專利名稱：兔出血癥病毒新型亞單位疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥高技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種兔出血癥病毒新型亞單位疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)俗稱“兔痕”,是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種急性高致死性兔傳染病。本病具有病死率高、死亡快,而且傳播迅速等特點(diǎn)，對養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅，因而被國際獸疫局正式列為“國際動物保健編目”B類傳染病，我國農(nóng)業(yè)部也將之列為二類動物疫病。兔出血癥病毒(RHDV)被劃歸到可以引起動物和人廣泛疾病的嵌杯病毒科中，其基因組是一種單股正鏈的RNA分子，基因組長約7437bp,含有兩個(gè)開放閱讀框架(Open Read Frames),分別編碼多個(gè)蛋白，其中衣 殼蛋白是RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，分子量約為60Kd。因此，該蛋白又稱為VP60。研究證明，RHDV的衣殼蛋白在沒有其它任何成分存在的情況下，可自然聚合成不包裹核酸的、與天然RHDV病毒粒子在物理形態(tài)上類似的病毒樣顆粒(virus-like particles, VLPs),擁有立體構(gòu)象，能夠模擬完整病毒粒子誘導(dǎo)宿主的免疫系統(tǒng)。兔病毒性出血癥(RHD)第一次大流行于1984年出現(xiàn)在中國(Liu，S. J. ,H. P. Xue,B. Q. Pu, and S. H. Qian. , 1984, A new viral disease in rabbits. . Anim. Husb. Vet. Med,16,253-255)。該病在9個(gè)月內(nèi)迅速波及中國各地的家兔，造成了 1400萬只家兔死亡。隨后,兔出血癥病毒(RHDV)在歐洲、中東和亞洲擴(kuò)散開來。到20世紀(jì)90年代后期，已經(jīng)在40多個(gè)國家有本病的報(bào)道。1995年，RHD在澳大利亞南部海岸的Wardang島爆發(fā)，由于防制措施不力，造成了 8個(gè)月內(nèi)1000多萬只家兔及野兔死亡的慘劇。自1988年以來，該病毒已經(jīng)在許多野兔種群中適應(yīng)。目前，RHD已蔓延至我國大多數(shù)省、市和地區(qū)，給我國養(yǎng)兔業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，被視為養(yǎng)兔業(yè)的“頭號殺手”。目前，用于預(yù)防和控制RHD疫情的疫苗主要是以發(fā)病兔內(nèi)臟組織為原材料的組織滅活疫苗。這種疫苗具有良好的免疫效果，20多年來，該疫苗在RHD疫情的控制方面發(fā)揮了重要作用。但目前隨著家兔飼養(yǎng)成本的提高以及非免疫兔的減少，可用于制苗的肝組織日趨減少，使組織滅活苗的成本不斷增加，加之組織滅活苗本身所不可避免的種種缺點(diǎn)和不足，如生產(chǎn)安全難以保證，時(shí)刻存在散毒的危險(xiǎn)，以及該種疫苗對于變異了的兔瘟病毒預(yù)防效果不理想，有可能造成免疫失敗等。人們逐漸將目光投向新型疫苗，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)開展兔瘟新型疫苗的研究將是RHDV應(yīng)用研究的一個(gè)必然趨勢。在兔痕新型疫苗研究方面，國外開展的比較早。1994年，Boga等(Boga JA,Casais R，M arin M S，et al. Mo lecular cloning，sequencing and exp ression inEscherich iaco Ii of thecap sid p ro tein gene from rabbit haemo rrhagic diseasevirus (Spanish isolate A ST/89). J Gen V iro 1，1994，75 :240922413)率先將 RHDV 的VP60在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)兔體產(chǎn)生特異性抗體，但是不能對抗致死劑量兔痕病毒的攻擊。后來，Laurent 等(L aurent S，Kut E，Remy2Delaunay S，et al. FoIding of the rabbit hemo rrhagic disease virus cap sid p ro tein and delineationof N—term inal domains dispensable fo r assembly. A rch ives of Virology，2002，147 :155921571.)選用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)VP60，經(jīng)ELISA、Western-blot分析及電鏡形態(tài)觀察，表達(dá)的衣殼蛋白可自我裝配成VLPs，并且與天然病毒的形態(tài)和抗原性非常相似。動物試驗(yàn)結(jié)果顯示，由表達(dá)產(chǎn)物激發(fā)的中和性抗體能為兔子提供足夠的保護(hù)，說明VLPs有可能作為一種新型疫苗代替?zhèn)鹘y(tǒng)組織滅活疫苗。近年來，F(xiàn)arn0s等(Farn0s O,Boue 0，Parra F，et al. High-level expression and immunogenic properties of therecombinant rabbit hemorrhagic disease virus VP60 capsid protein obtained inPichia pastoris [J] · J. Biotech，2005，117 (3)，215-224.)又用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了 VP60。其試驗(yàn)結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物不僅在抗原性上與天然病毒相近，在形態(tài)上也與天然病毒十分相似，將表達(dá)產(chǎn)物作為抗原，與免疫佐劑一起接種試驗(yàn)動物，可以對抗強(qiáng)毒的攻擊。1999年。Castanon 等(Castanon，S.，Marin, M. S.，Martin-Alonso，J. M.，Boga, JA.，Casais， R.，Humara, J. M.，Ordas, R. J.，Parra, F. , 1999, Immunization with potato plantsexpressing VP60 protein protects against rabbit hemorrhagic disease virus.JVirol 73,4452-4455)嘗試將VP60基因轉(zhuǎn)入植物進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果他獲得了能表達(dá)RHDVVP60的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。將馬鈴薯飼喂兔子，結(jié)果也能為兔子提供一定的保護(hù)。但VP60的最終表達(dá)量偏低，直接飼喂動物達(dá)不到預(yù)期的免疫效果。我國在兔瘟新型疫苗研究方面開展的比較晚，目前還主要集中于個(gè)別毒株的基因組測序、結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)和監(jiān)測方法的建立等等方面。如嚴(yán)維巍等(嚴(yán)維巍，崔治中，王永坤.中國株兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其免疫原性鑒定。中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，23 :447-449.)、王永山等(王永山，陸承平，周宗安，薛家賓.原核表達(dá)的兔出血癥病毒衣殼蛋白對兔的免疫保護(hù)效果。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37 (11) :1677-1681)、劉懷然等(劉懷然，胡迎東，陳洪巖，張齡，李昌文，關(guān)云濤，曲連東.兔出血癥病毒VP60蛋白的原核表達(dá)及檢測方法初步應(yīng)用.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，28 :201-203.)先后用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了 RHDV的VP60基因，免疫學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明所表達(dá)的VP60蛋白具有一定免疫學(xué)活性。近年來，揚(yáng)州大學(xué)的嚴(yán)維巍(嚴(yán)維巍，崔治中，王永坤。在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)能自聚成病毒樣顆粒的兔出血癥病毒衣殼蛋.病毒學(xué)報(bào),2004，4(4) :135-8.)和浙江農(nóng)科院的陳柳等(陳柳，云濤，劉光清等.兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)和定位.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22 (2) =135-139)等又用桿狀病毒和酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了 VP60蛋白，獲得了與天然RHDV病毒粒子相似的病毒樣顆粒，免疫動物后都能有效保護(hù)動物抵抗RHDV的攻擊，為研制RHDV新型疫苗帶來了希望。盡管如此，迄今還沒有商品化的RHDV基因工程疫苗問世，其重要原因之一是VP60在上述表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量不夠高，需要大量表達(dá)抗原，并進(jìn)行濃縮和純化，增加了疫苗的生產(chǎn)成本，限制了基因工程疫苗的實(shí)際應(yīng)用。因此，如何提高抗原的表達(dá)量，降低疫苗的生產(chǎn)成本已成為科研工作者亟待解決的問題之一。綜上所述，本領(lǐng)域急切需求表達(dá)量高、安全性好、免疫效價(jià)高的優(yōu)質(zhì)疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種安全、新型、免疫效果好、適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗，該疫苗融合了兔出血癥病毒保護(hù)性抗原組分和通用Th細(xì)胞表位，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生良好免疫應(yīng)答，可以用于預(yù)防兔出血癥感染性疾病。本發(fā)明同時(shí)還提供上述疫苗的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，該重組表達(dá)質(zhì)粒含有一個(gè)包括下列元件的融合編碼基因(I)兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)A，該優(yōu)勢抗原區(qū)A為兔出血癥病毒衣殼蛋白核苷酸序列的第31位-250位氨基酸，如SEQ ID NO 1所示；(2)兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)B，該優(yōu)勢抗原區(qū)B為兔出血癥病毒衣殼蛋白核苷酸序列的第475位-579位氨基酸，如SEQ ID NO 2所示。優(yōu)選地,所述的重組表達(dá)質(zhì)粒的原始質(zhì)粒是pET_30a。 優(yōu)選地，所述的融合編碼基因還包括如下元件編碼序列為SEQ ID N0:3所示的Th通用細(xì)胞表位，所述的融合編碼基因是由插入元件按A-B-Th順序串聯(lián)而成。一種兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，該重組表達(dá)質(zhì)粒含有一個(gè)由下列元件組成的融合編碼基因(I)兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)A，該優(yōu)勢抗原區(qū)A為兔出血癥病毒衣殼蛋白核苷酸序列的第31位-250位氨基酸，如SEQ ID NO 1所示；⑵連接肽GGGGS;(3)兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)B，該優(yōu)勢抗原區(qū)B為兔出血癥病毒衣殼蛋白核苷酸序列的第475位-579位氨基酸，如SEQ ID NO 2所示；(4)編碼序列為SEQ ID NO : 3所示的Th通用細(xì)胞表位；(5)編碼序列為SEQ ID NO :4所示的連續(xù)6個(gè)組氨酸編碼序列，其中所述的融合編碼基因是由插入兀件按A-B-Th順序串聯(lián)而成。優(yōu)選地,所述的重組表達(dá)質(zhì)粒的原始質(zhì)粒是pET_30a。一種兔出血癥病毒新型亞單位疫苗，該疫苗是由上述任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化靶細(xì)菌后表達(dá)得到的融合蛋白，所述融合蛋白不包裹有任何核苷酸。優(yōu)選地，所述的靶細(xì)菌為來源于大腸桿菌的宿主細(xì)菌。一種兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的制備方法，包括以下步驟(I)將上述任一項(xiàng)所述的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入靶細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化；(2)當(dāng)轉(zhuǎn)化的靶細(xì)菌培養(yǎng)至0D600值為O. 5時(shí)，加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)，在30°C下培養(yǎng)4小時(shí)，收集誘導(dǎo)細(xì)菌；(3)將收集的誘導(dǎo)細(xì)菌超聲破壁，并收集包涵體；(4)溶解上述包涵體，用包涵體粗純的方法進(jìn)行純化；(5)用洗液I、洗液II洗滌包涵體，所述洗液I為2M尿素+0. I %聚乙二醇辛基苯基醚(TritonlOO)+50mM氯化鈉(NaCl)+0. 2mM乙二胺四乙酸(EDTA) +磷酸鹽緩沖液(PBS)，所述洗液II為2M尿素+0. 1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonlOO) +磷酸鹽緩沖液(PBS)；(6)用尿素溶解步驟(5)洗滌后的包涵體，并經(jīng)透析處理后得到所需的兔出血癥
病毒亞單位疫苗。
一種上述的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗在用于制備預(yù)防兔出血癥的藥物中的用途。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下(I)該疫苗融合了兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)域和通用Th細(xì)胞表位，既可以刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答,又能刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答；(2)可以用于預(yù)防兔出血癥病毒感染性疾??；(3)表達(dá)量高，生產(chǎn)成本低，免疫效果好。當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點(diǎn)。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例制備的重組表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定的電泳檢測圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例制備的融合蛋白Western blot檢測圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例制備的融合蛋白SDS-PAGE電泳圖；圖4為構(gòu)建本發(fā)明的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的策略示意圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗刺激兔子體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體后，實(shí)驗(yàn)組與對照組在λ 450ηπι處測定每孔的OD值的對比圖；圖6為本發(fā)明實(shí)施例的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗刺激兔子淋巴細(xì)胞增值后，實(shí)驗(yàn)組與對照組在λ 570nm處測定OD值的對比圖；圖7為本發(fā)明實(shí)施例的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗刺激兔子分泌IFN- Y，實(shí)驗(yàn)組與對照組在λ 450nm處測定每孔的OD值的對比圖；圖8為本發(fā)明實(shí)施例的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗刺激兔子分泌IL-4，實(shí)驗(yàn)組與對照組在λ 450nm處測定每孔的OD值的對比圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。本發(fā)明提供一種兔出血癥病毒亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，該重組表達(dá)質(zhì)粒包括下列元件的融合編碼基因(I)兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)A,該優(yōu)勢抗原區(qū)A為兔出血癥病毒衣殼蛋白核苷酸序列的第31位-250位氨基酸，如SEQ ID NO 1所示；(2)兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)B，該優(yōu)勢抗原區(qū)B為兔出血癥病毒衣殼蛋白核苷酸序列的第475位-579位氨基酸，如SEQ ID NO 2所示。該重組表達(dá)質(zhì)粒的原始質(zhì)?？梢允?pET_30a。優(yōu)選地，上述融合編碼基因還可包括如下元件編碼序列為SEQ ID NO :3所示的Th通用細(xì)胞表位，所述的融合編碼基因是由插入元件按A-B-Th順序串聯(lián)而成，從而得到另外一個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒，該重組表達(dá)質(zhì)粒含有一個(gè)由下列元件組成的融合編碼基因(I)兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)A，該優(yōu)勢抗原區(qū)A為兔出血癥病毒衣殼蛋白核苷酸序列的第31位-250位氨基酸，如SEQ ID NO :1所示；(2)連接肽=GGGGS ； (3)兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)B，該優(yōu)勢抗原區(qū)B為兔出血癥病毒衣殼蛋白核苷酸序列的第475位-579位氨基酸，如SEQ ID NO 2所示；⑷編碼序列為SEQ ID NO 1所示的Th通用細(xì)胞表位；(5)編碼序列為SEQ ID NO :2所示的連續(xù)6個(gè)組氨酸編碼序列，其中上述融合編碼基因是由插入元件按A-B-Th順序串聯(lián)而成。上述兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，其原始質(zhì)粒是pET_30a。所述的融合編碼基因是由插入兀件按A-B-Th順序串聯(lián)，A-B-Th的序列是由上海捷瑞生物工程公司合成后，利用限制性內(nèi)切酶Kpn I和HindIII將其插入pET_30a中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET/ABTh。AB基因序列由上海捷瑞生物工程公司合成后，利用限制性內(nèi)切酶Kpn I和HindIII將其插入pET-30a中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET/AB。優(yōu)勢抗原區(qū)A序列是SEQ ID NO:I所示的兔出血癥病毒衣殼蛋白(VP60)的核苷酸序列的第31位-250位氨基酸。優(yōu)勢抗原區(qū)B序列是SEQ ID NO :2所示的兔出血癥病毒衣殼蛋白(VP60)的核苷酸序列的第475位-579位氨基酸。Th通用細(xì)胞表位序列是SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。上述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化靶細(xì)菌后表達(dá)后得到的融合蛋白不包裹有任何核苷酸。
實(shí)施例兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的制備，包括如下的步驟第一步兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒的制備步驟如下I)將兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-ABTh(該重組表達(dá)質(zhì)粒系采用上述的方法人工合成，其外源基因分別含有RHDV的優(yōu)勢抗原區(qū)A、優(yōu)勢抗原區(qū)B和通用T細(xì)胞表位Th)和不帶T細(xì)胞表位Th的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-AB (該重組質(zhì)粒系采用上述的方法人工合成，其外源基因分別含有RHDV的優(yōu)勢抗原區(qū)A和優(yōu)勢抗原區(qū)B)分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21宿主細(xì)菌，混勻，冰浴放至30min，42°C水浴中熱激90S后迅速置冰上2min，然后涂布于卡那抗性平板中，12h后挑取菌落并搖菌；2)將步驟I)得到的菌液利用AxyPrep DNA質(zhì)粒抽提試劑盒抽提重組表達(dá)質(zhì)粒；3)重組表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定根據(jù)pET-ABTh和pET_AB載體上的酶切位點(diǎn)，將步驟2)抽提的重組表達(dá)質(zhì)粒用Kpn I、HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切體系如下
重組廣枝 EmL
f lox麗ω
IOuL J Kpn IIuL
I HindIlIIuL
、ddftO2uL酶切反應(yīng)體系為10 μ L，37°C水浴2h。之后用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，鑒定結(jié)果如圖1，樣品條帶大小與pET-30a載體(圖l，5422bp)和目的基因(圖l，936bp)大小一致，初步判定重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。4)上述重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)Invitrogen公司測序顯示,結(jié)果完全正確,說明成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒。第二步重組表達(dá)質(zhì)粒在原核細(xì)胞中的表達(dá)取兩管_80°C保存的感受態(tài)細(xì)胞，置冰上融化；分別加入上述制備的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-ABTh和pET-AB，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30min ;將離心管置于42°C熱擊60-90秒，然后迅速置冰浴2-3分鐘；再向每個(gè)離心管中加入500ul液體LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后置于37°C搖床振蕩培養(yǎng)45分鐘(150轉(zhuǎn)/分鐘)。將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100 μ I已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含50 μ g/ml卡那霉素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕將細(xì)胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37°C培養(yǎng)12-16小時(shí)，并挑取含重組表達(dá)質(zhì)粒的菌體單斑至含有Kan+的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12h ;按照1%的比例再轉(zhuǎn)接種于新的含有Kan+的LB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)2. 5h，當(dāng)轉(zhuǎn)化的靶細(xì)菌培養(yǎng)至0D600值為O. 5時(shí)，加入終濃度為ImM的誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)，30°C震蕩培養(yǎng)4h，然后取菌液，離心后收集沉淀，該沉淀即為融合蛋白。用10% SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝膠)對得到的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，并用Western Blot對得到的融合蛋白進(jìn)行鑒定，如圖2顯示，其位置出現(xiàn)特異性蛋白條帶，說明重組蛋白得到了表達(dá)。其中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，pET-AB代表兔出血癥病毒衣殼蛋白優(yōu)勢抗原區(qū)A和B的融合表達(dá)產(chǎn)物，pET-ABTh代表融合有Th表位以及兔出血癥病毒衣殼蛋白優(yōu)勢抗原區(qū)A和B的融合蛋白。 第三步融合蛋白的純化采用包涵體粗純蛋白的一般方法進(jìn)行I)將上述離心收集的細(xì)菌沉淀用IOml 20mM tris_HCl(PH = 8)重懸；2)向上述重懸液中加入IOOul終濃度為lmg/ml的溶菌酶，37°C孵育30min ；3)將上述重懸液反復(fù)凍融3次后，超聲破碎至溶液不粘稠；然后IOOOOrpm離心20min,棄上清液得到包涵體；4)先后用洗液I(2M 120g尿素+Iml O. 1%聚乙二醇辛基苯基醚tritonlOO+2. 92g50mM氯化鈉NaCl+0. 05g 0. 2mM乙二胺四乙酸EDTA+lOOOml磷酸鹽緩沖液PBS)和洗液II(120g2M尿素+Iml O. I %聚乙二醇辛基苯基醚tritonlOO+lOOOml磷酸鹽緩沖液PBS)依次洗滌上述包涵體；5)將步驟4)得到的洗滌純化的包涵體溶解于8mol/L尿素中，溶解的包涵體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，電泳結(jié)果如圖3所示，融合蛋白pET-AB和pET-ABTh均得到了良好表達(dá)，其分子量為35. 3KD。將溶解的包涵體裝入處理過的透析袋中，在磷酸鹽緩沖液PBS中進(jìn)行透析，每隔2h換I次PBS，最后透析12h (整個(gè)透析過程在冰上進(jìn)行)，透析處理后得到所需的用于制備兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的抗原，即兔出血癥病毒新型亞單位疫苗。兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的效果檢測，包括如下幾個(gè)方面第一兔出血癥病毒新型亞單位疫苗在兔子體內(nèi)免疫反應(yīng)的特異性抗體檢測將12只兩月齡兔子隨機(jī)分為3組，每組4只，其中一組免疫重組表達(dá)質(zhì)粒pET-ABTh表達(dá)的融合蛋白，另一組免疫重組表達(dá)質(zhì)粒pET-AB表達(dá)的融合蛋白，最后一組免疫PBS (磷酸鹽緩沖液)，免疫方法為肌肉注射免疫兩次，每次間隔兩周。在第一次免疫后第2周、第二次免疫后第2周，對免疫組pET-ABTh、pET-AB和對照組PBS的兔子進(jìn)行耳靜脈采血，血液于37°C放置lh，再置于4°C放置12h，然后離心后分離得到血清，以間接ELISA法測定血清抗體的0D450值，具體為以RHDV-VP60原核表達(dá)蛋白為包被抗原(5 μ g/孔)于96孔酶標(biāo)板上測定，被檢兔子血清為一抗，過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG (購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)為二抗，同時(shí)設(shè)立不加被檢血清的空白對照，顯色終止后，于λ 450ηπι處測定每孔的OD值，SAS統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果參見表I和圖5，該結(jié)果顯示免疫組與對照組比較差異顯著，免疫組可以獲得好的免疫效果，從體液水平上則說明，免疫組中攜帶Th通用表位的新型亞單位疫苗的免疫效果更好。表I特異性抗體檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，該重組表達(dá)質(zhì)粒含有一個(gè)包括下列元件的融合編碼基因 (1)兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)A，該優(yōu)勢抗原區(qū)A為兔出血癥病毒衣殼蛋白核苷酸序列的第31位-250位氨基酸，如SEQ ID NO 1所示； (2)兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)B，該優(yōu)勢抗原區(qū)B為兔出血癥病毒衣殼蛋白核苷酸序列的第475位-579位氨基酸，如SEQ ID NO 2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述的重組表達(dá)質(zhì)粒的原始質(zhì)粒是pET-30a。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述的融合編碼基因還包括如下元件編碼序列為SEQ ID NO :3所示的Th通用細(xì)胞表位，所述的融合編碼基因是由插入元件按A-B-Th順序串聯(lián)而成。
4.一種兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，該重組表達(dá)質(zhì)粒含有一個(gè)由下列元件組成的融合編碼基因 (1)兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)A，該優(yōu)勢抗原區(qū)A為兔出血癥病毒衣殼蛋白核苷酸序列的第31位-250位氨基酸，如SEQ ID NO 1所示； (2)連接肽=GGGGS； (3)兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)B，該優(yōu)勢抗原區(qū)B為兔出血癥病毒衣殼蛋白核苷酸序列的第475位-579位氨基酸，如SEQ ID NO 2所示； (4)編碼序列為SEQID NO : 3所示的Th通用細(xì)胞表位； (5)編碼序列為SEQID NO :4所示的連續(xù)6個(gè)組氨酸編碼序列，其中所述的融合編碼基因是由插入兀件按A-B-Th順序串聯(lián)而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述的重組表達(dá)質(zhì)粒的原始質(zhì)粒是pET-30a。
6.一種兔出血癥病毒新型亞單位疫苗，其特征在于，該疫苗是由權(quán)利要求1-3或權(quán)利要求4-5中任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化靶細(xì)菌后表達(dá)得到的融合蛋白，所述融合蛋白不包裹有任何核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗，其特征在于，所述的靶細(xì)菌為來源于大腸桿菌的宿主細(xì)菌。
8.一種兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將權(quán)利要求1-3或權(quán)利要求4-5中任一項(xiàng)所述的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入靶細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化； (2)當(dāng)轉(zhuǎn)化的靶細(xì)菌培養(yǎng)至0D600值為O.5時(shí)，加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)，在30°C下培養(yǎng)4小時(shí)，收集誘導(dǎo)細(xì)菌； (3)將收集的誘導(dǎo)細(xì)菌超聲破壁,并收集包涵體； (4)溶解上述包涵體，用包涵體粗純的方法進(jìn)行純化； (5)先后用洗液I、洗液II洗滌包涵體，所述洗液I為2M尿素+0.I %聚乙二醇辛基苯基醚Tritonl00+50mM氯化鈉+0. 2mM乙二胺四乙酸EDTA+磷酸鹽緩沖液PBS，所述洗液II為2M尿素+0. I %聚乙二醇辛基苯基醚TritonlOO+磷酸鹽緩沖液PBS ； (6)用尿素溶解步驟(5)洗滌后的包涵體，并經(jīng)透析處理后得到所需的兔出血癥病毒亞單位疫苗。
9.一種權(quán)利要求6或7所述的兔出血癥病毒新型亞單位疫苗在用于制備預(yù)防兔出血癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種兔出血癥病毒新型亞單位疫苗的重組表達(dá)質(zhì)粒，所述的重組表達(dá)質(zhì)粒中含有一個(gè)包括下列元件的融合編碼基因(1)如SEQ ID NO1所示的兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)A，(2)如SEQ ID NO2所示的兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)B，優(yōu)選的，上述融合編碼基因還包括編碼序列為SEQ ID NO3所示的Th通用細(xì)胞表位，所述的融合編碼基因是由插入元件按A-B-Th順序串聯(lián)而成。本發(fā)明的疫苗融合了兔出血癥病毒的優(yōu)勢抗原區(qū)域和通用Th細(xì)胞表位，既可以刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，又能刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，可以用于預(yù)防兔出血癥病毒感染性疾病，該疫苗安全、免疫效果好，適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61K39/12GK102943087SQ20121048844
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月26日
發(fā)明者劉光清, 程英杰, 孟春春, 陳宗艷, 李傳峰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所