專利名稱：：支原體亞單位疫苗的制作方法支原體亞單位疫苗本發(fā)明特別涉及對抗支原體感染的疫苗，涉及用在這些疫苗中的支原體L-ot-甘油磷酸氧化酶，涉及支原體L-a-甘油砩酸氧化酶生產(chǎn)這些疫苗的用途，涉及這些疫苗的制備方法并且涉及診斷性測試，所述診斷性測試用來識別接種所述疫苗的動(dòng)物以及接種了全細(xì)胞疫苗的動(dòng)物或遭受野外感染的動(dòng)物。在進(jìn)化過程中，病原性細(xì)菌已經(jīng)發(fā)展出與其宿主的復(fù)雜相互作用。這經(jīng)常包括獲得致病島、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或原噬菌體上的毒力因子，讓它們在宿主內(nèi)定殖、存活并復(fù)制。相反地，支原體物種，最小的自我復(fù)制生物，通過將基因組減小到最小的大小而由革蘭氏陽性細(xì)菌退行演化，結(jié)果使得它們的遺傳資源得以有效利用。支原體物種代表在地球上檢測到的最小自我復(fù)制生物。它們的基因組從生殖道支原體(y炒C(/7/fl^7age/z/"/i咖)中的580千堿基對(kb)(Fraser，C.M.etal,，1995，Science270:397-403)到穿透支原體(妙卿7as邁a/e/7"rs/2s)中的1358kb(Sasaki,Y.etal，2002，NucleicAcidsRes.30:5293-5300)。這導(dǎo)致遺傳資源的極端節(jié)約和專性寄生生活方式。病原性支原體物種主要引發(fā)人和動(dòng)物的非典型性肺炎，泌尿生殖器感染和關(guān)節(jié)炎(Baseman,J.B.，和J.G.Tully，1997，Emerg.Infect.Dis.3:21-32,Blanchard，A.,和G.F.Browning(eds.).2005.Mycoplasmas:Molecularbiology,pathogenicityandstrategiesforcontrol.HorizonBioscience,Wymondham，U.K.,Frey，J.2002.MycoplasmasofAnimals,p.73-90.InS.Razin和R.Hernnarm(eds.),MolecularbiologyandpathogenicityofMycoplasmas.KluwerAcademic/PlenumPublishers,NewYork)。這里強(qiáng)調(diào)的是由于已知有支原體物種感染人類(例如生殖道支原體，肺炎支原體(l/wez/邁o/2/se))，牛物種(例如支原體物種牛7型sp6oW/e7))，豬(例如豬肺炎支原體(#yCO/7/flS/37fl力yop/7e"iZ70/7/ae))或家禽(例如雞敗血支原體(#^///M/7〃'C咖))，當(dāng)在本文中提到動(dòng)物時(shí)，這應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為特別包括人類、牛物種、豬和家禽等。如通過八個(gè)完全測序物種的基因組序列分析所揭示，與毒力主要由毒素、侵襲素和溶細(xì)胞素所決定的其它病原性細(xì)菌相反，病原性支原體物種似乎沒有這些典型的主要毒力因子(Chambaud，I.etal，2001，NucleicAcidsRes.29:2145-2153，F(xiàn)raserETAL.，1995，Science270:397-403，Himmelreich，R.etal.，1996，NucleicAcidsRes.24:4420-4449，Jaffe，J.D.etal，2004，Ge腦eRes.14:1447-1461，Minion，F(xiàn).C.etal.，2004，J.Bacteriol.186:7123-7133，Papazisi，L.etal，2003，Microbiology149:2307-2316，Sasaki,Y.etal.，2002，NucleicAcidsRes.30:5293-5300，Westberg，J.etal.，2004，GenomeRes.14:221-227)。盡管支原體感染的診斷自從引入PCR方法以來得到顯著改進(jìn)并且在幾種支原體物種中詳細(xì)研究了抗原性變化，但目前對于使得病原性支原體引發(fā)宿主細(xì)胞損傷、炎癥和疾病的分子機(jī)制和效應(yīng)物知之甚少。所以，非常需要發(fā)展特別旨在預(yù)防這些有害效應(yīng)的疫苗。本發(fā)明的目標(biāo)是提供對抗支原體感染的疫苗，其避免或減少宿主細(xì)胞損傷、炎癥和疾病。令人吃驚的是，發(fā)現(xiàn)一種新的主要毒力因子是支原體細(xì)胞損害的重要原因。這種毒力因子似乎由毒性副產(chǎn)物如HA和其它伴隨的活性氧物質(zhì)(ROS)組成?？梢燥@示H202/ROS的形成可以與支原體L-a-甘油磷酸氧化酶(GlpO)的活性直接相關(guān)，所述酶涉及甘油的代謝。更加出乎意料地，可以證明H202/ROS的形成是支原體感染引發(fā)的組織損傷的主要(如果不是唯一)原因。這意味著現(xiàn)在第一次定義了支原體的主要毒力因子。支原體中的甘油代謝途徑不能被輕易地影響或改變，所以，照這樣，H202/R0S的形成不能輕易地通過改造支原體中的甘油代謝途徑來改變。所以，與非支原體物種中的情形相反，開發(fā)活的減毒支原體的途徑似乎不太可行。不過，現(xiàn)在令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，與支原體L-oc-甘油磷酸氧化酶反應(yīng)的抗體能夠?qū)202/ROS的產(chǎn)生遏制到對于受感染動(dòng)物的組織產(chǎn)生極少或完全沒有損害的程度。這打開了用特別是亞單位疫苗進(jìn)行疫苗接種的途徑，下面進(jìn)行解釋。鑒于在所有非支原體細(xì)菌中在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)具有甘油磷酸氧化酶活性的酶這一事實(shí)，這還要更加令人吃驚，因?yàn)樵谶@些細(xì)胞中的過氧化氫酶在仏02形成后立即將其降解。因而在這些情況下，針對甘油磷酸氧化酶的抗體沒有任何作用，因?yàn)樗鼈儾荒苓M(jìn)入細(xì)菌?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)與所有非支原體細(xì)菌相反，并且顯然作為缺少過氧化氫酶的結(jié)果，支原體在進(jìn)化過程中已經(jīng)將其支原體L-cc-甘油磷酸氧化酶由細(xì)胞內(nèi)空間轉(zhuǎn)移到膜上，以此方式它導(dǎo)致細(xì)胞外[1202的產(chǎn)生。所以這對細(xì)菌無害，但現(xiàn)在變得對受感染宿主的組織有害。這可能解釋對于支原體來說，針對支原體L-a-甘油磷酸氧化酶的抗體(與其它細(xì)菌相反)出乎意料地確實(shí)干擾釋放細(xì)胞外HA的酶活性。支原體酶支原體L-a-甘油磷酸氧化酶存在于所有已知的支原體物種中。所有關(guān)于L-a-甘油磷酸氧化酶的進(jìn)一步表述都指支原體L-a-甘油磷酸氧化酶。在下表l中，EMBL/GenBank登錄號表示在下列支原體物種菌株中編碼支原體L-oc-甘油磷酸氧化酶的基因支原體物種牛7型，覃狀支原體山羊亞種zs/co/de《sy&p.Ca;r/),穿透支原體(脫pe/ze"fl/7s)，雞敗血支原體，運(yùn)動(dòng)支原體6^邊0&7e,肺支原體/7y/zz/o/7/sj,豬肺炎支原體力70iw2ewz70/3/ae,'肺炎支原體化卿層/2/seJ,生殖道支原體n^3""/u邊y。此外，在實(shí)施例中，EMBL/GenBank登錄號表示在支原體物種蕈狀支原體SC(小菌落)菌林Afad6和L2菌林中編碼支原體L-oc-甘油磷酸氧化酶的基因。由于酶支原體L-ct-甘油磷酸氧化酶存在于所有已知的支原體物種中這一事實(shí)，其用于培育針對這種蛋白質(zhì)的抗體來對抗支原體感染，更特別用來避免或減少宿主細(xì)胞損傷、炎癥和疾病的用途是普遍適用的，而不管支原體物種為何。培育針對支原體的抗體的原理將在下面實(shí)施例中進(jìn)行解釋。利用覃狀支原體蕈狀亞種i^作為模型來研究支原體毒力的分子基礎(chǔ)，所述萆狀支原體覃狀亞種SC是傳染性牛胸膜肺炎(CBPP)-—種造成家畜重大損失的嚴(yán)重的感染性疾病的病原體。覃狀支原體覃狀亞種^:是細(xì)胞外病原，具有1211kb的基因組大小(Westberg，J.etal.，2004，GenomeRes.14:221-227)，其與宿主細(xì)胞緊密關(guān)聯(lián)生活。使用這一物種作為模型的基本原理是這一物種的高毒力以及它作為CBPP病原體已清楚確證的事實(shí)。另外，這種嚴(yán)重的牛疾病對于目前遭受CBPP爆發(fā)的國家的家畜生產(chǎn)具有特別的社會經(jīng)濟(jì)學(xué)重要性。此外，沒有這種流行病的國家不斷受到再度出現(xiàn)感染的威脅。由于目前已經(jīng)確證針對支原體L-a-甘油磷酸氧化酶的抗體可以用來對抗支原體感染，更加具體地是避免或減少宿主細(xì)胞損傷、炎癥和疾病，所以下一步是使用支原體L-a-甘油磷酸氧化酶來在體內(nèi)和體外生成抗體。體內(nèi)使用支原體L-a-甘油磷酸氧化酶的實(shí)例是在疫苗中使用。當(dāng)施用時(shí)，這種疫苗誘導(dǎo)針對支原體的抗體。這將在下面詳細(xì)討論。體內(nèi)或體外使用支原體L-cx-甘油磷酸氧化酶的實(shí)例是培育抗體用在疫苗中。這種疫苗也將在下面討論。備選疫苗是基于攜帶編碼支原體L-a-甘油磷酸氧化酶(的免疫原性部分)的基因或其部分的活重組載體的疫苗，和包含編碼支原體L-a-甘油磷酸氧化酶(的免疫原性部分)的基因或其部分的DNA疫苗。由于編碼各種支原體物種中的酶支原體L-a-甘油磷酸氧化酶的序列是已知的，現(xiàn)在有可能獲得足夠量的酶支原體L-oc-甘油磷酸氧化酶。這可以例如通過利用表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)編碼這些蛋白質(zhì)的基因來實(shí)現(xiàn)。表達(dá)編碼支原體L-cc-甘油磷酸氧化酶(的免疫原性部分)的基因或其部分的基本要求是功能性連接到基因上的適當(dāng)啟動(dòng)子，從而使得基因在該啟動(dòng)子的控制之下。這可以通過例如標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)(Sambrook，J.和Russell,D.W.，Mocecularcloning:alaboratorymanual,2001.ISBN0-87969-577-3)。對于本領(lǐng)域技術(shù)錄的真核、原核或病毒啟動(dòng)子，所述細(xì)胞用作蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主細(xì)胞。功能性連接的啟動(dòng)子是能夠控制其所連接的核酸的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可以是支原體啟動(dòng)子，例如涉及編碼支原體L-a-甘油磷酸氧化酶的基因的體內(nèi)表達(dá)的啟動(dòng)子，條件是所述啟動(dòng)子在用于表達(dá)的細(xì)胞中是功能性的。它還可以是異源的啟動(dòng)子。當(dāng)宿主細(xì)胞是細(xì)菌時(shí)，可以使用的有用表達(dá)控制序列包括Trp啟動(dòng)子和操縱子(Goeddel，etal.，Nucl.AcidsRes.，8，4057，1980);lac啟動(dòng)子和操縱子(Chang,etal.,Nature,275，615，1978);外膜蛋白質(zhì)啟動(dòng)子(Nakamura，K.和Inouge，M.，EMBOJ.，1,771-775，1982);嗷菌體入啟動(dòng)子和操縱子(Remaut，E.etal.，Nucl.AcidsRes.，11，4677-4688,1983);oc-淀粉酶(枯草芽孢桿菌(A勵(lì)〃7/))啟動(dòng)子和操縱子，終止序列和其它與所選宿主細(xì)胞相容的表達(dá)增強(qiáng)和控制序列。當(dāng)宿主細(xì)胞是酵母時(shí)，有用的表達(dá)控制序列包括，例如，oc-交配因子。對于昆蟲細(xì)胞來說可以使用桿狀病毒的多角體蛋白或pio啟動(dòng)子(Smith,G.E.etal.，Mol.Cell.Biol.3，2156-65,1983)。當(dāng)宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物來源時(shí)例示性的有用表達(dá)控制序列包括SV-40啟動(dòng)子(Berman，P.W.etal.,Science,222,524-527，1983)或金屬石克蛋白啟動(dòng)子(Brinster，R.L.，Nature,296，39-42，1982)或熱'激啟動(dòng)子(Voellmyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4949-53，1985)。細(xì)菌，酵母，真菌，昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是非常常用的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)是本領(lǐng)域^>知的并且通?？色@得，例如通過Invitrogen(www.invitrogen.com)，Novagen(www.merckbiosciences.de)或ClontechLaboratories,Inc.4030FabianWay,PaloAlto,California9"03一607，USA商購。在這些表達(dá)系統(tǒng)其次，基于寄生蟲的表達(dá)系統(tǒng)是非常有吸引力的表達(dá)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)描述于例如法國專利申請公開號2714074中，和USNTIS公開號US08/043109中(Hoffman,S.和Rogers,W.:>^開日1993-12-01).然而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)用于例如接種疫苗目的或培育抗體時(shí)，不必要使用完整蛋白質(zhì)。還有可能使用該蛋白質(zhì)的片段，其(本身或偶聯(lián)到栽體如例如KLH上)能夠誘導(dǎo)針對該蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答，即所謂的免疫原性片段。據(jù)理解"免疫原性片段"是全長蛋白質(zhì)的片段，其仍然保留它在宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，即包含B-或T-細(xì)胞表位。此時(shí)，可以使用多種技術(shù)輕易地識別編碼抗原性片段(決定簇)的DNA片段。由Geysen等(專利申請W084/03564，專利申請WO86/06487，US專利NR.4,833,092，Proc.NatlAcad.Sci.81:3998-4002(1984)，J.Imm.Meth.102，259-274(1987))所述的方法-所謂PEPSCAN方法是易于實(shí)施，快速和充分確證的用于檢測表位的方法；所述表位即蛋白質(zhì)的在免疫上重要的區(qū)域。該方法在全世界使用并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這種(經(jīng)驗(yàn)式)方法尤其適于檢測B-細(xì)胞表位。另夕卜，給定編碼任何蛋白質(zhì)的基因序列，計(jì)算機(jī)算法能夠基于其與目前已知的表位的序列和/或結(jié)構(gòu)一致性指定特異性蛋白質(zhì)片段為免疫上重要的表位。這些區(qū)域的確定是基于根據(jù)Hopp和Woods的親水性標(biāo)準(zhǔn)(Proc.Natl.Acad.Sci.78:38248-3828(1981))與才艮據(jù)Chou和Fasman的二級結(jié)構(gòu)方面(AdvancesinEnzymology47:45-148(1987)和美國專利4，554，101)的組合。通過計(jì)算機(jī)輔之Berzofsky的雙親性標(biāo)準(zhǔn)(Science235，1059-1062(1987)和US專利申請NTISUS07/005，885)由序列可以類似地預(yù)測T-細(xì)胞表位。精簡的綜述見于ShanLu關(guān)于一般原理Tibtech9:238-242(1991)，Goodetal關(guān)于癡疾表位；Science235:1059-1062(1987)，Lu的綜述；Vaccine10:3-7(1992)，Berzowsky關(guān)于HIV—表位；TheFASEBJournal5:2412-2418(1991)。所以，本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案涉及用于對抗支原體感染的疫苗，其包含支原體L-oc-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段，和可藥用的載體。如下所述通過混合支原體L-ex-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段與可藥用的載體可以輕易地制成基于這些基因的表達(dá)產(chǎn)物的這些疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及支原體L-cx-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段用于疫苗中。還有另一個(gè)實(shí)施方案涉及支原體L-a-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的用途，用來生產(chǎn)對抗支原體感染的疫苗。另一種非常有吸引力的用來對抗支原體感染的疫苗接種方法是通過使用活重組載體(LRC)，其包含編碼支原體L-a-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的基因或其片段，連同可藥用的載體。這些LRC是微生物或病毒，其中已經(jīng)克隆了附加的遺傳信息，在此情況下是編碼支原體L-a-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的基因或其片段。用這些LRC感染的動(dòng)物將產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答，不僅針對栽體的免疫原，還針對將其遺傳密碼另外克隆到LRC中的蛋白質(zhì)例如支原體L-ot-甘油磷酸氧化酶的免疫原性部分。作為細(xì)菌LRC的實(shí)例，有吸引力地可以使用本領(lǐng)域已知的減毒沙門氏菌(&ko/e//a)菌林。Vermeulen,A.N.已經(jīng)特別描述了活重組載體寄生蟲(Int.Journ.Parasitol.28:1121-1130(1998))。另外，LRC病毒可以用作將核酸運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞中的途徑?；钪亟M載體病毒也稱作載體病毒。經(jīng)常用作載體的病毒是痘苗病毒(Panicalietal;Proc.Natl.Acad,Sci.USA，79:4927(1982),皰疹病毒(E.P.A.0473210A2),和逆轉(zhuǎn)錄病毒(Valerio，D.etal;inBaum，S.J.，Dicke,K.A.，Lotzova，E.和Pluznik，D.H，(Eds.)，ExperimentalHaematologytoday-1988.SpringerVerlag，NewYork:pp.92-99(1989)).本領(lǐng)域公知的體內(nèi)同源重組的技術(shù)可以用來將重組核酸導(dǎo)入選定細(xì)菌、寄生蟲或病毒的基因組，在宿主動(dòng)物中能夠誘導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明的插入核酸的表達(dá)。因而，本發(fā)明的還要另一種實(shí)施方案涉及用來對抗支原體感染的疫苗，所述疫苗包含編碼支原體L—a-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的活重組載體，以及可藥用的栽體。顯然包含在功能性連接的啟動(dòng)子控制下的編碼支原體L-a-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的基因或其片段的宿主細(xì)胞可以用來生產(chǎn)該酶。沒有必要在使用酶作為疫苗之前首先將它從宿主細(xì)胞中抽提出來宿主細(xì)胞也可以照這樣使用。在宿主細(xì)胞包含表達(dá)該酶的LRC的條件下，情況是相同的。其實(shí)例是包含病毒或細(xì)菌性LRC的真核細(xì)胞。所以，本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案涉及包含在功能性連接的啟動(dòng)子控制下的編碼支原體L-a-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的基因或其片段的宿主細(xì)胞。這種形式還涉及含有包含編碼支原體L-a-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的基因或其片段的活重組載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌來源的細(xì)胞，例如大腸桿菌(^c力er/c力/aco7/)，才古草芽抱軒菌("ac/7/ussw6"/is)和^L軒菌(^sc"6ac///i/s)物種，結(jié)合基于細(xì)菌的質(zhì)粒如pBR322，或細(xì)菌表達(dá)栽體如pGEX，或結(jié)合噬菌體。宿主細(xì)胞還可以是真核來源的，例如酵母細(xì)胞結(jié)合酵母特異性的載體分子，或較高等的真核細(xì)胞像昆蟲細(xì)胞(Luckowetal;Biotechnology6:47-55(1988))結(jié)合載體或重組桿狀病毒，植物細(xì)胞結(jié)合例如基于Ti-質(zhì)粒的載體或植物病毒載體(Barton,K.A.etal;Cell32:1033(1983)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞像Hela細(xì)胞，中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0)或Crandell貓腎細(xì)胞，也結(jié)合合適的載體或重組病毒。上述基于活重組載體的根據(jù)本發(fā)明的疫苗，例如基于感染腸上皮或例如呼吸道上皮的沙門氏菌載體或病毒載體，能夠表達(dá)酶或其免疫原性片段，具有超出亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn)，即它們更好地模擬支原體感染的天然途徑。另外，它們的自我繁殖是優(yōu)勢，因?yàn)閮H少量的重組載體是進(jìn)行免疫所必需的。接種疫苗的備選和有效方式是直接用DNA進(jìn)行疫苗接種，所述DNA編碼相關(guān)的抗原。已經(jīng)成功地對許多不同的蛋白質(zhì)用編碼蛋白質(zhì)的DNA進(jìn)行直接疫苗接種(如在例如Donnellyetal.，TheImmunologist2:20-26(1993)中所綜述的)。這種方式的疫苗接種對于針對支原體感染的哺乳動(dòng)物疫苗接種也是非常有吸引力的。所以，本發(fā)明的這一實(shí)施方案的還要另一種形式涉及對抗支原體感染的疫苗，其包含在功能性連接的啟動(dòng)子控制之下的編碼支原體L-a-甘油磷酸氧化酶的基因或編碼其免疫原性片段的所述基因的一部分，以及可藥用的栽體?？梢酝ㄟ^真皮內(nèi)應(yīng)用輕易地施用DNA疫苗，例如使用無針注射器。這種給藥方式直接將DNA遞送入待接種疫苗的動(dòng)物細(xì)胞中。介于1到100yg微克范圍的DNA量提供非常好的結(jié)果。上述疫苗全部都有助于主動(dòng)疫苗接種，即宿主的免疫系統(tǒng)被酶或其免疫原性片段所觸發(fā)，以制造針對這些蛋白質(zhì)的抗體?；蛘?，這些抗體可以在例如兔中培育或可以由如下所述的抗體生產(chǎn)細(xì)胞系中獲得。隨后這些抗體可以施用給宿主動(dòng)物。這種疫苗接種方法，被動(dòng)疫苗接種，是當(dāng)動(dòng)物已經(jīng)被感染時(shí)所選擇的疫苗接種，此時(shí)沒有時(shí)間來觸發(fā)天然的免疫應(yīng)答。它還是用來對免疫受損的動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種的優(yōu)選方法。在這些情況下施用的針對支原體的抗體可以直接結(jié)合細(xì)菌。這具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即它立即降低或停止支原體生長。所以，本發(fā)明的這種實(shí)施方案的一種其它形式涉及包含針對支原體L-a-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的抗體和可藥用載體的疫苗。在此實(shí)施方案的還要另一種形式中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗另外包含源自其它生物或病毒的一種或多種抗原(所述生物或病毒對同樣的宿主是病原性的)，抗這些抗原的抗體或編碼這些抗原的遺傳信息。毫無疑問優(yōu)選的組合疫苗是除了支原體L-a-甘油磷酸氧化酶還包含支原體全細(xì)胞制備物的疫苗。這種組合疫苗將會誘導(dǎo)保護(hù)作用，不但抗支原體L-oc-甘油磷酸氧化酶的有害作用，還抗其它支原體相關(guān)蛋白質(zhì)。在制備支原體疫苗用來保護(hù)免受豬病原性支原體物種侵害時(shí)，這些生物和病毒優(yōu)選選自偽狂犬病病毒，豬流感病毒，豬細(xì)小病毒，傳染性胃腸炎病毒，輪狀病毒，另一種支原體物種特別是豬肺炎支原體，豬痢疾短螺菌("rac力/s/7i'ra力/oc^se;UeWae),大腸桿菌(^c力er/c力/flco/i')，鉤端螺旋體屬物種，豬紅斑丹毒絲菌(fr7"》e/oMr/ir力ysy。/7"力/ae)，支氣管炎博德特氏菌("or(/"e/7fl^rar7c力2、e/^/cfl),豬^ij疾短蟲累菌(Arac//s/;/ra力yo^Fse/2fer/ae),志賀氏菌屬(幼^eih)物種，豬霍亂沙門氏菌(^/邁o/7e7/flcAo/eraesw/s),鼠4另寒沙，門氏菌(^3//z70/7e//s0^力y邁"r/w/z/)，腸炎沙門氏菌(^3//z/one7/se/^er/〃d/s)，副豬嗜血菌(^26邊0;7力//"5/7arasw/s)，j^i7R^o"ia，多殺巴斯德氏菌(戶a"e"re/Za邁""oc油)，豬鏈球菌(57r一o譜cz/s，、)，胸膜肺炎放線桿菌(爿c〃/206flc/"ws;7/euro;7/7e"邊an/ae),豬葡萄球菌(i^a/^y/ococci/s和產(chǎn)氣莢膜梭菌(67("ridiwn;ei"/Vj'/^e/3s)。當(dāng)制備用于保護(hù)對抗牛病原性支原體物種的支原體疫苗時(shí)，這些生物和病毒優(yōu)選選自牛皰疹病毒，牛病毒性腹瀉病毒，3型副流感病毒，牛副粘病毒，口蹄疫病毒，牛呼吸道合胞病毒，豬圓環(huán)病毒，豬呼吸繁殖綜合征病毒，另一支原體物種，溶血巴斯德氏菌(尸^"^^/"力ae邁o7/〃cs)，金黃色葡萄球菌(5Y一77ococcwsawrews)，大腸桿菌，鉤端^f旋體屬(^e;^0s/^i^)物種，SfapAj^oc0ccusu6er/s，小泰累爾梨漿蟲(7Te/7er/a;arM)，環(huán)狀泰累爾梨漿蟲(7%e//er/'aa加u/"a),牛巴貝蟲(Mes/a6or/s)，二聯(lián)巴貝蟲(觸es/a6/ge邁i/7a)，大巴貝蟲(&6e"'a鵬Jor)，錐蟲屬(rr，/20so邊a)物種，邊緣無形體(J/7fl/7/fl5^a/zwrg/zzfl/e)，紅血球內(nèi)生無形體(J卿7a麵ce/2tra/e)和犬新孢子蟲(腸，rac膽'/2咖)。當(dāng)制備用于保護(hù)對抗家禽病原性支原體物種的支原體疫苗時(shí)，這些生物和病毒優(yōu)選選自禽痘病毒，傳染性支氣管炎病毒，傳染性粘液囊病(Gumboro)，馬立克氏病病毒，雞貧血因子(agent)，費(fèi)-克二氏禽呼腸孤病毒，火雞鼻氣管炎病毒，雞痘病毒，禽腦脊髄炎病毒，鴨疫病毒，新城疫病毒，減蛋綜合征病毒，禽傳染性喉氣管炎病毒，火雞皰滲病毒，另一種支原體物種特別是雞敗血支原體C^co;/a礎(chǔ)a^///sep〃c"邁)或關(guān)節(jié)液支原體(妙co//as咖sj/2or/fle)，副雞嗜血菌(〃se邊o/7力i/wspflrfl^s7"/3ar咖)(Coryza)，鼻腔鳥桿菌(^nj/f力c^acfer/wz7TA//20^r<sc/efl/e)，產(chǎn)氣芙膜梭菌((77osf_r/cf2'w/z7/7er/V/i7《e/7y),沙門氏菌屬，彎曲桿菌屬(C<SiZ7/7//o^c/eiO物種，大腸桿菌和艾美球蟲屬(S/邊eWa)物種。當(dāng)制備用于保護(hù)對抗人病原性支原體物種的支原體疫苗時(shí)，這些生物和病毒優(yōu)選選自流感病毒，麻滲病毒，腮腺炎副粘病毒，"o""/咖力》力fer/ae，破傷風(fēng)梭菌(C7o""/咖f"a/n')，百日咳博德特氏菌(Aoi^eteZ/a;eH"^/s)，另一支原體物種和痘病毒。優(yōu)選地，上述支原體L-a-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段是由任何下列支原體所編碼的支原體L-oc-甘油磷酸氧化酶牛支原體(#.6on、)，支原體物種牛7型s/7."oW"e^rou;77)，萆狀支原體山羊亞種(M/z^co/^ss"6^.CapW),穿透支原體(#-pe"e"a/7力，雞敗血支原體，關(guān)節(jié)液支原體，運(yùn)動(dòng)支原體(^辺oW7e)，肺支原體(#,;^/邊0"")，豬肺炎支原體，肺炎支原體(#,/we咖o/2/se)，生殖道支原體(V.《6/2/"http://"邁)，萆狀支原體SC(小菌落)菌林Afad6或萆狀支原體SC(小菌落)菌株L2，特別是牛支原體，豬肺炎支原體，雞敗血支原體或關(guān)節(jié)液支原體，更特別是牛支原體或豬肺炎支原體。根據(jù)本發(fā)明的所有疫苗都包含可藥用的載體。可藥用的載體可以是例如無菌水或無菌生理鹽溶液。在更加復(fù)雜的形式中所述載體可以是例如緩沖液。制備疫苗的方法包括混合支原體L-ot-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段，上述活重組載體，上述基因或其部分，上述宿主細(xì)胞或針對支原體L-ct-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的抗體，以及可藥用的栽體。所以，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及制備對抗支原體感染的疫苗的方法，該方法包括混合上述支原體L-ct-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段，上述活重組栽體，上述基因或其部分，上述宿主細(xì)胞或上述針對支原體L-oc-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段的抗體，以及可藥用的載體。在優(yōu)選的方案中根據(jù)本發(fā)明的疫苗還可以包含佐劑。佐劑一般包含以非特異性方式加強(qiáng)宿主免疫應(yīng)答的物質(zhì)。本領(lǐng)域已知多種不同的佐劑。佐劑的實(shí)例是弗氏完全和不完全佐劑，維生素E，非離子性嵌段聚合物，胞壁酰二肽，QuillA(R)，礦物油例如Bayol("或Marko1(R),植物油，和Carb(Dpol("(同聚物)，或Diluvac(R)Forte。疫苗還可以包含所謂"媒介物"。媒介物是多肽粘附的化合物，而不共價(jià)結(jié)合它。經(jīng)常使用的媒介化合物是例如氫氧化鋁，磷酸鋁或氧化鋁，硅石，高嶺土，和膨潤土。這種媒介物的特殊形式，其中抗原部分包埋在媒介物中，是所謂ISC0M(EP109.942,EP180,564,EP242.380)。此外，疫苗可以包含一種或多種合適的表面活性化合物或乳化劑，例如Span或Tween。通常，將疫苗與穩(wěn)定劑混合，例如保護(hù)降解傾向多肽免于降解，提高疫苗的保存期，或提高凍干效率。有用的穩(wěn)定劑特別是SPGA(Bovarniketal;J.Bacteriology59:509(1950))，糖類例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖，蛋白質(zhì)如白蛋白或酪蛋白或其降解產(chǎn)物，以及緩沖劑如堿金屬磷酸鹽。此外，可以將疫苗混懸于生理上可接受的稀釋劑中。顯然，加佐劑，加入媒介物化合物或稀釋劑，乳化或穩(wěn)定多肽的其它方式也包括在本發(fā)明中。根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以非常適于以1-100微克蛋白質(zhì)的量加以施用，盡管原則上可以使用更小的劑量。超過IOO微克的劑量，盡管在免疫上是非常合適的，但出于商業(yè)原因吸引力較小?？梢缘偷枚嗟膭┝縼硎┯没诨顪p毒重組載體如上述LRC-病毒和細(xì)菌的疫苗，因?yàn)樗鼈冊诟腥酒陂g繁殖自身。所以，對于細(xì)菌和病毒來說非常合適的量分別為103到109CFU/PFU之間?？梢詰?yīng)用許多給藥方式?？诜?yīng)用是非常有吸引力的給藥方式，因?yàn)樗毁M(fèi)力?？诜o藥的優(yōu)選方式是將疫苗包裝在本領(lǐng)域已知和常用的膠嚢中，其只在它們穿過胃的高度酸性環(huán)境后崩解。另外，可以將疫苗混合以本領(lǐng)域已知的化合物以便暫時(shí)性提高胃的pH。全身性應(yīng)用也是合適的，例如通過肌內(nèi)應(yīng)用疫苗。如果按照這種途徑，本領(lǐng)域已知的用于全身性應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)方法是非常合適的?；谥гwL-a-甘油磷酸氧化酶的疫苗還非常合適作為標(biāo)記疫苗。標(biāo)記疫苗是這樣的疫苗，其允許例如在特征性抗體組不同于由野生型感染所誘導(dǎo)的抗體組的基礎(chǔ)之上，在接種疫苗和野生感染的(field-infected)動(dòng)物之間進(jìn)4亍辨別區(qū)分?；诩兓闹гwL-ct-甘油磷酸氧化酶的疫苗將只是誘導(dǎo)針對該蛋白的抗體，而基于活野生型、活減毒型或滅活型完整支原體的疫苗以及野外感染將誘導(dǎo)針對全部或大多數(shù)細(xì)菌蛋白質(zhì)的抗體這將清楚地給出高度不同的抗體組。簡單的EILSA測試，其具有含有純化支原體L-ct-甘油磷酸氧化酶的孔和含有另一種支原體蛋白質(zhì)的孔，足以檢測來自動(dòng)物的血清并確定動(dòng)物是用根據(jù)本發(fā)明的疫苗進(jìn)行了接種還是遭受支原體野外感染；用含有純化的支原體L-a-甘油磚酸氧化酶的疫苗接種的動(dòng)物將不具有針對除支原體L-a-甘油磷酸氧化酶之外的其它支原體蛋白的抗體。不過，遭受支原體野外感染的動(dòng)物將具有針對所有免疫原性支原體蛋白質(zhì)，并且因而也針對其它非支原體L-a-甘油磷酸氧化酶蛋白質(zhì)的抗體。因而，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及診斷測試，用于辨別用根據(jù)本發(fā)明的疫苗進(jìn)行了接種，或是用完整細(xì)胞疫苗進(jìn)行了接種或野外感染的情況，其中這種測試包含純化的支原體L-a-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段，和分開地另一種非L-oc-甘油磷酸氧化酶蛋白質(zhì)。如上所述表達(dá)的根據(jù)本發(fā)明的多肽或其免疫原性片段可以用來生產(chǎn)抗體，其可以是多克隆的，單特異性的或單克隆的(或其衍生物)。如果希望多克隆抗體，用來生產(chǎn)和加工多克隆血清的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的(例如Mayer和Walter,eds.ImmunochemicalMethodsinCel1andMolecularBiology,AcademicPress,London,1987)?？梢酝ㄟ^也是本領(lǐng)域已知的^支術(shù)(Kohler和Milstein，Nature,256，495-497,1975)免疫近交小鼠來制備根據(jù)本發(fā)明對根據(jù)本發(fā)明的多肽(或其變體或片段)反應(yīng)性的單克隆抗體。大規(guī)模生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的抗體的方法也是本領(lǐng)域已知的。這些方法依賴于在絲狀噬菌體中克隆編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的遺傳信息(的片段)用于噬菌體展示。這些技術(shù)特別在http:〃axioit1.imt.uni-marburg.de/~rek/aepphage.html.上的"filamentousphagedisplay"之下的"AntibodyEngineeringPage"上，以及在Cortese，R.等人，(1994)于TrendsBiotechn.12:262-267中，Clackson，T.&Wells,J.A.(1994)于TrendsBiotechn.12:173-183中，Marks,J.D.等人，(1992)于J.Biol.Chem.267:16007-16010中，Winter,G.等人，(1994)于A謹(jǐn).Rev.Immunol.12:433-455中和Little,M.等人，(1994)Biotechn.Adv.12:539-555的綜述文章中進(jìn)行了描述。隨后使用噬菌體來篩選表達(dá)camelid重鏈抗體的camelid表達(dá)文庫(MuyIdermans,S.和Lauwereys，M.,Journ.Molec.Recogn.12:131-140(1999)和Ghahroudi，M.A.etal.，F(xiàn)EBSLetters414:512-526(1997))。可以復(fù)制文庫中表達(dá)所需抗體的細(xì)胞，隨后用于大規(guī)模表達(dá)抗體。實(shí)施例實(shí)施例1菌林，細(xì)胞，生長條件和DNA抽提除非特別標(biāo)記，使用萆狀支原體萆狀亞種SC菌林Afad6(I968年在Farcha實(shí)驗(yàn)室，N'Djam6na，Chad分離的高毒性野外菌林)來進(jìn)行毒力研究。這種菌林在自然和實(shí)驗(yàn)條件下引發(fā)CBPP。在特別指明的地方，使用較小毒性的菌林，覃狀支原體蕈狀亞種SC菌林L2，它缺乏主動(dòng)甘油攝取系統(tǒng)GtsABC。另外，在此研究中還使用模式林PG1和來自非洲和歐洲疾病爆發(fā)的十種其它菌林進(jìn)行遺傳分析。將支原體培養(yǎng)物生長在支原體肉湯培養(yǎng)基中至108-109菌落形成單位/ml(cfu/ml)的密度或在固體支原體瓊脂培養(yǎng)基(AxcellBiotechnologies,St.Genis1'Argentiere，F(xiàn)rance)上生長。在符合BL3防范安全標(biāo)準(zhǔn)的生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行活體萆狀支原體覃狀亞種SC的生長和操作。如以往所述進(jìn)行DNA抽提(Cheng，X.，J.etal.，1995,Microbiology141:3221-3228)。對于遺傳操作和亞克隆，使用大腸桿菌菌林DH5a[F—cP80dhc/厶M15A(lacZYA-fl/^F)U169recAle/i^Al力srfR17(rk_，mk+)/7力oAii/;7E44入—f力/一l^rrA96re/Al]和BL21(DE3)[F'化邊o/Z7/rmB_)gal入(DE3)]。4吏用pETHIS-1表達(dá)載體(Schaller，A.etal.，1999，Microbiology145:2105-2116)來表達(dá)重組多-組氨酸N-和C-末端融合蛋白。由獲自當(dāng)?shù)赝涝讏龅奶カF來制備ECaNEp細(xì)胞，并在37匸于加濕的5%C02氣氛中，維持在24孔微量滴定板里的添加了7%胎牛血清(FCS)和青霉素(IOOIU/ml)的MEM-Earle培養(yǎng)基中并以2x105細(xì)胞每孔的匯合密度使用。FCS和細(xì)胞培養(yǎng)基購自Seromed(Biochrom，Munich,Germany)。利用PCR(支原體)或利用免疫染色(BVD病毒)來對細(xì)胞常規(guī)篩選污染。PCR擴(kuò)增，DNA印跡和DNA序列分析利用標(biāo)準(zhǔn)PCR條件(Cheng,X.，J.etal.，1995，Microbiology141:3221-3228)利用寡核苷酸引物glpO—EcoRI—N(5'-TCGAATTCAATGAAGCAMCAAAAGTTGATATTTG-30和glpO-Notl—C(5'-TTGCGGCCGCATTTCCATGGAAGAATAGCTTCTTC-3')在地高辛配基-11-dUTP(Dig)(RocheDiagnostics,Rotkreuz，Switzerland)存在下通過PCR來構(gòu)建W/^特異性DNA探針。如以往所述由支原體抽提基因組DNA并進(jìn)行DNA印跡分析(Pilo,P.etal.，2003，Vet.Microbiol.92:37-48)。用DNA測序儀AB3100遺傳分析儀和Taq染料脫氧終止循環(huán)測序試劑盒(AppliedBiosystems，Norwalk，Conn.)，用寡核脊酸引物glpO—EcoRI—N和glpO—Notl-C通過引物步移利用g/pO內(nèi)引物來進(jìn)行DNA測序。用PC/Gene程序PR0SITE(Bairoch，A.，P.Bucher，和K.Hofmann.1995，NucleicAcidsRes.24:189-196.)來分析DNA和推導(dǎo)出的氨基酸序列。利用BLAST與GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行序列比較(Altschul，S.F.etal.，1997，NucleicAcidsRes.25:3389-3402,)。通過利用程序MotifScan(http://hits,isb-sib.ch/cgi-bin/hits—motifscan)和TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED-form.html)，和"toppred"軟件(雨Heijne，G.1992，J.Mol.Biol.225:487-494.)來進(jìn)行蛋白質(zhì)的分析。實(shí)施例2重組Glp0的克隆、定點(diǎn)誘變和表達(dá)首先用分別包含fco//和觔"限制性位點(diǎn)的引物glp0—EcoRI-N和glpO-Notl-C來擴(kuò)增蕈狀支原體蕈狀亞種SC菌株Afad6的g//^基因。另外，引物glpO-Notl-C包括突變的TGG^密碼子。利用重疊延伸-PCR方法(Braman，J.，C.Papworth,和A.Greener.1996,MethodsMol.Biol.57:31-44.)用引物對(攜帶合適的核苷酸置換)glpO-mutlL(5,-GAAGACTG&ATCAAAGAAATGGA-3')/glpO-inutlR(5'-TTTGATgCAGTCTTCATAACGTTT-30或glpO一mut2L(5,-GCTAATTGgCAACCAAAAGAAGA-3')/glpO一mut2R(5'-TGGTTGgCAATTAGCCTTTTTATC-30用TGG^密碼子替換g/;70基因中的其它兩個(gè)支原體特異性TGATrp密碼子。通過將ScM/和y^/剪切位點(diǎn)放于側(cè)翼把PCR產(chǎn)物克隆入pETHIS-1中。通過DNA測序來分析構(gòu)建體并導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)N廣-螯合層析來進(jìn)行純化(Schaller，A.，etal.，1999，Microbiology145:2105—2116)。實(shí)施例3血清、多克隆抗體、免疫球蛋白純化和Fab制備Abdo和同事已經(jīng)詳細(xì)描述了來自非洲萆狀支原體蕈狀亞種SC菌林Afad6設(shè)對照實(shí)驗(yàn)感染的牛血清(Abdo，E.-M.etal.,1998，Vet.Microbiol.59:109-122.)。通過用160jug純化的重組多組氨酸尾蛋白質(zhì)GlpO皮下免疫兔，隨后在第2和第4周用40和20pg蛋白質(zhì)進(jìn)行加強(qiáng)免疫，獲得針對重組GlpO的多克隆單特異性血清，所述重組多組氨酸尾蛋白質(zhì)Glp0是在混合了500in1Adjuvant10(GerbuBiotechnikGmbH,Gaiberg,Germany)的500ju1PBS緩沖液pH8.0(50mMNa2HP04/NaH2P04pH8.0，140mMNaCl)中。在最后一次加強(qiáng)免疫后IO天將兔放血。由血液樣品制備抗血清并保存在-20°C。用HiTrapProteinG試劑盒(AmershamPharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)純化來自兔抗GlpO血清和來自相同兔的之前血清的免疫球蛋白G(IgG)級分。用ImmunoPureFab制備試劑盒(Pierce,Rockford，111.)才艮據(jù)生產(chǎn)商的說明書來制備Fab片段。將Fab片段相對于PBS緩沖液pH7.4透析過夜并隨后進(jìn)行過濾除菌。利用Bradford的方法測定蛋白質(zhì)濃度(Bradford,M.M.1976,Anal.Biochem.72:248-254.)。之前已經(jīng)描述過針對脂蛋白LppC的單特異性兔血清(Pilo，P.etal.，2003，Vet.Res.34:761-775.)。實(shí)施例4免疫印跡分析，TritonX-114分配和生長抑制測試如以往所述制備來自支原體的總抗原(Fleury，B.etal，2001，J.Clin.Microbiol.39:2814-2822)。用1:2000稀釋的牛血清和1:1000稀釋的兔單特異性血清抗GlpO進(jìn)行免疫印跡。通過TritonX-114分配方法將來自穩(wěn)定期培養(yǎng)物的覃狀支原體蕈狀亞種總抗原分離成疏水和親水級分(Bordier，C.1981，J.Biol.Chem.256:1604-1607)。用針對GlpO的單特異性多克隆抗體和針對蕈狀支原體萆狀亞種<^的牛血清進(jìn)行免疫印跡來分析來自TritonX-114去污劑相和水相的樣品。通過將5和10"1未稀釋的針對Glp0的去補(bǔ)體后單特異性兔血清，純化的IgG或抗GlpOIgG的Fab片段點(diǎn)樣到包含支原體的瓊脂培養(yǎng)基上并將板在37X:孵育4天來進(jìn)行生長抑制測試。使用抗萆狀支原體蕈狀亞種SC的血清作為陽性對照，抗LppQ的單特異性兔血清作為陰性對照。如以往所述在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行生長抑制的觀察(Papazisi，L.etal，2003，Microbiology149:2307-2316，Poveda，J.B.，和R.Nicholas,1998，MethodsMol.Biol,104:105-111.)。實(shí)施例5掃描電子顯微鏡(SEM)和免疫金標(biāo)記對于電子顯微鏡，將覃狀支原體萆狀亞種"在37。C在噴金或鉑的蓋玻片上于支原體肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，所述蓋玻片已經(jīng)預(yù)先涂布了多L-賴氨酸。用PBS緩沖液pH7,4于37。C將細(xì)胞洗滌三次并在PBS中的"。多聚甲醛中于室溫固定30分鐘。在用PBS洗滌后，將蓋玻片在添加了0.2M甘氨酸和1%BSA的PBS緩沖液中于室溫封閉15min，其后在4'C將它們與來自在添加了1%BSA的PBS中1:100或1:50稀釋的抗Glp0兔血清的IgG—起孵育過夜。隨后用PBS將樣品洗滌10min并于室溫用在PBS中1:50稀釋的膠體金綴合的山羊抗兔IgG(BritishBiocellInternational,Cardiff,UK)標(biāo)記90min。用0.1M二甲胂酸鹽緩沖液pH7.4洗滌蓋玻片并按照標(biāo)準(zhǔn)方案處理用于SEM。簡言之，將樣品在0.13M二甲胂酸鹽緩沖液pHL4中的具有0.11%釕紅的1.33%0s04中鋨化15min，用0.1M二甲胂酸鹽緩沖液洗滌，通過逐漸提高的乙醇系列進(jìn)行脫水，并通過六甲基二硅氮烷的蒸發(fā)來進(jìn)4亍干燥(Sigma，Buchs，Switzerland)。在高分辨視野發(fā)射掃描電子顯微鏡DSM982Gemini(Zeiss,0berkochen，Germany)中以5kV的加速電壓、8mm的工作距離和50，000到100，000X的放大倍率來檢查次級電子和相應(yīng)的反向散射電子信號。對照實(shí)驗(yàn)分別包括省略一抗以及使用兔抗降鉀素抗體(AnawaBiomedicalServicesandProducts,ZurichSwitzerland)和兔免疫前血清。實(shí)施例6H202生產(chǎn)的定量和抑制測定為了測量11202生產(chǎn)，將萆狀支原體蕈狀亞種SC菌株于37X:在支原體培養(yǎng)基中生長至大約5xl08cfu/ml的密度。將培養(yǎng)物在4T于8000Xg離心10min,在醉育培養(yǎng)基(67.6mMHEPESpH7.3，140mMNaCl，7mMMgCl2)中洗滌一次，于37*€以109cfu/ml的密度重懸于預(yù)溫的孵育培養(yǎng)基中，分成lml的等份并于37t:孵育1小時(shí)。為了誘導(dǎo)仏02生產(chǎn)，將甘油添加到支原體混懸液中至最終濃度為100^M-在牛血清中的生理濃度。如以往所述(Vilei，E.M.，和J.Frey，2001，CIin.Diagn.Lab.Immunol.8:85-92.)在加入甘油后0，1，2，5，10，20和120min用過氧化物測試(MerckKgaA，Darmstadt,Germany)來測量HA生產(chǎn)。為了抑制支原體L-a-甘油磷酸氧化酶GlpO，通過在0.26jug/ml到2.6Mg/ml的濃度下孵育隨后用PBS緩沖液洗滌兩次，用抗GlpOIgG的純化Fab片段來預(yù)處理支原體。為了評估覃狀支原體蕈狀亞種5^細(xì)胞在誘導(dǎo)11202生產(chǎn)后的生存力，在測試最后將等份的反應(yīng)測定物鋪在支原體瓊脂平板上并在37'C下生長。實(shí)施例7細(xì)胞毒性的評估將胚胎小牛鼻上皮細(xì)胞(ECaNEp細(xì)胞)(Schweizer，M.,和E,Peterhans，1999，J.Gen.Virol.80:1147-1155.)生長在24-孔板中直到達(dá)到匯合。在測定前，除去培養(yǎng)基并替換為無添加物的200piMEM-Earle培養(yǎng)基或添加了100M甘油的MEM-Earle培養(yǎng)基。隨后以50個(gè)支原體每細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(M0I)來感染ECaNEp細(xì)胞。為了阻抑GlpO活性，以0.26|Lig/ml的抗GlpOFab片段來預(yù)處理覃狀支原體草狀亞種^C。在固定和用0.75%結(jié)晶紫，O.25%NaCl，1.75%甲醛和50%乙醇染色后計(jì)數(shù)存活的ECaNEp細(xì)胞，并在感染后的不同時(shí)間在相差顯微鏡下進(jìn)行拍照。使用來自抗萆狀支原體覃狀亞種yc的膜脂蛋白LppC的多克隆IgG的純化Fab片段作為對照，因?yàn)長ppC與甘油代謝無關(guān)聯(lián)。為了確定在與ECaNEp細(xì)胞接觸前覃狀支原體萆狀亞種SC生長期間產(chǎn)生的HA對于牛細(xì)胞是否有害，將在甘油存在下生長的萆狀支原體蕈狀亞種5C培養(yǎng)物上清液通過0.22-jam濾器(Millipore，Bedford,Mass.)進(jìn)行過濾，并加入到ECaNEp細(xì)胞中。通過錐蟲藍(lán)排除法來評估ECaNEp細(xì)胞生存力。實(shí)施例8檢測在ECaNEp細(xì)胞中由&02和其它ROS引發(fā)的氧化應(yīng)激利用5(和6)-氯甲基-2、7'-二氯二氫熒光素二乙酸-乙酰酯(CM-H2DCFDA;MolecularProbes,Eugene,Oreg.)的氧化來評估ECaNEp細(xì)胞中胞內(nèi)ROS造成的氧化應(yīng)激。這種染料進(jìn)入細(xì)胞并在被ROS胞內(nèi)氧化后產(chǎn)生熒光信號。釆用評估細(xì)胞毒性所用相同的條件，進(jìn)行下列改進(jìn)。作為對照，將半數(shù)包含ECaNEp細(xì)胞的孔用30inMN-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)來處理以防止被H202和ROS氧化。隨后，將ECaNEp細(xì)胞與10yMCM-H2DCFDA—起孵育1小時(shí)并用MEM-Earle培養(yǎng)基洗滌一次。隨后以500個(gè)支原體每細(xì)胞的M0I在甘油存在或缺失的情況下感染細(xì)胞。為了阻抑Glp0活性，以O(shè).26"g/ml的抗Glp0Fab片段來預(yù)處理覃狀支原體覃狀亞種。作為對照，用150到4.4mM的H202溶液來處理細(xì)胞20分鐘。在支原體感染后20min，利用NikonEclipseTE300顯孩吏鏡通過熒光顯孩i術(shù)來監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)H202和ROS。注意所有涉及CM-H2DCFDA的步驟，包括這種化學(xué)品的操作，都在黑暗下進(jìn)行。核苷酸序列登錄號來自蕈狀支原體蕈狀亞種SC菌株Afad6和U的glpO的核苷酸序列的EMBL/GenBank登錄號分別是AJ581566和AJ581564。來自支原體物種牛7型菌林PG50和蕈狀支原體山羊亞種菌林PG3的g//^基因序列保藏登錄號分別是AJ581565和AJ581567。實(shí)施例9g/;70基因的遺傳和功能分析來自蕈狀支原體覃狀亞種SC的g/;^基因編碼387aa的多肽GlpO，預(yù)測分子量為42.7kDa，pl8.14。它包含三個(gè)TGATrp密碼子。該蛋白質(zhì)在氨基酸位置8到36具有推定的FAD結(jié)合位點(diǎn)，似乎是表面暴露型的。TMpred鑒定了兩個(gè)明顯的跨膜區(qū)，跨越氨基酸6到25和140到157。在高毒性的菌林Afad6中，基因之后是基因(推定的甘油磷酸激酶)和j/p尸(推定的甘油促進(jìn)劑因子)。對于模式林PG1觀察到相同的基因排列。用glp0的基因探針進(jìn)行基因組DNA的DNA印跡分析顯示在蕈狀支原體萆狀亞種SC菌抹Afad6，L2，模式林PG1以及所分析的來自非洲和歐洲疾病爆發(fā)的十種其它菌株中存在W;70(數(shù)據(jù)未顯示)。用單特異性抗-GlpOIgG對總抗原進(jìn)行免疫印跡分析揭示一條明顯的45-kDa蛋白質(zhì)條帶，確證了基因在測試的所有萆狀支原體覃狀亞種SC菌林中表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。發(fā)現(xiàn)來自覃狀支原體覃狀亞種SC菌林Afad6和菌林L2的GlpO的氨基酸序列與模式林PG1(48)的GlpO的氨基酸序列相同，并且顯示與多種支原體物種的甘油-3-磷酸脫氫酶的相似性(表1)。基因組序列分析預(yù)測支原體缺乏過氧化氫酶和歧化酶活性。由于細(xì)胞質(zhì)GlpO活性將誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)&02毒性，其又將對于支原體本身有害，我們假定該酶必定位于表面膜處。利用"toppred"軟件對來自各病原性支原體物種(列于表1中)的GlpO或同源性酶的序列分析揭示了跨膜結(jié)構(gòu)，預(yù)測這些酶的結(jié)構(gòu)域是位于表面的。在利用來自單特異性兔抗GlpO血清的IgG進(jìn)行免疫金標(biāo)記后通過掃描電子顯微鏡(SEM)提供了GlpO存在于蕈狀支原體萆狀亞種SC細(xì)胞表面處的直接證據(jù)(圖la-d)。為了確證GlpO位于支原體膜中，將蕈狀支原體萆狀亞種SC的總蛋白進(jìn)行TritonX-114相分配。抗-GlpO血清與TritonX-114相中的45-kDa蛋白質(zhì)(Glp0)反應(yīng)強(qiáng)烈，所述45-kDa蛋白質(zhì)不存在于水相，表明Glp0是覃狀支原體蕈狀亞種SC的一種膜內(nèi)在蛋白(圖le)。對覃狀支原體覃狀亞種SC的TritonX-114提取物用來自用該菌抹實(shí)驗(yàn)性感染的牛的牛血清進(jìn)行免疫印跡分析揭示了在45kDa的GlpO特異性條帶在凝膠上與Glp0共遷移(數(shù)據(jù)未顯示)，表明GlpO涉及牛CBPP感染期間的血清轉(zhuǎn)化。為了確證G1p0作為支原體L-ct-甘油磷酸氧化酶的功能，我們在存在或缺乏單特異性抗-GlpOIgG的Fab片段的情況下向萆狀支原體覃狀亞種SC純性培養(yǎng)物中加入甘油后，測量了&02的生產(chǎn)。如圖If所示，在對數(shù)生長中期向培養(yǎng)物中加入100/iM甘油立即導(dǎo)致11202釋放入生長培養(yǎng)基中，10分鐘后達(dá)到150yM，此濃度保持長達(dá)2小時(shí)(圖lf)。當(dāng)支原體混懸液用單特異性多克隆抗-GlpO抗體或抗-GlpOIgG的Fab片段以最小濃度0.26jig/ml進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，可以特異性地阻抑&02釋放，但用作對照抗體的抗LppCIgG的Fab片段進(jìn)行預(yù)處理則不能(圖lf)。LppC是萆狀支原體覃狀亞種SC的一種表面脂蛋白，其與甘油代謝無關(guān)。在添加了甘油后向覃狀支原體萆狀亞種SC培養(yǎng)物中加入過氧化氫酶將培養(yǎng)基中&02的水平減少到l)iM(該測定的檢測水平)以下的濃度。不添加或添加抗-GlpO抗體或抗-GlpOFab片段，萆狀支原體蕈狀亞種SC的世代時(shí)間是3.3小時(shí)。另外，在血清-drop生長抑制測試中抗-GlpO抗體沒有作用(數(shù)椐未顯示)。在100jaM甘油存在下生長2小時(shí)并產(chǎn)生150HA的純性培養(yǎng)物顯示3.2小時(shí)的世代時(shí)間，而未加入甘油的對照培養(yǎng)物具有3.3小時(shí)的世代時(shí)間。因此，甘油誘導(dǎo)11202產(chǎn)生并不影響支原體的生存力。實(shí)施例10蕈狀支原體覃狀亞種SC針對牛上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性為了評估緣自甘油代謝的HA和相關(guān)ROS的產(chǎn)生是否促成萆狀支原體覃狀亞種SC的毒性，我們在各種條件下分析了對于胚胎小牛鼻上皮細(xì)胞(ECaNEp)的細(xì)胞毒性(圖2)。如圖2b所示，蕈狀支原體萆狀亞種SC菌抹Afad6以50個(gè)支原體每細(xì)胞的M0I感染ECaNEp細(xì)胞，在培養(yǎng)基中缺少甘油的情況下感染1小時(shí)后只導(dǎo)致弱的細(xì)胞毒性效應(yīng)。不過，當(dāng)在存在生理學(xué)濃度的甘油情況下用該支原體感染ECaNEp細(xì)胞時(shí)，大多數(shù)ECaNEp細(xì)胞從表面脫離并隨后經(jīng)歷完全溶解(圖2c)。當(dāng)用0.26jjg/ml濃度的抗-GlpOFab片段預(yù)處理支原體時(shí)，這種細(xì)胞毒性效應(yīng)可以得到阻抑，所述抗GlpOFab片段伴隨性地阻抑11202的產(chǎn)生。在這些條件下，ECaNEp細(xì)胞在感染后1小時(shí)不顯示形態(tài)改變(圖2d)。生長在包含甘油的培養(yǎng)基中的覃狀支原體萆狀亞種SC的細(xì)胞毒性并不被用作對照的抗-LppCFab片段所抑制(圖2e)。當(dāng)在甘油存在時(shí)用毒性較小的菌林(L2)感染ECaNEp細(xì)胞時(shí)只觀察到弱的細(xì)胞毒性效應(yīng)，該菌林缺乏主動(dòng)甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GtsABC的基因并且只產(chǎn)生低量的H202(圖2f)。在對照實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)或組合添加甘油，抗-GlpOFab或抗-LppCFab并不影響ECaNEp細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的動(dòng)力學(xué)(圖2g)顯示在向感染了萆狀支原體蕈狀亞種SC的ECaNEp細(xì)胞中加入甘油后快速出現(xiàn)了細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)，在2小時(shí)后達(dá)到75%的死亡率。在較高M(jìn)OI(500支原體每細(xì)胞)，在加入甘油后M分鐘達(dá)到細(xì)胞的完全死亡。用抗-GlpOFab預(yù)處理支原體在整個(gè)觀察期中完全阻止細(xì)胞死亡(圖2g)。在不添加甘油的情況下，蕈狀支原體萆狀亞種SC感染ECaNEp細(xì)胞只顯示弱的細(xì)胞毒性效應(yīng)(圖2g)，其也可以被抗-GlpOFab所抑制，因此可能歸因于細(xì)胞或培養(yǎng)基中殘余量的甘油。令人感興趣的是，在甘油存在下生長的蕈狀支原體萆狀亞種SC培養(yǎng)物的經(jīng)過濾的上清液，其包含大約"0JliM&02，或向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加150jiMH202，在1小時(shí)接觸后對于ECaNEp細(xì)胞并無明顯可見的細(xì)胞毒性效應(yīng)。通過向ECaNEp細(xì)胞培養(yǎng)物中添加外源&02而誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性于4.4mM的濃度首次達(dá)到，大多數(shù)細(xì)胞在1小時(shí)接觸后死亡。這一濃度是在甘油存在時(shí)在萆狀支原體萆狀亞種SC生長培養(yǎng)基中測量到的濃度的30倍。為了監(jiān)測感染了蕈狀支原體萆狀亞種SC或添加了甘油以后細(xì)胞內(nèi)11202和其它R0S所引發(fā)的ECaNEp細(xì)胞中的氧化應(yīng)激，我們用CM-H2DCFDA預(yù)處理了ECaNEp細(xì)胞并通過熒光顯微鏡檢測了這種化合物的細(xì)胞內(nèi)氧化(圖3)。通過CM-H2DCFDA的氧化切割酯基團(tuán)導(dǎo)致在細(xì)胞中形成高度熒光性的二氯熒光素(DCF)衍生物，而未經(jīng)氧化的CM-H2DCFDA是非焚光性的。如圖3c-d中所示，覃狀支原體覃狀亞種SC感染ECaNEp細(xì)胞導(dǎo)致在添加甘油后20min在ECaNEp細(xì)胞中強(qiáng)烈誘導(dǎo)熒光，反映出細(xì)胞內(nèi)h202或ROS的存在。相反，不添加甘油在感染的ECaNEp細(xì)胞中未檢測到熒光(圖3a-b)。當(dāng)在ECaNEp細(xì)胞感染之前用抗-GlpO抗體處理支原體時(shí)，CM-H2DCFDA的細(xì)胞內(nèi)氧化不發(fā)生(圖3e-f)。另外，在向培養(yǎng)基中添加甘油之前，用抗氧化劑NAC處理ECaNEp細(xì)胞阻抑了CM-H2DCFDA的細(xì)胞內(nèi)氧化(圖3g-h)。加入150pM夕卜源h202，不發(fā)生ECaNEp細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)氧化，所述150juMH202相當(dāng)于萆狀支原體蕈狀亞種SC在添加甘油后10min所釋放的H202的濃度。如同對于誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的情況，為了實(shí)現(xiàn)ECaNEp細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)CM-HJ)CFDA的氧化，必需4.4mM濃度的外源H202(圖3i-j)。結(jié)論在本發(fā)明中蕈狀支原體蕈狀亞種SC的GlpO已經(jīng)被鑒定為膜蛋白，它在針對EcaNEp細(xì)胞的細(xì)胞毒性中發(fā)揮重要作用。在生理濃度的甘油存在時(shí)，109cfu/ml密度的覃狀支原體蕈狀亞種SC向培養(yǎng)基中釋放相對大量的H202，高達(dá)150pM。如果與在葡萄糖存在時(shí)生長的支原體所產(chǎn)生的量相比，這種&02量是大約20倍，據(jù)報(bào)道葡萄糖刺激H202產(chǎn)生僅僅50%。當(dāng)ECaNEp細(xì)胞接觸萆狀支原體蕈狀亞種SC時(shí)，在存在生理濃度的甘油的情況下，首先在它們的細(xì)胞質(zhì)中檢測到H202，隨后發(fā)生細(xì)胞死亡。我們注意到在由支原體向培養(yǎng)基中釋放的HA濃度和觸發(fā)CM-H2DCFDA氧化和細(xì)胞死亡所需的&02濃度之間有顯著的差異。因而，包含150mMH202的經(jīng)過濾的支原體生長培養(yǎng)基或向ECaNEp細(xì)胞中添加150外源&02在1小時(shí)內(nèi)并不導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中可檢測到的CM-H2DCFDA氧化，也不導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這表明支原體和宿主細(xì)胞之間緊密的接觸是將毒性化合物成功乾向宿主細(xì)胞所必需的。在此，值得注意的是蕈狀支原體覃狀亞種sc-和為此大多數(shù)其它病原性支原體-緊密地附著于它們的宿主細(xì)胞，但并不穿透。另外，主動(dòng)攝取甘油是獲得對ECaNEp細(xì)胞的甘油誘導(dǎo)細(xì)胞毒性效應(yīng)所必需的。覃狀支原體蕈狀亞種SC的歐洲菌林L2，其缺乏主動(dòng)攝取甘油所需的GtsABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并且其以顯著較低的速率產(chǎn)生少10倍H202，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下對于ECaNEp細(xì)胞只具有弱的細(xì)胞毒性效應(yīng)。據(jù)認(rèn)為菌林L2對甘油的殘余攝取是由于較低效的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑而發(fā)生的，所述途徑是由推定的甘油促進(jìn)劑因子GlpF所介導(dǎo)的?；谖覀兊慕Y(jié)果，我們提出觸發(fā)苯狀支原體萆狀亞種SC對于真核細(xì)胞的細(xì)胞損傷的下列模型(圖4):存在于間質(zhì)液中的甘油通過高度活性的ABC甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GtsA，GtsB和GtsC)主動(dòng)導(dǎo)入并且隨后磷酸化成甘油-3-磷酸。接下來，這在02存在下被GlpO氧化成DHAP，其進(jìn)入糖酵解途徑，并產(chǎn)生一分子的H202。受到支原體與宿主細(xì)胞膜的密切接觸所促進(jìn)，比02和伴隨的R0S進(jìn)入宿主細(xì)胞。在宿主細(xì)胞內(nèi)，&02和R0S充當(dāng)細(xì)胞損傷的有力介導(dǎo)物和炎性過程的誘導(dǎo)物。預(yù)期它們通過直接損傷組織細(xì)胞或誘導(dǎo)宿主基因表達(dá)來損傷宿主，例如，通過NF-kB的激活，或通過Fenton反應(yīng)誘導(dǎo)促炎基因(Crichton，R.R.etal.2002，J.Inorg.Biochem.91:9-18)。令人感興趣的是，之前已經(jīng)顯示支原體誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞中的呼吸爆發(fā)，提示宿主生成的R0S可能進(jìn)一步促成組織損傷。11202和R0S還能夠激活NF-kB，通過這樣，誘導(dǎo)真核宿主中一系列免疫和促炎基因的表達(dá)，這是可能在由支原體引發(fā)的呼吸道感染中具有特別重要性的機(jī)制?；谥гwL-ot-甘油磷酸氧化酶或針對支原體L-ct-甘油磷酸氧化酶的抗體的疫苗成功地抑制HA和R0S的產(chǎn)生，通過這樣，它們預(yù)防宿主細(xì)胞損傷、炎癥和疾病。圖1.支原體L-ot-甘油磷酸氧化酶的定位和活性。a-d，掃描電子顯微鏡照片，分別顯示與來自抗-Glp0(a，b)和免疫前血清(c,d)的IgG—起孵育的萆狀支原體萆狀亞種SC菌林Afad6的免疫金標(biāo)記。次級電子顯微照片顯示細(xì)胞表面(a，c)而反向散射電子顯微照片揭示15nm膠體金綴合的二抗(b，d)?？潭缺壤?，500nm。e，用Glp0抗血清對萆狀支原體萆狀亞種SC菌林Afad6的TritonX-114分級分離的總抗原的免疫印跡分析。泳道1，去污劑相，20pg蛋白質(zhì)；泳道2，水相，20yg蛋白質(zhì)；Std，分子量標(biāo)準(zhǔn)，f，在加入100jaM甘油后苯狀支原體萆狀亞種SC菌抹Afad6的過氧化氫產(chǎn)生。顯示的數(shù)據(jù)是五次獨(dú)立測量的平均值。各次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差低于平均值的5%。三角形和實(shí)線，未處理的蕈狀支原體覃狀亞種SC;十字形和虛線，用來自抗-GlpOIgG的Fab片段預(yù)處理的覃狀支原體覃狀亞種SC;正方形和點(diǎn)線，用來自抗-LppC的Fab片段預(yù)處理的萆狀支原體蕈狀亞種SC。圖2.覃狀支原體萆狀亞種SC對ECaNEp細(xì)胞的細(xì)胞毒性(a-f)和細(xì)胞生存力測定(g)。a，ECaNEp細(xì)胞(對照)；b，蕈狀支原體萆狀亞種SC菌林Afad6感染后1h的ECaNEp;c，在甘油(100|iM)存在時(shí)，菌株Afad6感染后lh的ECaNEp;d，在甘油(100)aM)存在時(shí)，用來自抗-GlpOIgG的Fab片段預(yù)處理的菌林Afad6感染后1h的EcaNEp;e,在甘油(100uM)存在時(shí)，用來自抗-LppCIgG的Fab片段預(yù)處理的菌林Afad6感染后lh的EcaNEp;f，在甘油(100yM)存在時(shí)感染了覃狀支原體蕈狀亞種SC菌林L2(其缺乏主動(dòng)甘油攝取系統(tǒng))的ECaNEp細(xì)胞。在所有實(shí)驗(yàn)中的MOI是50個(gè)支原體每細(xì)胞。g，在以50個(gè)支原體每細(xì)胞的MOI用萆狀支原體萆狀亞種SC菌林Afad6感染后不同時(shí)間的活ECaNEp細(xì)胞。三角形和粗實(shí)線，在100HM甘油存在時(shí)感染菌林Afad6;十字形和點(diǎn)線，在100pM甘油存在時(shí)感染用抗-GlpOFab片段(0.26pg/ml)預(yù)處理的菌抹Afad6SC;正方形和虛線，無甘油時(shí)菌林Afad6感染；菱形和細(xì)實(shí)線，單獨(dú)的ECaNEP細(xì)胞(對照)。圖1用萆狀支原體覃狀亞種SC菌株Afad6以MOI500支原體每細(xì)胞感染或用H202處理的ECaNEp細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)！1202和1103的檢測。ECaNEp細(xì)胞的相差顯微照片(a，c，e，g和i)和熒光顯微照片(b，d，f，h和j):在甘油缺乏下用萆狀支原體覃狀亞種SC菌林Afad6感染后20min(a，b);在添加了甘油的培養(yǎng)基中用菌林Afad6感染(c，d);在添加了甘油的培養(yǎng)基中以用來自抗-GlpOIgG的Fab片段預(yù)處理的菌株Afad6感染(e，f);用N-乙?；?L-半胱氨酸預(yù)處理，隨后在具有甘油的培養(yǎng)基中用菌林Afad6感染(g，h);在添加了4.4mM&02的培養(yǎng)基中孵育20分鐘(i，j)。圖4.蕈狀支原體萆狀亞種SC觸發(fā)宿主細(xì)胞炎癥的模型。GtsABC:主動(dòng)甘油運(yùn)輸和磷酸化系統(tǒng)；GlpF:甘油促進(jìn)劑因子；GipK:甘油激酶；G3P:甘油-3-磷酸；DHAP:磷酸二羥丙酮；GlpO:支原體L-cc-甘油磷酸氧化酶。粗箭頭表示萆狀支原體萆狀亞種SC的主要毒力途徑。表1.來自萆狀支原體覃狀亞種SC菌林Afad6的GlpO和GtsABC的蛋白質(zhì)序列與來自其它支原體的同源物的序列的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>權(quán)利要求1.用于對抗支原體感染的疫苗，其特征在于所述疫苗包含支原體L-α-甘油磷酸氧化酶或其免疫原性片段，和可藥用的載體。全文摘要本發(fā)明特別涉及對抗支原體感染的疫苗，涉及用在這些疫苗中的支原體L-α-甘油磷酸氧化酶，涉及支原體L-α-甘油磷酸氧化酶生產(chǎn)這些疫苗的用途，涉及這些疫苗的制備方法并且涉及診斷性測試，所述診斷性測試用來識別接種所述疫苗的動(dòng)物以及接種了全細(xì)胞疫苗的動(dòng)物或遭受野外感染的動(dòng)物。文檔編號A61K39/00GK101217974SQ200680024567公開日2008年7月9日申請日期2006年7月6日優(yōu)先權(quán)日2005年7月7日發(fā)明者E·M·維萊,J·弗雷,P·皮羅申請人:伯爾尼大學(xué)