專利名稱：一種促神經(jīng)修復(fù)材料及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促神經(jīng)修復(fù)的材料，屬于生物材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，理想的組織/器官修復(fù)是形成構(gòu)造的完整性，S卩外型的修復(fù)，并且能夠修復(fù)組織/器官的功能，形成功能上的整合修復(fù)，包括血管重建，神經(jīng)重建等。小腸黏膜下層(small intestinal submucosa, SIS)是一種天然的細(xì)胞外基質(zhì)類生物材料，通常由豬小腸制備。SIS主要含有膠原、氨基多糖、糖蛋白等成分，并且含有多種生長(zhǎng)因子，對(duì)組織的修復(fù)重建及細(xì)胞的生長(zhǎng)有重要作用，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，可通過與細(xì)胞表面的多種受體作用后介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而對(duì)上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等多種細(xì)胞具有促進(jìn)生長(zhǎng)、分化的作用。研 究表明，SIS中的生長(zhǎng)因子雖經(jīng)消毒、凍干等處理，仍具有生物活性。同時(shí)，由于SIS具有無免疫原性、抗微生物活性，能促進(jìn)組織再生等特性，已作為組織工程的支架材料廣泛應(yīng)用于尿道、膀胱、血管、肌腱、神經(jīng)、骨等多種組織缺損修復(fù)。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)是一種小分子蛋白，是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)，目前研究最為透徹的，具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，NGF包含α、β、Y三個(gè)亞單位，活性區(qū)是β亞單位。它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。NGF在組織/器官修復(fù)中，特別是神經(jīng)重建中發(fā)揮重要作用，是不可或缺的重要調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)，SIS 中 NGF 含量?jī)H為 4. 92 ±2. 06pg/cm2。目前在材料中添加的生長(zhǎng)因子的方法主要是直接添加，或通過緩釋給藥技術(shù)來完成。直接添加生長(zhǎng)因子的方式因生長(zhǎng)因子會(huì)在短時(shí)間內(nèi)釋放，釋放速度和活性均難以控制，有效性差，存在安全隱患。緩釋給藥技術(shù)可以控制生長(zhǎng)因子在體內(nèi)的釋放速度，但現(xiàn)有的緩釋材料大多為高分子合成材料，價(jià)格昂貴，藥物釋放的穩(wěn)定性也不盡如人意，還可能因代謝問題給機(jī)體帶來副作用。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的材料。本發(fā)明促神經(jīng)修復(fù)材料，它包括小腸黏膜下層和神經(jīng)生長(zhǎng)因子，所述神經(jīng)生長(zhǎng)因子的含量為f500pg/cm2。所述材料是由如下方法制備( I)取小腸黏膜下層和雪旺細(xì)胞，將雪旺細(xì)胞接種于小腸黏膜下層上，共培養(yǎng)，得復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層；(2)將復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層反復(fù)凍融，凍干，即得所述的材料。其中，所述步驟(I)中雪旺細(xì)胞的接種密度5X IO3個(gè)/cnT2. 5X IO5個(gè)/cm2。優(yōu)選地，所述雪旺細(xì)胞為采用雙酶分步消化法處理大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)得到的原代細(xì)胞或者RSC96大鼠雪旺細(xì)胞，接種密度為2. 5 X IO5個(gè)/cm2或者5 X IO3個(gè)/cm2。雙酶分步消化法采用公知方法，如，寧仁德等，“雪旺細(xì)胞分步消化培養(yǎng)及其純化實(shí)驗(yàn)研究”，解剖與臨床2003年第8卷第4期公開的分步消化培養(yǎng)法。其中,所述雙酶分步消化法使用的酶是胰蛋白酶和II型膠原酶。其中，所述步驟(I)共培養(yǎng)的時(shí)間是3 15天。其中，所述步驟(2)中反復(fù)凍融是將復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層置于液氮中10分鐘，37°C處理10分鐘，重復(fù)操作3次。其中，所述步驟(2)中反復(fù)凍融是將復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層置于液氮中8^12分鐘，室溫放置15 25分鐘，置于搖床上用O. 2^0. 5%SDS溶液洗3 7分鐘，去離子水漂洗，重復(fù)操作3飛次；再用O. 2^0. 5%SDS溶液置于搖床上振蕩洗15 25分鐘，去離子水漂洗5 IO分鐘。
本發(fā)明促神經(jīng)修復(fù)的材料的制備方法，包括如下步驟(I)取小腸黏膜下層和雪旺細(xì)胞，將雪旺細(xì)胞接種于小腸黏膜下層上，共培養(yǎng)，得復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層；(2)將復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層反復(fù)凍融，凍干，即得所述的材料。其中，所述步驟(I)中雪旺細(xì)胞的接種密度5 X IO3個(gè)/cnT2. 5 X IO5個(gè)/cm2。優(yōu)選地，所述雪旺細(xì)胞為采用雙酶分步消化法處理大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)得到的原代細(xì)胞或者RSC96大鼠雪旺細(xì)胞，接種密度為2. 5X IO5個(gè)/cm2或者5X IO3個(gè)/cm2。其中,所述雙酶分步消化法使用的酶是胰蛋白酶和II型膠原酶。其中，所述步驟(I)共培養(yǎng)的時(shí)間是3 15天。其中，所述步驟(2)中反復(fù)凍融是將復(fù)合了原代雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層置于液氮中10分鐘，37°C處理10分鐘，重復(fù)操作3次。其中，所述步驟(2)中反復(fù)凍融是將復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層置于液氮中8^12分鐘，室溫放置15 25分鐘，置于搖床上用O. 2^0. 5%SDS溶液洗3 7分鐘，去離子水漂洗，重復(fù)操作3飛次；再用O. 2^0. 5%SDS溶液置于搖床上振蕩洗15 25分鐘，去離子水漂洗5 IO分鐘。本發(fā)明促神經(jīng)修復(fù)材料還可用于制備治療組織缺損的藥物。本發(fā)明促神經(jīng)修復(fù)材料由復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸粘膜下層制備而成，可以緩慢釋放神經(jīng)生長(zhǎng)因子，釋放速度為每天42. 01 土 I. 43 82. 43± I. 89pg/cm2,可有效延長(zhǎng)神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥效，既不需要直接添加生長(zhǎng)因子，也不需要采用高分子緩釋材料，效果穩(wěn)定，使用安全，制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，具有廣闊的應(yīng)用前景。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖I倒置顯微鏡觀察生長(zhǎng)5天的雪旺細(xì)胞的形態(tài)結(jié)果圖。
圖2 S-100免疫熒光染色鑒定雪旺細(xì)胞的結(jié)果圖。圖3 SIS電鏡掃描結(jié)果圖。其中，A :未凍干的SIS呈半透明狀膜；B :凍干后的SIS成白色紙狀；C :處理后SIS表面未見細(xì)胞殘留(HEX200) ;D :處理后的SIS(SEMx200)。圖4復(fù)合了 SCs的SIS的觀察結(jié)果圖。其中，A :組織切片觀察SCs在SIS上生長(zhǎng)情況(HEX 100) ；B :組織切片觀察SCs在SIS上生長(zhǎng)情況(MassonxlOO) ；C :掃描電鏡觀察 SCs 在 SIS 生長(zhǎng)情況(X 1200)。圖5培養(yǎng)時(shí)間對(duì)本發(fā)明材料中NGF-β含量的影響。圖6本發(fā)明材料NGF-β的釋放曲線。圖7倒置相差顯微鏡觀察長(zhǎng)至約80%融合狀態(tài)的RSC96細(xì)胞形態(tài)圖。圖8 S-100免疫熒光染色鑒定RSC96細(xì)胞結(jié)果圖。圖9復(fù)合了 RSC96細(xì)胞的SIS上的觀察結(jié)果圖。Α:ΗΕ染色觀察RSC96細(xì)胞在SIS上的生長(zhǎng)情況；Β :掃描電鏡觀察RSC96細(xì)胞在SIS上的生長(zhǎng)情況。圖10復(fù)合了 RSC96細(xì)胞的SIS經(jīng)不同脫細(xì)胞處理后DAPI染色結(jié)果。A :對(duì)照組，未經(jīng)處理；Β :反復(fù)凍融組，將復(fù)合了 RSC96細(xì)胞的SIS置于液氮中10分鐘，室溫放置20分鐘解凍，置于搖床上去離子水洗6分鐘，以上步驟重復(fù)5次，再用去離子水洗25分鐘；C :反復(fù)凍融加SDS處理組，將復(fù)合了 RSC96細(xì)胞的小腸黏膜下層置于液氮中處理10分鐘，室溫放置20分鐘，置于搖床上用O. 25%SDS去離子水溶液洗5分鐘，去離子水漂洗I分鐘，以上步驟重復(fù)五次；再用O. 25%SDS去離子水溶液置搖床上振蕩洗20分鐘，去離子水洗5分鐘。圖11復(fù)合了 RSC96細(xì)胞的SIS經(jīng)不同脫細(xì)胞處理后，酚-氯仿法提DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
具體實(shí)施例方式縮略語SIS :小腸粘膜下層；SCs :雪旺細(xì)胞；NGF :神經(jīng)生長(zhǎng)因子；NGF-β :神經(jīng)生長(zhǎng)因子-β，NGF的β亞單位；G418 :氨基糖苷類抗生素；H-DMEM :高糖-Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基；DAPI :4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚。實(shí)施例I本發(fā)明促神經(jīng)修復(fù)材料的制備和檢測(cè)一、雪旺細(xì)胞SCs的分離純化培養(yǎng)及檢測(cè)I、雪旺細(xì)胞SCs的分離純化培養(yǎng)(I)取材取20只5 7天的SD乳鼠，引頸處死后無菌條件下，取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，在解剖顯微鏡下用顯微器械盡快剝除神經(jīng)外膜組織。(2)消化分別用O. 25%胰蛋白酶和O. 2%11型膠原酶各消化10分鐘，1200rpm的轉(zhuǎn)速離心5min,差速貼壁一次20min后接種。(3)純化24h 后，更換成含有 20 μ 1/ml G418 (200 μ g/mL)或者 2X ΙΟΛΓ X 1(Γ5Μ阿糖胞苷的10%FBS的H-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。G418或阿糖胞苷作用兩天后，換含10%FBS的H-DMEM培養(yǎng)液。待SCs生長(zhǎng)達(dá)到一定的密度后(約第6天)把血清濃度降低到2. 5%。(4)傳代接種8 9天后，倒置顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞70 80%融合時(shí)，棄培養(yǎng)液，PBS液清洗兩次，后加入用O. 25%胰蛋白酶與O. P/oEDTA混合液和PBS以I :4的比例混合消化傳代，鏡下觀察見成纖維細(xì)胞皺縮后，立刻用含10%FBS的H-DMEM終止消化，經(jīng)差速貼壁一次20min后接種。2、SCs純度的檢測(cè)取純化后的細(xì)胞,制成細(xì)胞爬片,用倒置顯微鏡觀察,用S-100進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。結(jié)果如圖I和圖2所示，圖I為倒置顯微鏡X200觀察培養(yǎng)5天的細(xì)胞，細(xì)胞雙極突起細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞核為圓形或卵圓形，細(xì)胞純度高，呈明顯的“端對(duì)端” “肩并肩”平行排列；圖2為SCs S-100免疫熒光染色(熒光顯微鏡X 200)，SCs的胞質(zhì)呈綠色，為S-100陽性，著色的SCs與活的SCs形態(tài)一致，成纖維細(xì)胞不著色，呈陰性反應(yīng)，細(xì)胞核染色均為藍(lán)色。根據(jù)圖廣圖2所示結(jié)果可知，純化后的雪旺細(xì)胞純度好，未摻入雜細(xì)胞。二、SIS的制備和檢測(cè) 1、SIS 的制備(I)清洗整理取屠宰后半個(gè)小時(shí)的新鮮豬小腸，用水沖去小腸內(nèi)容物，翻轉(zhuǎn)小腸，加入鹽揉搓后用水反復(fù)沖洗3次，用手術(shù)刀剖開小腸，然后剪成15厘米長(zhǎng)的腸段。(2)分離出SIS :用壓舌板刮除肌層，漿膜層，置于生理鹽水中4°C保存過夜。(3)脫脂用去離子水漂洗干凈后用紗布濾干水。浸入三氯甲烷和甲醇的混合液中，三氯甲烷甲醇的比值為I :1，置于通風(fēng)櫥里4個(gè)小時(shí)，平均2小時(shí)換一次液，并且每半個(gè)小時(shí)攪拌一次，每次濾干之前的液體再浸入到新的脫脂液中。(4)脫細(xì)胞將脫脂后的SIS用去離子水漂洗20次，反復(fù)清洗，漂至無味。然后放入濃度為O. 25%的胰酶液里，4°C脫細(xì)胞處理過夜。用去離子水漂洗10次后用O. 5%的SDS處理至少4個(gè)小時(shí)，清洗后凍干。2、SIS的檢測(cè)染色、掃描電鏡通過HE染色和掃描電鏡觀察有無殘留的細(xì)胞，結(jié)果如圖3所示，光鏡以及掃描電鏡下觀察到的處理后的SIS未見細(xì)胞殘留。三、本發(fā)明神經(jīng)修復(fù)材料的制備及檢測(cè)I、本發(fā)明神經(jīng)修復(fù)材料的制備(I)將制備的無菌凍干SIS剪成約IcmX Icm,置于6孔板中，分別用無菌的PBS，含10%胎牛血清的H-DMEM，置于5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中浸泡16小時(shí)。(2) SIS與SCs的復(fù)合培養(yǎng)體外分離培養(yǎng)和純化乳鼠的SCs,取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代細(xì)胞，消化離心，制成細(xì)胞懸液，以2. 5X IO5個(gè)/cm2滴加于步驟(I)所得SIS表面，加入10%FBS的H-DMEM培養(yǎng)液，于5% C023 7°C條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)3 15d。隔日更換培養(yǎng)液。(3)反復(fù)凍融取步驟(2)所得SIS與SCs的復(fù)合培養(yǎng)物，液氮中放置10分鐘后，置于37°C水浴鍋中10分鐘，反復(fù)作用3次，凍干，即得本發(fā)明神經(jīng)修復(fù)材料。2、檢測(cè)(I)取步驟(2)中復(fù)合了 SCs的SIS，組織切片觀察SCs在SIS上的生長(zhǎng)情況。結(jié)果如圖4所示，圖4A，4B均顯示SCs在SIS上分裂增殖，呈三維生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)多為長(zhǎng)梭形，紡錘形或長(zhǎng)三角形，突起顯著，細(xì)胞呈端對(duì)端的相互連接或排列成束狀或柵欄狀，圖4C顯示細(xì)胞表面蛋白顆粒分泌良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明雪旺細(xì)胞在SIS上生長(zhǎng)良好。(2)復(fù)合后NGF-β含量的檢測(cè)
SCs與SIS復(fù)合培養(yǎng)后，對(duì)照組中直接種密度為2. 5X IO5個(gè)/cm2的雪旺細(xì)胞，分別于第1、2、3、4、5、7天時(shí)，各吸取細(xì)胞上清液O. 2mL，利用ELISA方法定量檢測(cè)大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的分泌量。評(píng)價(jià)SIS對(duì)SCs分泌NGF-β是否有影響，即SIS與SCs的生物相容性。結(jié)果見表I :表IELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NGF-β的含量結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種促神經(jīng)修復(fù)材料，其特征在于它包括小腸黏膜下層和神經(jīng)生長(zhǎng)因子，所述神經(jīng)生長(zhǎng)因子的含量為f500pg/cm2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的材料，其特征在于它是由如下方法制備 (1)取小腸黏膜下層和雪旺細(xì)胞，將雪旺細(xì)胞接種于小腸黏膜下層上，共培養(yǎng)，得復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層； (2)將復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層反復(fù)凍融，凍干，即得所述的材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的材料，其特征在于所述步驟(I)中雪旺細(xì)胞的接種密度5 X IO3個(gè)/cm2 2. 5 X IO5個(gè)/cm2 ;共培養(yǎng)的時(shí)間是3 15天。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的材料，其特征在于所述雪旺細(xì)胞為采用雙酶分步消化法處理大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)得到的原代細(xì)胞或者RSC96大鼠雪旺細(xì)胞，接種密度為2. 5 X IO5個(gè)/cm2 或者 5X IO3 個(gè)/cm2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的材料，其特征在于所述雙酶分步消化法使用的酶是胰蛋白酶和II型膠原酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的材料，其特征在于所述步驟(2)中反復(fù)凍融是將復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層置于液氮中10分鐘，37°C處理10分鐘，重復(fù)操作3次。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的材料，其特征在于所述步驟(2)中反復(fù)凍融是將復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層置于液氮中8 12分鐘，室溫放置15 25分鐘，置于搖床上用O.2 O. 5%SDS溶液洗滌3 7分鐘，去離子水漂洗，重復(fù)操作3 5次；再用O. 2 O. 5%SDS溶液置于搖床上振蕩洗滌15 25分鐘，去離子水漂洗5 10分鐘。
8.一種制備權(quán)利要求f 7任意一項(xiàng)所述促神經(jīng)修復(fù)材料的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)取小腸黏膜下層和雪旺細(xì)胞，將雪旺細(xì)胞接種于小腸黏膜下層上，共培養(yǎng)，得復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層； (2)將復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層反復(fù)凍融，凍干，即得所述的材料。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中雪旺細(xì)胞的接種密度5X IO3個(gè)/cm2 2. 5 X IO5個(gè)/cm2 ;共培養(yǎng)的時(shí)間是3 15天。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述雪旺細(xì)胞為采用雙酶分步消化法處理大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)得到的原代細(xì)胞或者RSC96大鼠雪旺細(xì)胞，接種密度為2. 5 X IO5個(gè)/cm2 或者 5X IO3 個(gè)/cm2。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述雙酶分步消化法使用的酶是胰蛋白酶和II型膠原酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中反復(fù)凍融是將復(fù)合了原代雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層置于液氮中10分鐘，37°C處理10分鐘，重復(fù)操作3次。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中反復(fù)凍融是將復(fù)合了雪旺細(xì)胞的小腸黏膜下層置于液氮中8 12分鐘，室溫放置15 25分鐘，置于搖床上用O.2 O. 5%SDS溶液洗3 7分鐘，去離子水漂洗，重復(fù)操作3 5次；再用O. 2 O. 5%SDS溶液置于搖床上振蕩洗15 25分鐘，去離子水漂洗5 10分鐘。
14.權(quán)利要求f7任意一項(xiàng)所述促神經(jīng)修復(fù)材料在制備治療組織缺損的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促神經(jīng)修復(fù)的材料，它包括小腸黏膜下層和神經(jīng)生長(zhǎng)因子，所述神經(jīng)生長(zhǎng)因子的含量為1~500pg/cm2。本發(fā)明還公開了促神經(jīng)修復(fù)材料的制備方法和用途。本發(fā)明促神經(jīng)修復(fù)的材料中，神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以緩慢釋放，釋放速度為每天42.01±1.43~82.43±1.89pg/cm2，克服直接添加生長(zhǎng)因子的缺陷，制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K47/46GK102861360SQ20121039780
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者解慧琪, 劉宏銀, 羅靜聰, 楊志明 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院