專利名稱：傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有抗原的醫(yī)藥制品領(lǐng)域，特別是涉及一種傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
傷寒是由對(duì)人有致病力的沙門氏傷寒桿菌引起的一種全身性、急性、發(fā)熱性傳染病。主要表現(xiàn)為持續(xù)性高熱，腹痛、不適、頭痛及小腸結(jié)腸炎癥等癥狀。通過(guò)改善公共衛(wèi)生條件可以降低傷寒的發(fā)病率，但是，有效的控制該病流行的最佳方式仍是預(yù)防免疫。沙門氏菌具有復(fù)雜的抗原構(gòu)造，一般可分為3類抗原(I) Vi抗原或表面抗原，SP莢膜多糖；(2) O抗原或細(xì)胞壁抗原，是細(xì)胞壁的脂多糖，即內(nèi)毒素；(3)H抗原或鞭毛抗原，是一種蛋白質(zhì)抗原。沙門氏菌的不同菌株都有莢膜多糖，它具有抗吞噬作用和保護(hù)細(xì)菌避免相應(yīng)的抗體在補(bǔ)體參與下的溶菌作用。同時(shí)，莢膜可以保護(hù)細(xì)菌在血液中得以生存。特異性的抗莢膜多糖抗體與細(xì)菌結(jié)合后通過(guò)活化補(bǔ)體而殺死傷寒桿菌。鑒于莢膜多糖這些與細(xì)菌侵襲力和毒力有關(guān)的特性，F(xiàn)elix和Pitt于20世紀(jì)50年代將沙門氏桿菌的莢膜多糖命名為Vi抗原，隨后的研究發(fā)現(xiàn)，用粗制的Vi莢膜多糖抗原免疫小鼠后，小鼠可獲得對(duì)傷寒沙門氏菌感染的抵抗力，可保護(hù)小鼠免受再次感染。傷寒疫苗有注射用滅活全菌體疫苗、口服滅活全菌體疫苗、口服減毒活疫苗、Vi多糖疫苗等。20世紀(jì)60-70年代，滅活全菌體疫苗在許多國(guó)家進(jìn)行了臨床研究，效果不理想，已停止使用。鏈霉素依賴性傷寒突變株活疫苗在正常人體內(nèi)繁殖能力較差，免疫后效果難盡人意，且凍干型的該種疫苗又完全喪失保護(hù)力，也停止了研究。傷寒Ty21a減毒活疫苗經(jīng)過(guò)了大量臨床實(shí)驗(yàn)，已被證實(shí)是目前較安全有效的傷寒疫苗之一，而且沒(méi)有嚴(yán)重的副反應(yīng)，但長(zhǎng)期以來(lái)一些學(xué)者對(duì)Ty21a突變株提出以下仍然具有爭(zhēng)議的問(wèn)題該減毒株的遺傳穩(wěn)定性不能確定，并推測(cè)其有毒力返祖的可能；gale基因的突變不能完全解釋該疫苗的減毒機(jī)制；有其他不明部位的基因發(fā)生了突變；凍干劑型疫苗的穩(wěn)定性不規(guī)律以及口服接種次數(shù)過(guò)多等。傷寒Vi多糖(又名傷寒莢膜多糖)疫苗與其他的多糖疫苗一樣，為T淋巴細(xì)胞非依賴性抗原,不能用于2歲以內(nèi)兒童的免疫，再次免疫接種時(shí)不會(huì)產(chǎn)生免疫記憶反應(yīng)。傷寒Vi多糖疫苗免疫原性低且抗體水平不能保持在高水平，原因在于其多糖是半抗原，為非T細(xì)胞依賴性抗原，接種后不能激活Th細(xì)胞和T記憶細(xì)胞，不產(chǎn)生回憶加強(qiáng)反應(yīng)。多糖誘導(dǎo)抗體主要是通過(guò)刺激B細(xì)胞產(chǎn)生IgM和少量IgG抗體。由于它是非T細(xì)胞依賴性抗原(TI)，存在一定的缺點(diǎn)，表現(xiàn)在①在嬰幼兒體內(nèi)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)很弱；②無(wú)免疫記憶及增強(qiáng)效應(yīng)；③普通佐劑對(duì)之不易起到作用。所以此疫苗雖然有效、安全，但仍需改進(jìn)。美國(guó)NIH的國(guó)立兒童健康和人類發(fā)育研究所(National Institute of Child Healthand Human Development)研制的傷寒Vi多糖和重組綠膿桿菌外毒素A偶聯(lián)制備的結(jié)合疫苗，在越南已完成三期臨床試驗(yàn)，顯示出良好的安全性和有效性。本發(fā)明參考了 NIH的研究結(jié)果，結(jié)合凍干A、C群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗的研制和生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，確定了多糖一蛋白結(jié)合物的制備和純化工藝，多糖檢定，活化蛋白所需EDAC的濃度及己二酰肼的濃度，衍生物的純化、檢定，Vi多糖和蛋白濃度，結(jié)合物的純化、檢定，結(jié)合物的抗原性，免疫原性、生化等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以及結(jié)合物的穩(wěn)定性，安全性等進(jìn)行了多方面的研究，并通過(guò)了各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢定，成功制備出傷寒Vi多糖與破傷風(fēng)類毒素(TT)的結(jié)合物原液傷寒Vi - TT。甲型副傷寒(S. paratyphoid A副甲)是在東南亞、南亞、撒哈拉以南的非洲地區(qū)流行的傷寒腸熱癥中僅次于傷寒居第二位的病原菌，在我國(guó)廣西、貴州等地區(qū)也時(shí)有爆發(fā)，嚴(yán)重危害人民健康。在地方流行區(qū)，學(xué)齡兒童的發(fā)病率最高。隨著傷寒Vi多糖疫苗的廣泛運(yùn)用，原有的傷寒、副甲、副乙三聯(lián)菌體苗(TAB)由于副反應(yīng)大，已不再使用，形成傷寒發(fā)病逐漸減少，而副甲的疫情凸現(xiàn)的情況。市場(chǎng)迫切需要新的甲型副傷寒疫苗。美國(guó)NIH的國(guó)立兒童健康和人類發(fā)育研究所(National Institute of ChildHealth and Human Development)的J. B. Robbins等認(rèn)為,應(yīng)急水平的抗菌體特異多糖(Anti-O-SP)血清抗體可賦予人體對(duì)副甲的保護(hù)性免疫。因此，1996年NIH的Robbins等
用I-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼(CDAP)活化多糖的方法制備副甲多糖結(jié)合疫苗進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn)，用高分子量的菌體特異多糖(O-SP)和破傷風(fēng)類毒素(TT)按兩種方法制備的結(jié)合物(多糖蛋白直接偶聯(lián)和通過(guò)ADH連接臂的偶聯(lián))免疫了小鼠。注射一劑后，兩種結(jié)合物均未誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗副甲酯多糖(LPS)的任何抗體；第二和第三劑后，均誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生低水平的IgM抗體。同時(shí)，第二劑即產(chǎn)生抗LPS的IgG抗體，而且第三劑免疫后還有明顯的免疫回憶反應(yīng)。兩種結(jié)合物誘導(dǎo)的副甲抗體無(wú)明顯差別。直接結(jié)合制備的結(jié)合物誘導(dǎo)的TT抗體水平較高。而且只有含O-乙酰基的O-SP制備的結(jié)合物誘導(dǎo)的抗LPS IgG血清抗體才有殺菌抗體活性?；趧?dòng)物試驗(yàn)結(jié)果，2000年NIH的Shousun C SZU等在越南用法國(guó)巴斯德公司用按上述兩種方法制備的副甲結(jié)合疫苗(SPA-TT1，有ADH連接臂；SPA-TT2,直接結(jié)合)進(jìn)行了 I期和II期臨床試驗(yàn)。試驗(yàn)選取成人、青少年和2-4歲兒童三組志愿者進(jìn)行了安全性和免疫原性的觀察。結(jié)果表明這兩種副甲結(jié)合疫苗人體試驗(yàn)具有良好的免疫原性和安全性。中國(guó)專利ZL200610111684. 8公開(kāi)了一種傷寒、副傷寒外膜蛋白疫苗，從傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌培養(yǎng)液中提取外膜蛋白制得，經(jīng)小鼠實(shí)驗(yàn)證明可抵御致死劑量的活菌的攻擊。但該疫苗提取的是外膜蛋白，而外膜蛋白是一組蛋白，不同的蛋白成分比較復(fù)雜，多數(shù)形成的是一個(gè)結(jié)合體，較難進(jìn)行純化，純化后也不易進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)，容易混入較多的菌體蛋白等雜質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)傷寒甲型副傷寒二價(jià)疫苗副反應(yīng)大，以及已公開(kāi)的傷寒、副傷寒外膜蛋白疫苗質(zhì)量控制方面的缺陷，本發(fā)明提供了一種傷寒Vi — TT和甲型副傷寒O-SP-TT結(jié)合物混合后制成的結(jié)合疫苗，使用傷寒Vi多糖和甲型副傷寒O-特異多糖(0-SP)，兩種多糖均為單一多糖，能很好的控制蛋白和核酸等雜質(zhì)，并有完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的一方面提供了一種傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗，包括傷寒菌體莢膜多糖和甲型副傷寒菌體特異多糖0-SP。優(yōu)選地，上述傷寒菌體莢膜多糖和甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP均與載體蛋白形成結(jié)合物。優(yōu)選地，載體蛋白為破傷風(fēng)類毒素。
優(yōu)選地，每人份傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗含傷寒菌體莢膜多糖和甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP均不低于10ug。本發(fā)明的另一方面提供了一種上述傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗的制備方法，包括以下步驟，I)精制傷寒Vi多糖傷寒沙門氏菌種經(jīng)甲醛殺菌后，高速離心去除菌體，上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻形成沉淀，離心收集沉淀物，用CaCl2溶液解離，再用乙醇沉淀制得粗制品；將粗制品溶解于10%飽和醋酸鈉溶液中，然后用冷酚提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液透析；再加乙醇至最終濃度為75 80% (V / V);離心收集沉淀物，洗滌后離心，棄上清，溶解沉淀的多糖，得精制傷寒Vi多糖；
2)制備甲型副傷寒菌體特異多糖0-SP:甲型副傷寒沙門氏菌種經(jīng)甲醛殺菌后，高速離心收集菌體，熱酚法粗制菌體中的副甲脂多糖；再用低溫乙醇沉淀法精制副甲脂多糖，然后將副甲脂多糖以10mg/ml濃度溶解于1%醋酸溶液中，沸水浴后冷卻，離心棄沉淀，透析上清，再以低溫乙醇沉淀法收集沉淀，經(jīng)分子篩層析法純化；3)制備傷寒Vi多糖-載體蛋白結(jié)合物衍化載體蛋白；將精制傷寒Vi多糖溶液加入碳二亞胺，然后加入衍化的載體蛋白，維持pH在5. 75進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，然后調(diào)pH至中性終止反應(yīng)，反應(yīng)物在生理鹽水中透析過(guò)夜，過(guò)層析柱純化，得傷寒Vi多糖-載體蛋白結(jié)合物；4)制備甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP-載體蛋白結(jié)合物用己二酰肼與甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP進(jìn)行連接反應(yīng)，制得O-SP-AH衍生物，將其與載體蛋白混合，加入碳二亞胺進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)超濾膜超濾去除小分子物質(zhì)，過(guò)層析柱純化，得甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP-載體蛋白結(jié)合物；5)制備成品將傷寒菌體莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物原液與甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP-載體蛋白結(jié)合物原液混合后加入高壓滅菌后的注射水及乳糖，除菌過(guò)濾后凍干。優(yōu)選地，上述步驟3)中，載體蛋白為破傷風(fēng)類毒素。優(yōu)選地，上述步驟3)中，載體蛋白衍化度為I. 0-3. 0%，精制傷寒Vi多糖蛋白終濃度為 2-3mg/ml。優(yōu)選地，上述步驟4)中，O-SP的衍化度為I. O 40%。優(yōu)選地，上述步驟4)中，結(jié)合反應(yīng)pH控制在5. 6 5. 9，反應(yīng)3小時(shí)。優(yōu)選地，上述步驟4)中，層析柱為瓊脂糖4FF柱。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明對(duì)傷寒及甲型副傷寒同時(shí)免疫，且兩種抗原間無(wú)干擾，均能產(chǎn)生和單獨(dú)的結(jié)合物相同的免疫應(yīng)答。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍做出更為清楚明確的界定。本發(fā)明系采用傷寒Vi多糖和甲型副傷寒O-SP特異多糖與精制破傷風(fēng)類毒素化學(xué)偶聯(lián)后加入乳糖作為賦形劑凍干制成的結(jié)合疫苗，供預(yù)防傷寒和甲型副傷寒。實(shí)施例I
傷寒Vi多糖的制備方法I.菌種制備將傷寒沙門氏菌種(50098)啟種于葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，35 37°C，培養(yǎng)16 20小時(shí)，同樣條件轉(zhuǎn)種第二代、第三代于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，35 37°C培養(yǎng)16 20小時(shí),再將第三代菌種分別米種于裝有一定量改良半綜合液體培養(yǎng)基的菌種罐中，35 37°C培養(yǎng)4 8小時(shí)。2.大罐培養(yǎng)將菌種罐中的菌種壓入裝有一定量改良半綜合液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，35 37°C深層通氣培養(yǎng)6 8小時(shí)。3.殺菌培養(yǎng)物按I 2% (V / V)甲醛溶液加入罐內(nèi)殺菌，攪拌半小時(shí)以上靜置過(guò)夜。
4.除菌體用高速連續(xù)流離心機(jī)離心去菌體，收集上清液。5.粗制在上清液中加入10%十六烷基三甲基溴化銨至終濃度為O. 1%，充分混勻形成沉淀，離心收集沉淀物即為傷寒Vi復(fù)合多糖。用2M CaCl2溶液解離復(fù)合多糖至CaCl2濃度為1M，解離時(shí)間為2小時(shí)。在解離液中加入95%酒精至終濃度為25%-27%，攪拌10分鐘，靜止1-3小時(shí)或過(guò)夜，高速離心去核酸，收上清。上清液中加入95%乙醇至酒精終濃度為75-80%，離心棄上清，沉淀即為粗制品。收集粗糖，用無(wú)水乙醇和丙酮洗滌，吹干、稱重、備用；6.精制將粗制多糖溶解于10%飽和醋酸鈉溶液中，多糖濃度在5-10mg/ml。然后按1:2體積比加入70%冷酚提取，振搖5-10分鐘使多糖苯酚充分扒壁后離心收集上清液。如上清不清亮可重復(fù)加入苯酚抽提2-3次至上清清亮為止。用O. lmol/L氯化鈣溶液透析多糖液后加入95%乙醇至最終濃度為75 80% (V / V)，離心收集沉淀物，洗滌后離心，棄上清，溶解精制多糖除菌過(guò)濾后備用。實(shí)施例2甲型副傷寒菌體O-SP多糖的制備方法I.菌種制備將甲型副傷寒沙門氏菌種(50073)啟種于葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，35 37°C培養(yǎng)16 20小時(shí)，同樣條件轉(zhuǎn)種第二代、第三代于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，35 37°C培養(yǎng)16 20小時(shí)，再將第三代菌種分別采種于裝有一定量改良半綜合液體培養(yǎng)基的菌種罐中，35 37°C培養(yǎng)4 8小時(shí)。2.大罐培養(yǎng)將菌種罐中的菌種壓入裝有一定量改良半綜合液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，35 37°C深層通氣培養(yǎng)6 8小時(shí)。3.殺菌培養(yǎng)物按I 2% (V / V)甲醛溶液加入罐內(nèi)殺菌，攪拌半小時(shí)以上。4.收集菌體用高速連續(xù)流離心機(jī)離心收集菌體，棄上清液。5.熱酚法粗制LPS :菌體按I :10加入注射用水，再加入90%熱酚溶液，68°C水浴加熱I小時(shí)，流水降溫，冷庫(kù)過(guò)夜后10°c 10000 rpm離心I小時(shí)，收集上清液。純化水透析去酚，加入酒精至終濃度75%沉淀LPS，收集沉淀物，即為L(zhǎng)PS粗制品。6.低溫乙醇沉淀法精制LPS :將粗制品按濕重150 200mg/ml溶解于注射用水中，再加乙醇至最終濃度為30% (V / V)。-20°C放置48 72小時(shí)，IOOOOrpm離心收集上清，再補(bǔ)加乙醇至45%，-20°C放置48 72小時(shí)，IOOOOrpm離心收集上清，上清加入乙醇至75%，冷庫(kù)放置4 8小時(shí)，4000rpm離心收集沉淀即為精制LPS。7. O-SP酸水解LPS以10mg/ml溶解于I %醋酸溶液中，沸水浴I 2小時(shí)處理。水解液冷卻后以20000rpm，離心2小時(shí)。棄沉淀，收集上清再次20000rpm，離心2小時(shí)。棄沉淀，收上清。注射用水透析。加入乙醇使終濃度為80%，放置冰庫(kù)2-4小時(shí)。4000rpm離心20分鐘，收集沉淀吹干。其中，醋酸溶液水解I小時(shí)，O-SP產(chǎn)量穩(wěn)定，且適合于規(guī)?；a(chǎn)。8.分子篩層析法純化O-SP :沉淀按10mg/ml溶于注射水中，濾去不溶物,Superdex75層析，注射用水洗柱，收集外水體積第一峰洗脫物冷凍干燥即為精制0-SP。實(shí)施例3傷寒Vi多糖-載體蛋白結(jié)合物的制備方法以破傷風(fēng)類毒素(TT)作為傷寒Vi多糖的載體蛋白。I. TT衍化將TT按蛋白量稀釋為10mg/ml，在室溫20 26°C每毫克蛋白加入3. 5毫克1，6_己二酰肼(ADH)，混勻，調(diào)pH值到5. 75，加入碳二亞胺(EDAC)使EDAC與蛋白的比值為O. 1-0. 8，維持pH5. 75攪拌I小時(shí)，用30k超濾膜超濾去ADH和EDAC等小分子雜質(zhì)。測(cè)定蛋白含量和ADH殘基(一 AH)含量，計(jì)算其衍化率。 衍化蛋白時(shí)EDAC/TT定在O. I O. 15之間，能有較合適的衍化度。2.傷寒Vi多糖與衍化載體蛋白結(jié)合將傷寒Vi多糖用O. lmol/1 HCl調(diào)pH值到
5.75，按加入蛋白后的體積加入5 lOmmol/1的EDACdM pH至5. 75，反應(yīng)2分鐘，加入等體積的衍化蛋白TT-AH，維持pH在5. 75，反應(yīng)3小時(shí)或pH不再變化時(shí)，調(diào)pH至中性終止反應(yīng)。反應(yīng)物在生理鹽水中透析過(guò)夜，過(guò)Sepharose 4FF柱純化,收集第一峰,去掉游離蛋白和其它小分子物質(zhì)。多糖和蛋白偶聯(lián)時(shí)，高濃度和高衍化度結(jié)合物容易成膠，而在低濃度和低衍化度時(shí)不易結(jié)合，只有在合適的濃度時(shí)才有較好的偶聯(lián)和合適的多糖蛋白比。蛋白衍化度在
I.0-3. 0%、多糖蛋白終濃度在2-3mg/ml時(shí)能避免成膠，又有較好的多糖蛋白比。實(shí)施例4O-SP-載體蛋白結(jié)合物的制備方法以TT作為甲型副傷寒O-SP多糖的載體蛋白。I. O-SP-AH衍生物的制備按5mg/ml將甲型副傷寒精制O-SP溶解在注射用水中。每毫克O-SP多糖加入O. 5mg溴化氰，pH控制在10. 8 ± O. 2，反應(yīng)溫度23±3°C，活化40分鐘，然后按每毫克多糖加入3. 5mg己二酰肼(ADH)連接，用生理鹽水超濾(IOkd膜)，能得到適宜數(shù)量的活化位點(diǎn)。其中，控制衍化度在I. O 3. 0%利于下一步結(jié)合反應(yīng)。2. O-SP-TT結(jié)合物的制備=O-SP — AH衍生物與TT蛋白定量混合，用HCl調(diào)pH至
5.O 5. 5，然后加入碳二亞胺(EDAC)，2 8V反應(yīng)I 3小時(shí)，調(diào)pH至6. 7 7. I中止反應(yīng)。反應(yīng)物經(jīng)IOOKd超濾膜超濾去除小分子物質(zhì)。其中，反應(yīng)pH控制在5. O 5. 5，反應(yīng)3小時(shí)可較好結(jié)合。3. O-SP-TT結(jié)合物的純化用瓊脂糖4FF層析，收集甲型副傷寒O-SP-TT結(jié)合物的第一峰。但瓊脂糖CL-4B柱流速過(guò)慢，上樣體積太小，不適宜于規(guī)模生產(chǎn)。一種替代方式是，選用和瓊脂糖CL-4B分離范圍一致，耐壓，高流速的瓊脂糖4FF柱用于結(jié)合物的分離純化。在波長(zhǎng)206nm下監(jiān)測(cè)吸收峰，收集第一峰。經(jīng)瓊脂糖4FF柱(2. 6 X 90cm)層析，只有一個(gè)多糖蛋白結(jié)合峰，后面有一個(gè)單獨(dú)的蛋白峰，結(jié)合物和游離的蛋白能較好的分離。實(shí)施例5傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗成品的制備將傷寒Vi-TT結(jié)合物原液、甲型副傷寒O-SP-TT結(jié)合物原液混合后加入無(wú)菌無(wú)熱原注射用水稀釋，加入適量乳糖作為賦形劑，除菌過(guò)濾后凍干。每人份含傷寒Vi多糖、甲型副傷寒O-SP多糖均不低于10ug。實(shí)施例6。I.毒性逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)合物原液用ρΗ7· O 7. 4的PBS稀釋至7 IOLf/ml，37°C放置42天，注射250 350g體重的健康豚鼠4只，每只皮下注射5ml，于注射后第7天、14天、21天進(jìn)行觀察，動(dòng)物不得有破傷風(fēng)癥狀，到期每只動(dòng)物體重比注射前增加者判為合格。傷寒Vi-TT結(jié)合物毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，甲型副傷寒O-SP-TT結(jié)合物毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表I傷寒Vi-TT結(jié)合物毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗，其特征在于，包括傷寒Vi多糖和甲型副傷寒菌體特異多糖0-SP。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗，其特征在于所述傷寒Vi多糖和甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP均與載體蛋白形成結(jié)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗，其特征在于所述載體蛋白為破傷風(fēng)類毒素。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗，其特征在于所述疫苗含傷寒Vi多糖和甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP均不低于每人份10ug。
5.一種制備權(quán)利要求1-4任一所述傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗的方法，包括以下步驟， 1)精制傷寒Vi多糖傷寒沙門氏菌種經(jīng)甲醛殺菌后，高速離心去除菌體，上清液中加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻形成沉淀，離心收集沉淀物，用CaCl2溶液解離，再用乙醇沉淀制得粗制品；將粗制品溶解于10%飽和醋酸鈉溶液中，然后用冷酚提取，離心收集上清液，并用O. lmol/L氯化鈣溶液透析；再加乙醇至最終濃度為75 80% (V / V);離心收集沉淀物，洗滌后離心，棄上清，溶解沉淀的多糖，得精制傷寒Vi多糖； 2)制備甲型副傷寒菌體特異多糖0-SP:甲型副傷寒沙門氏菌種經(jīng)甲醛殺菌后，高速離心收集菌體，熱酚法粗制菌體中的副甲脂多糖；再用低溫乙醇沉淀法精制副甲脂多糖，然后將副甲脂多糖以10mg/ml濃度溶解于1%醋酸溶液中，沸水浴后冷卻，離心棄沉淀，透析上清，再以低溫乙醇沉淀法收集沉淀，經(jīng)分子篩層析法純化； 3)制備傷寒Vi多糖-載體蛋白結(jié)合物衍化載體蛋白；將精制傷寒Vi多糖溶液加入碳二亞胺，然后加入衍化的載體蛋白，維持PH在5. 75進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，然后調(diào)pH至中性終止反應(yīng)，反應(yīng)物在生理鹽水中透析過(guò)夜，過(guò)層析柱純化，得傷寒Vi多糖-載體蛋白結(jié)合物； 4)制備甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP-載體蛋白結(jié)合物用己二酰肼與甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP進(jìn)行連接反應(yīng)，制得O-SP-AH衍生物，將其與載體蛋白混合，加入碳二亞胺進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)超濾膜超濾去除小分子物質(zhì)，過(guò)層析柱純化，得甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP-載體蛋白結(jié)合物； 5)制備成品將傷寒菌體莢膜多糖-載體蛋白結(jié)合物原液與甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP-載體蛋白結(jié)合物原液混合后加入高壓滅菌后的注射水及乳糖，除菌過(guò)濾后凍干。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于制備傷寒Vi多糖-載體蛋白結(jié)合物的步驟中，載體蛋白衍化度為I. 0-3. 0%，傷寒莢膜多糖蛋白終濃度為2-3mg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于制備甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP-載體蛋白結(jié)合物的步驟中，甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP的衍化度為I. O 3.0%。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于制備甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP-載體蛋白結(jié)合物的步驟中，所述結(jié)合反應(yīng)的pH控制在5. O 5. 5，反應(yīng)3小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于制備甲型副傷寒菌體特意多糖O-SP-載體蛋白結(jié)合物的步驟中，所述層析柱為瓊脂糖4FF柱。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種傷寒甲型副傷寒結(jié)合疫苗，包括傷寒Vi多糖和甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP。本發(fā)明還公開(kāi)了該疫苗的制備方法，包括制備傷寒Vi多糖、制備甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP、制備傷寒Vi多糖-載體蛋白結(jié)合物、制備甲型副傷寒菌體特異多糖O-SP-載體蛋白結(jié)合物及制備成品的步驟。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明能誘導(dǎo)出高水平的抗傷寒Vi多糖、抗甲型副傷寒LPS抗體，且具有免疫記憶反應(yīng),并無(wú)急性毒性反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61P31/04GK102935226SQ20121046410
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者周富昌, 陳宣洪, 周家富, 任曉莉, 朱少軍 申請(qǐng)人:羅益(無(wú)錫)生物制藥有限公司