶3 P和蛋白激酶C S調(diào)節(jié)(Li等,1998 ;Ren等,2002)。MUCl與3 -聯(lián)蛋白共定位于核內(nèi)(Baldus等,2004 ;Li等,2003a ;Li等,2003c ;Wen等,2003),并共同激活Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄(Huang等,2003)。其他研究顯示MUCl還與p53直接結(jié)合并調(diào)節(jié)p53靶基因的轉(zhuǎn)錄(Wei等,2005)。值得注意的是,MUCl過(guò)表達(dá)足以誘導(dǎo)非錨定依賴性生長(zhǎng)和致瘤性(Huang等,2003 ;Li等,2003b ;Ren等,2002 ; Schroeder 等,2004)。大多數(shù)線粒體蛋白質(zhì)在核內(nèi)編碼,并且通過(guò)線粒體外膜和內(nèi)膜中的易位復(fù)合物輸入線粒體內(nèi)。某些線粒體蛋白質(zhì)包含N端線粒體革巴向序列,并且與線粒體外膜中的Tom20相互作用(Truscott等,2003)。其他線粒體蛋白質(zhì)包含內(nèi)部革巴向序列,并且與Tom70受體相互作用(Truscott等,2003)。近期工作顯示,無(wú)內(nèi)部革巴向序列的線粒體蛋白質(zhì)通過(guò)HSP70與HSP90的復(fù)合物遞送至Tom70 (Young等,2003)。II. MUCl 肽A.結(jié)構(gòu)本發(fā)明考慮設(shè)計(jì)、生產(chǎn)及使用多種MUCl肽。這些肽的結(jié)構(gòu)特征如下。首先,所述肽具有不多于20個(gè)的連續(xù)MUCl殘基。因此,術(shù)語(yǔ)“具有不多于20個(gè)的連續(xù)殘基的肽”(甚至包含術(shù)語(yǔ)“包含”時(shí))不應(yīng)被理解為包含更多數(shù)量的連續(xù)MUCl殘基。其次,所述肽包含CQC基序,而且還可包含CQCR、CQCRR或CQCRRK基序。因此,所述肽具有(至少)MUC1_C結(jié)構(gòu)域的這4、5或6個(gè)連續(xù)殘基。第三,所述肽有至少I個(gè)氨基酸殘基與CQCRRK基序第一個(gè)C殘基的NH2端一側(cè)連接,使得所述第一個(gè)C殘基被與其連接的至少一個(gè)氨基酸所“覆蓋”。該殘基可以是MUCl中天然存在的(即來(lái)自跨膜結(jié)構(gòu)域),可以隨機(jī)選擇(選自20個(gè)天然氨基酸或其類似物中的任一個(gè)),或者可以是另一肽序列的一部分(例如,用于純化的標(biāo)簽序列、穩(wěn)定化序列或細(xì)胞遞送結(jié)構(gòu)域)。
通常,所述肽為50個(gè)殘基或更少,并且包含不多于20個(gè)的連續(xù)MUCl殘基。全長(zhǎng)可以是 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 個(gè)殘基??紤]的肽長(zhǎng)度范圍是4-50個(gè)殘基、7-50個(gè)殘基、4-25個(gè)殘基、7_25個(gè)殘基、4_20個(gè)殘基、7_20個(gè)殘基、3-15個(gè)殘基和7-15個(gè)殘基。連續(xù)MUCl殘基數(shù)可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。考慮的連續(xù)殘基范圍是4-20個(gè)殘基、5-20個(gè)殘基、6-20個(gè)殘基、7-20個(gè)殘基、4-15個(gè)殘基、5-15個(gè)殘基、6-15個(gè)殘基和7_15個(gè)殘基。本發(fā)明可以使用L-構(gòu)型氨基酸、D-構(gòu)型氨基酸或其混合物。盡管L氨基酸占蛋白質(zhì)中所發(fā)現(xiàn)氨基酸的絕大多數(shù),但D-氨基酸在異域海生生物(例如海蝸牛)產(chǎn)生的一些
蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。它們也是細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的主要組分。D-絲氨酸可在腦中起神經(jīng)遞質(zhì)的作用。氨基酸構(gòu)型的L和D規(guī)則不涉及氨基酸本身的光學(xué)活性,而是涉及理論上可合成氨基酸的甘油醛異構(gòu)體的光學(xué)活性(D-甘油醛是右旋的,L-甘油醛是左旋的)?!叭獶”肽的一種形式是逆反(retro-inverso)肽。天然多肽的逆反修飾涉及這樣的氨基酸的合成組裝,即其具有與相應(yīng)L-氨基酸立體化學(xué)相反的a -碳,即D-氨基酸相對(duì)于天然肽序列順序相反。因此逆反類似物具有顛倒的末端和顛倒的肽鍵方向(NH-C0而不是C0-NH),而大概維持了與天然肽序列相同的側(cè)鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。見(jiàn)美國(guó)專利6,261,569,其通過(guò)引用并入本文。如上所述,本發(fā)明考慮融合或綴合細(xì)胞遞送結(jié)構(gòu)域(也稱為細(xì)胞遞送載體,或細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)。該結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域公知的,而且通常以短的兩性或陽(yáng)離子肽和肽衍生物為特征,通常包含多個(gè)賴氨酸和精氨酸殘基(Fischer,2007)。特別感興趣的是聚D-Arg和聚D-Lys序列(例如,右旋殘基,長(zhǎng)8個(gè)殘基)。表I
權(quán)利要求
1.在表達(dá)MUCl的細(xì)胞中抑制炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法,其包括將所述細(xì)胞與具有至少4個(gè)連續(xù)MUCl殘基但不多于20個(gè)連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆蓋。
2.權(quán)利要求I的方法,其中所述肽包含至少5、6或7個(gè)連續(xù)MUCl殘基。
3.權(quán)利要求2的方法,其中所述序列包含CQCR、CQCRR、CQCRRR、CQCRRRR、CQCRRK或CQCRRKN。
4.權(quán)利要求I的方法,其中所述肽包含MUCl的不多于10個(gè)連續(xù)殘基、11個(gè)連續(xù)殘基、12個(gè)連續(xù)殘基、13個(gè)連續(xù)殘基、14個(gè)連續(xù)殘基、15個(gè)連續(xù)殘基、16個(gè)連續(xù)殘基、17個(gè)連續(xù)殘基、18個(gè)連續(xù)殘基或19個(gè)連續(xù)殘基。
5.權(quán)利要求I的方法,其中所述MUCl陽(yáng)性細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或炎性細(xì)胞。
6.權(quán)利要求5的方法,其中所述炎性細(xì)胞是巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、骨髓源性抑制細(xì)胞、NK細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞。
7.權(quán)利要求I的方法,其中所述肽與細(xì)胞遞送結(jié)構(gòu)域融合。
8.權(quán)利要求7的方法,其中所述細(xì)胞遞送結(jié)構(gòu)域是聚D-R、聚D-P或聚D-K。
9.權(quán)利要求I的方法,其還包括將所述細(xì)胞與第二抗炎劑接觸。
10.權(quán)利要求9的方法,其中所述第二抗炎劑是類固醇或COX-2抑制劑。
11.權(quán)利要求9的方法,其中在所述肽之前接觸所述第二抗炎劑。
12.權(quán)利要求9的方法,其中在所述肽之后接觸所述第二抗炎劑。
13.權(quán)利要求9的方法,其中與所述肽同時(shí)地接觸所述第二抗炎劑。
14.權(quán)利要求I的方法,其中所述肽包含的全部是L氨基酸。
15.權(quán)利要求I的方法,其中所述肽包含的全部是D氨基酸。
16.權(quán)利要求I的方法,其中所述肽包含L和D氨基酸的混合物。
17.權(quán)利要求I的方法,其中所述炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括NF-K B介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或STAT介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
18.權(quán)利要求17的方法,其中NF-kB介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括NF-k B激活選自Bcl-xL和MUCl的靶基因。
19.權(quán)利要求17的方法,其中STAT介導(dǎo)的炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括STAT3激活。
20.權(quán)利要求19的方法,其中STAT3介導(dǎo)的炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)包括STAT3激活選自細(xì)胞周期蛋白 01、生存素、1(1 1、1(1 2、0(11011(、1^代71、]^81六681、2邙57、2邙3611、5113匕?1、(。11(13和MUCl的靶基因。
21.在表達(dá)MUCl的細(xì)胞中抑制MUCl與NF-kB或STAT結(jié)合的方法,其包括將所述細(xì)胞與具有至少4個(gè)連續(xù)MUCl殘基但不多于20個(gè)連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆蓋。
22.在表達(dá)MUCl的細(xì)胞中抑制MUCl與IK B a競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NF- k B的方法,其包括將所述細(xì)胞與具有至少4個(gè)連續(xù)MUCl殘基但不多于20個(gè)連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆蓋。
23.在表達(dá)MUCl的細(xì)胞中抑制MUCl誘導(dǎo)的NF-k B核轉(zhuǎn)位的方法,其包括將所述細(xì)胞與具有至少4個(gè)連續(xù)MUCl殘基但不多于20個(gè)連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽相接觸,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆蓋。
24.抑制對(duì)象中的炎性應(yīng)答的方法,其包括向所述對(duì)象施用具有至少4個(gè)連續(xù)MUCl殘基但不多于20個(gè)連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC (SEQ ID NO 4)的MUCl肽,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆至Jhl o
25.權(quán)利要求24的方法,其中所述肽包含至少5、6或7個(gè)連續(xù)MUCl殘基。
26.權(quán)利要求25的方法,其中所述序列包含CQCR、CQCRR、CQCRRR、CQCRRRR、CQCRRK或CQCRRKN。
27.權(quán)利要求24的方法,其中所述肽包含MUCl的不多于10個(gè)連續(xù)殘基、11個(gè)連續(xù)殘基、12個(gè)連續(xù)殘基、13個(gè)連續(xù)殘基、14個(gè)連續(xù)殘基、15個(gè)連續(xù)殘基、16個(gè)連續(xù)殘基、17個(gè)連續(xù)殘基、18個(gè)連續(xù)殘基或19個(gè)連續(xù)殘基。
28.權(quán)利要求24的方法,其中所述炎性應(yīng)答是由NF-kB介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或STAT介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起。
29.權(quán)利要求21的方法,其中所述肽與細(xì)胞遞送結(jié)構(gòu)域融合。
30.權(quán)利要求29的方法,其中所述細(xì)胞遞送結(jié)構(gòu)域是聚D-R、聚D-P或聚D-K。
31.權(quán)利要求24的方法,其中施用包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、口服、瘤內(nèi)、皮下、表面或腹腔內(nèi)施用。
32.權(quán)利要求24的方法,其中施用包括局部、區(qū)域、全身或持續(xù)施用。
33.權(quán)利要求24的方法,其中抑制包括抑制或解除所述炎性應(yīng)答。
34.權(quán)利要求24的方法,其還包括對(duì)所述對(duì)象施用第二抗炎治療。
35.權(quán)利要求34的方法,其中所述第二抗炎治療是類固醇或COX2抑制劑。
36.權(quán)利要求34的方法,其中所述第二抗炎治療在所述肽之前施用。
37.權(quán)利要求34的方法,其中所述第二抗炎治療在所述肽之后施用。
38.權(quán)利要求34的方法,其中所述第二抗炎治療與所述肽同時(shí)施用。
39.權(quán)利要求24的方法,其中所述對(duì)象是人。
40.權(quán)利要求24的方法,其中所述肽以0.l-500mg/kg/天施用。
41.權(quán)利要求24的方法,其中所述肽以10-100mg/kg/天施用。
42.權(quán)利要求24的方法,其中所述肽每日施用。
43.權(quán)利要求42的方法,其中所述肽每日施用,持續(xù)7天、2周、3周、4周、I個(gè)月、6周、8周、2個(gè)月、12周或3個(gè)月。
44.權(quán)利要求24的方法,其中所述肽每周施用。
45.權(quán)利要求44的方法,其中所述肽每周施用,持續(xù)2周、3周、4周、6周、8周、10周或12周。
46.權(quán)利要求24的方法,其中所述肽包含的全部是L氨基酸。
47.權(quán)利要求24的方法,其中所述肽包含的全部是D氨基酸。
48.權(quán)利要求24的方法,其中所述肽包含L和D氨基酸的混合物。
49.藥物組合物,其包含(i)具有至少4個(gè)連續(xù)MUCl殘基但不多于20個(gè)連續(xù)MUCl殘基而且包含序列CQC的MUCl肽,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆蓋;和(ii)除(i)外的第二抗炎劑。
50.權(quán)利要求49的組合物,其中第二抗炎劑是類固醇或COX-2抑制劑。
51.MUCl肽,其具有至少7個(gè)并且不多于20個(gè)的殘基,具有3-20個(gè)連續(xù)MUCl殘基,并且包含序列CQC,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆蓋,而且其中所述肽還包含與第一氨基酸側(cè)鏈連接的第一連接部分和與第二氨基酸側(cè)鏈連接的第二連接部分,所述第一和第二連接部分(a)相互結(jié)合而且(b)由介于其間的三個(gè)氨基酸殘基分隔開(kāi)。
52.權(quán)利要求51的肽,其中所述肽長(zhǎng)8-20個(gè)殘基、長(zhǎng)8-17個(gè)殘基、長(zhǎng)9-17個(gè)殘基、長(zhǎng)10-17個(gè)殘基、長(zhǎng)10-16個(gè)殘基或長(zhǎng)10-15個(gè)殘基。
53.權(quán)利要求51的肽,其中所述肽長(zhǎng)8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)殘基。
54.權(quán)利要求51的肽,其中所述連續(xù)願(yuàn)(1殘基數(shù)是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15.16或 17。
55.權(quán)利要求51的肽,其還包含與第三氨基酸側(cè)鏈連接的第三連接部分,所述第二和第三連接部分相互結(jié)合,而且所述第二和第三氨基側(cè)鏈由介于其間的三個(gè)氨基酸殘基分隔開(kāi),并且所述肽長(zhǎng)至少10個(gè)殘基。
56.權(quán)利要求51 的肽,其中所述肽包含 AIVYLALACQCRRKNYG、IVYLALACQCRRKNYGQ、VYLALACQCRRKNYGQL 或 YLALACQCRRKNYGQLD。
57.權(quán)利要求51的肽,其中第一和第二氨基側(cè)鏈分別位于Y4和A8。
58.權(quán)利要求55的肽,其中第一和第二氨基側(cè)鏈分別位于A8和R12。
59.權(quán)利要求55 的肽,其中所述肽包含 AIVYLALACQCRRKNYG、IVYLALACQCRRKNYGQ、VYLALACQCRRKNYGQL 或 YLALACQCRRKNYGQLD。
60.權(quán)利要求59的肽,其中第一、第二和第三氨基酸側(cè)鏈分別位于Y4、A8和R12。
61.MUCl肽,其具有至少10個(gè)并且不多于20個(gè)殘基,具有3-20個(gè)連續(xù)MUCl殘基,并且包含序列CQC,其中CQC的氨基端半胱氨酸的NH2端被不一定對(duì)應(yīng)于天然MUC-I跨膜序列的至少一個(gè)氨基酸殘基所覆蓋,而且其中所述肽還包含與第一氨基酸側(cè)鏈連接的第一連接部分和與第二氨基酸側(cè)鏈連接的第二連接部分,所述第一和第二連接部分(a)相互結(jié)合而且(b)由介于其間的七個(gè)氨基酸殘基分隔開(kāi)。
62.權(quán)利要求61的肽,其中所述肽長(zhǎng)11-20個(gè)殘基、長(zhǎng)11-19個(gè)殘基、長(zhǎng)11-18個(gè)殘基、長(zhǎng)12-18個(gè)殘基、長(zhǎng)12-19個(gè)殘基或長(zhǎng)12-18個(gè)殘基。
63.權(quán)利要求61的肽,其中所述肽長(zhǎng)10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)殘基。
64.權(quán)利要求61的肽,其中所述連續(xù)願(yuàn)(1殘基數(shù)是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15.16或 17。
65.權(quán)利要求61的肽,其還包含與第三氨基酸側(cè)鏈連接的第三連接部分,所述第二和第三連接部分相互結(jié)合,并且所述第二和第三氨基側(cè)鏈由介于其間的七個(gè)氨基酸殘基分隔開(kāi),所述肽長(zhǎng)至少18個(gè)殘基。
66.權(quán)利要求61 的肽,其中所述肽包含 AIVYLALACQCRRKNYGQ、!VYLALACQCRRKNYGQL 或VYLALACQCRRKNYGQLD。
67.權(quán)利要求67的肽,其中第一和第二氨基側(cè)鏈分別位于I2和Q1(l。
68.權(quán)利要求67的肽,其中第一和第二氨基側(cè)鏈分別位于A8和Y16。
69.權(quán)利要求65的肽,其中所述肽包含AIVYLALACQCRRKNYGQLD。
70.權(quán)利要求69的肽,其中第一、第二和第三氨基酸側(cè)鏈分別位于Y2、R12和D2(i。
全文摘要
本發(fā)明提供了來(lái)自MUC1細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的肽以及使用其的方法。這些肽可以抑制MUC1寡聚化、抑制MUC1與NF-κB或STAT的相互作用,并且阻斷由NF-κB或STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所介導(dǎo)的炎性應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61K38/09GK102665748SQ201080033096
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2010年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者唐納德·W·庫(kù)弗, 蘇倫德·克哈班達(dá) 申請(qǐng)人:屬腫瘤有限責(zé)任公司, 達(dá)娜-法勃腫瘤研究所公司