脂氧素在制備治療疼痛制劑中的用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于鎮(zhèn)痛藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及脂氧素及其類似物在制備治療疼痛制劑中的用途，本發(fā)明經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，脂氧素及其類似物可緩解脛骨癌痛大鼠的機(jī)械性痛覺超敏，能夠抑制脊髓背角IL-1β，TNF-α等炎性因子的上調(diào)，通過(guò)與其受體結(jié)合抑制相關(guān)炎性因子的表達(dá)上調(diào)完成緩解疼痛。所述的脂氧素及其類似物可作為主要有效成分進(jìn)一步制備鎮(zhèn)痛疫苗或鎮(zhèn)痛藥物用于治療急/慢性痛。
【專利說(shuō)明】脂氧素在制備治療疼痛制劑中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于鎮(zhèn)痛藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及脂氧素及其類似物在制備治療疼痛制劑中的用途，所述的脂氧素及其類似物(LXA4，LXB4，ATL等)可作為主要有效成分進(jìn)一步制備鎮(zhèn)痛疫苗或鎮(zhèn)痛藥物用于治療急/慢性痛。
【背景技術(shù)】
[0002]研究報(bào)道，疼痛是一種復(fù)雜的生理心理活動(dòng)，是臨床最常見的癥狀之一。所述疼痛包括傷害性刺激作用于機(jī)體引起的痛感覺和機(jī)體對(duì)于傷害性刺激產(chǎn)生的痛反應(yīng)。通常臨床根據(jù)疼痛的性質(zhì)和持續(xù)時(shí)間可分為急性痛和慢性痛，而慢性痛又可分為癌性痛和非癌痛。臨床實(shí)踐顯示，若干慢性痛患者長(zhǎng)期忍受著劇烈疼痛的折磨，因此，緩解疼痛改善患者生存質(zhì)量是醫(yī)務(wù)工作者面臨的重要任務(wù)。但是現(xiàn)有的緩解疼痛的藥物由于其成癮性，耐藥性或其他毒副作用極大限制了其在臨床的廣泛使用，尋求安全有效緩解疼痛的藥物是目前有關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)也是一大難題。
[0003]近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，在慢性痛特別是骨癌痛中，表現(xiàn)為以脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞大量活化增生和炎性細(xì)胞因子的上調(diào)為特征的神經(jīng)炎癥，抑制相關(guān)炎性因子和信號(hào)通路后可顯著緩解骨癌痛，提示在骨癌痛中脊髓背角的神經(jīng)炎癥與疼痛的產(chǎn)生密切相關(guān)。
[0004]脂氧素是一類源于花生四烯酸經(jīng)一系列脂氧合酶代謝產(chǎn)生的內(nèi)源性的具有抗炎和促炎癥消退的脂類介質(zhì)。研究顯示，其主要通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞向炎癥部位的趨化，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用發(fā)揮抗炎和促炎癥消退的作用。已有研究表明，單次鞘內(nèi)及系統(tǒng)給予脂氧素可緩解角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠炎癥痛(Svensson Cl, Zattoni M,Serhan CN: Lipoxins and aspirin-triggered lipoxin inhibit inflammatory painprocessing.J Ex p Med 2007, 204:245-252.),連續(xù)鞘內(nèi)給予脂氧素可緩解神經(jīng)痛大鼠的痛行為(Sun T, Yu E, Yu L, Luo J, Li H, Fu Z: LipoxinA(4) induced antinociceptionand decreased expression of NF-kappaB and pro-1nflammatory cytokines afterchronic dorsal root ganglia compression in rats.Eur J Pain 2011.)，但是關(guān)于月旨氧素與骨癌痛的關(guān)系尚未見相關(guān)報(bào)道，也未見脂氧素及其類似物可直接緩解骨癌痛的報(bào)道。臨床也無(wú)直接用脂氧素及其類似物用于治療骨癌痛的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供脂氧素的新用途，具體涉及脂氧素在制備治療疼痛制劑中的用途，尤其是脂氧素及其類似物在制備治療急/慢性疼痛的鎮(zhèn)痛疫苗中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供脂氧素及其類似物在制備治療慢性痛尤其是骨癌痛的鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的脂氧素其類似物包括LXA4，LXB4和ATL。
[0008]本發(fā)明的脂氧素及其類似物進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脂氧素及其類似物可緩解脛骨癌痛大鼠的機(jī)械性痛覺超敏，進(jìn)而應(yīng)用免疫熒光，Real-Time PCR, WesternBlot等實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究表明，脂氧素受體主要分布于大鼠脊髓背角的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，并且能夠抑制脊髓背角IL-1 β，TNF-α等炎性因子的上調(diào)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:脂氧素及其類似物主要是通過(guò)與其受體結(jié)合抑制相關(guān)炎性因子的表達(dá)上調(diào)完成緩解疼痛。
[0009]為了更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面以脂氧素及其類似物在骨癌痛大鼠中的作用相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明。
[0010]本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中采用現(xiàn)有技術(shù)制作脛骨癌痛大鼠模型，脂氧素及其類似物購(gòu)自Merck公司及Chemicon公司，在造模后第十一天鞘內(nèi)給予脂氧素及其類似物，結(jié)果顯示，鞘內(nèi)及尾靜脈給予ATL均能顯著緩解脛骨癌痛大鼠的機(jī)械性痛覺超敏，并且隨著劑量增大，其鎮(zhèn)痛效應(yīng)和時(shí)程也相應(yīng)延長(zhǎng)，此能夠抑制脊髓背角炎性因子IL-1 β和TNF-α的表達(dá)上調(diào)，免疫組化結(jié)果顯示，其受體在脊髓背角主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，因此提示脂氧素及其類似物主要是通過(guò)作用于脊髓背角的相關(guān)受體通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，抑制炎性因子的上調(diào)，抑制其脊髓背角的神經(jīng)炎癥達(dá)到緩解骨癌痛的作用。
[0011]本發(fā)明所述的脂氧素是機(jī)體可內(nèi)源性產(chǎn)生的一類具有抗炎作用的脂類介質(zhì)，研究表明其安全無(wú)毒副作用，可作為主要成分，進(jìn)一步制備鎮(zhèn)痛疫苗和鎮(zhèn)痛藥物，用于臨床防治急/慢性痛。
[0012]為了便于理解，以下將通過(guò)具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說(shuō)明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為行為學(xué)結(jié)果，
其中，Α.為脛骨癌痛大鼠模型評(píng)價(jià)，+++Ρ〈0.001，與Sham組比較；
B.為鞘內(nèi)給予脂氧素及其類似物對(duì)脛骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用的評(píng)價(jià)，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，***Ρ〈0.001，與 Cancer+NS 組比較；##P<0.01，.Ρ〈0.001，與 Cancer+ATL
0.3nmol組比較；
C.為鞘內(nèi)給予脂氧素及其類似物對(duì)正常大鼠的機(jī)械痛閾的影響；
D.為鞘內(nèi)給予不同劑量ATL對(duì)脛骨癌痛大鼠鎮(zhèn)痛作用的評(píng)價(jià)，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，***Ρ〈0.001，與 Cancer+NS 組比較;#P〈0.05，與 Cancer+ATL 0.45nmol 組比較；
E.為尾靜脈給予不同劑量ATL對(duì)脛骨癌痛大鼠鎮(zhèn)痛作用的評(píng)價(jià)，*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001,與 Cancer+NS 組比較;#P〈0.05，與 Cancer+ATL 30nmol/kg 組比較。
[0014]圖2為ALX在脊髓背角的表達(dá)及分布，
其中，A.為Western Blot實(shí)驗(yàn)，ALX在Naive, Sham及Cancer組的蛋白表達(dá)水平；
B.為免疫組化實(shí)驗(yàn)，ALX在Naive, Sham及Cancer組脊髓背角的分布。
[0015]圖3為免疫組化實(shí)`驗(yàn)，ALX與星形膠質(zhì)細(xì)胞在Naive，Sham及Cancer組脊髓背角的共標(biāo)。
[0016]圖4為免疫組化實(shí)驗(yàn)，ALX與神經(jīng)元在Naive，Sham及Cancer組脊髓背角的共標(biāo)。[0017]圖5為免疫組化實(shí)驗(yàn)，ALX與小膠質(zhì)細(xì)胞在Naive，Sham及Cancer組脊髓背角的共標(biāo)情況。
[0018]圖6為Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)，鞘內(nèi)給予ATL后對(duì)脊髓背角相關(guān)炎性因子表達(dá)的影響，##P〈0.01，與 Naive 組相比；*P<0.05，與 Cancer+NS 組比較。
【具體實(shí)施方式】
[0019]實(shí)施例1
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠160_180g，雌性SD大鼠70_80g，用于接種腫瘤細(xì)胞(購(gòu)自上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部)。
[0020]腫瘤細(xì)胞:Walker256大鼠乳腺癌細(xì)胞。
[0021]主要試劑:LXA4，ATL(Merck 公司)，LXB4，CDllB 抗體(Chemicon 公司)，ALX 抗體(Biological 公司)，NeuN 抗體(Millipore 公司)，GFAP 抗體(Thermo 公司)。
[0022]主要儀器:Von-Frey Hair ;微量進(jìn)樣器；75%酒精,棉簽，10%水合氯醒,異氟醚,硫酸慶大霉素注射液；1ml，2ml, 5ml注射器等。
[0023]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:
A.胚骨癌痛大鼠模型評(píng)價(jià):SD雌性大鼠隨機(jī)分成三組,分別為Naive, Sham和Cancer組，造模前測(cè)基礎(chǔ)痛閾，造模后五，七，九，十一天測(cè)痛，并在第十一天測(cè)痛后灌流取材留做免疫組化。
[0024]脂氧素 及其類似物對(duì)脛骨癌痛大鼠痛閾影響:SD雌性大鼠隨機(jī)分成四組，分別為Cancer+NS, Cancer+LXA4, Cancer+ATL, Cancer+LXB4 組，造模前測(cè)基礎(chǔ)痛閾，造模后第十一天測(cè)痛，測(cè)痛后分別給予各組鞘內(nèi)注射相同劑量的LXA4，ATL或LXB4，對(duì)照組給予生理鹽水，并在給藥后2，4，6小時(shí)觀察其痛閾變化。
[0025]脂氧素及其類似物對(duì)正常大鼠痛閾影響:SD雌性大鼠隨機(jī)分成五組，分別為Naive,Naive+NS,Naive+LXA4,Naive+ATL,Naive+LXB4 組,測(cè)痛后分別給予各組鞘內(nèi)注射相同劑量的LXA4，ATL或LXB4，對(duì)照組給予生理鹽水，并在給藥后2，4，6小時(shí)觀察其痛閾變化。
[0026]不同劑量的ATL對(duì)脛骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾的影響:雌性SD大鼠隨機(jī)分成四組，分別為 Cancer+NS, Cancer+ATL 0.03nmol, Cancer+ATL 0.3nmol, Cancer+ATL 0.45nmol組，造模前測(cè)基礎(chǔ)痛閾，在造模后第十一天測(cè)痛后分別給予各組鞘內(nèi)注射相應(yīng)劑量的ATL，對(duì)照組給予生理鹽水，并在給藥后2，4，6，8，12小時(shí)測(cè)痛，觀察其痛閾變化。
[0027]系統(tǒng)給予ATL對(duì)脛骨癌痛大鼠機(jī)械痛閾的影響:雌性SD大鼠隨機(jī)分成三組，分別為Cancer+NS,Cancer+ATL 30 nmol/kg, Caner+ATL 120 nmol/kg組，造模前測(cè)基礎(chǔ)痛閾，在造模后第十一天測(cè)痛后分別給予各組尾靜脈注射相應(yīng)劑量的ATL，對(duì)照組給予生理鹽水，并在給藥后1，2，3，4，6，8，12小時(shí)測(cè)痛，觀察其痛閾變化。
[0028]脛骨癌痛模型制作
按照 Mao-Ying (Mao-Ying QL, Zhao J, Dong ZQ, Wang J, Yu J, Yan MF, ZhangYQ, Wu GC, Wang YQ: A rat model of bone cancer pain induced by intra-tibiainoculation of Walker 256 mammary gland carcinoma cells.Biochem Biophys ResCommun 2006, 345:1292-1298.)的脛骨癌痛大鼠模型的方法制作。基本步驟:大鼠腹腔注射8%水合氯醛(5ml/kg)麻醉后，右側(cè)膝關(guān)節(jié)部位剃毛，表面皮膚用75%酒精消毒；左手指固定膝關(guān)節(jié)使其表面皮膚緊張，然后用7號(hào)針頭在膝關(guān)節(jié)處(髕韌帶外側(cè)緣)沿脛骨縱軸走向往脛骨遠(yuǎn)端鉆孔，深約lcm，用微量注射器(10 μ I)向脛骨骨髓腔內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞建立脛骨癌痛模型。微量進(jìn)樣器依次吸入:I μ I空氣、2 μ I明膠海綿水溶液、I μ I空氣、4 μ I腫瘤細(xì)胞、I μ I空氣。另有大鼠注射4μ I PBS做為對(duì)照。接種后留針片刻。每只大鼠腹腔注射0.2ml硫酸慶大霉素以防感染。
[0029]異氟醚麻醉大鼠后，大鼠取俯臥位，腹部墊高，以大鼠兩側(cè)坐骨棘為解剖標(biāo)志，此兩點(diǎn)間連線與脊柱的交點(diǎn)處，大致位于L5-L6,向上或向下探尋棘突最高點(diǎn)，以食指定位，右手持50 μ I微量進(jìn)樣器從椎間隙垂直緩慢進(jìn)針，穿刺針進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔時(shí)有落空感，以尾巴甩動(dòng)為穿刺成功的標(biāo)志，這時(shí)即可緩慢注入藥物，注射體積為20μ I ;
異氟醚麻醉大鼠后，大鼠取俯臥位，用酒精擦拭后，左手拉直尾巴，右手持針，針尖與水平面成十五度到三十度的角，順著血管的方向，斜面向上，針尖刺入血管后立即與血管方向水平，見回血，無(wú)阻力，即可注射，注射體積為100 μ I。
[0030]機(jī)械痛閾測(cè)定
在室溫(22±1) °C的安靜環(huán)境中，采用弗萊毛(Von Frey hair, Stoelting, WoodDale,美國(guó))細(xì)絲測(cè)定機(jī)械性痛覺超敏來(lái)評(píng)定癌痛大鼠疼痛狀況。測(cè)定時(shí)將大鼠置于底為網(wǎng)格的特制有機(jī)玻璃格子(26cm X20cm X 14cm)內(nèi)，適應(yīng)20min后，根據(jù)Chaplan等(Chaplan SR, Bach Fff, Pogrel Jff, Chung JM, Yaksh TL: Quantitative assessmentof tactile allodynia in the rat paw.J Neurosci Methods 1994, 53:55-63.)介紹的up-and-down 法，將一系列 Von Frey 細(xì)絲(0.4、0.6、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0g)從2.0g力度開始參照up-and-down方法刺激大鼠移植側(cè)腳掌中部皮膚，觀察大鼠縮足反應(yīng)無(wú)反應(yīng)記為“O”，有反應(yīng)記為“X”。如果第一根毛刺激沒有反應(yīng)，則給予大一級(jí)力度的毛刺激；如果有 反應(yīng)則改用小一級(jí)力度的毛刺激，反復(fù)類推，從有反應(yīng)的那一次開始測(cè)5次，得到一串以“O”或“X”組合的序列，將該序列和最后一根毛的力度(f)輸入軟件計(jì)算出機(jī)械性疼痛閾值作為機(jī)械性痛閾值。50%縮足反應(yīng)閾值(g) =(10 [Xf + k5]) /10000。其中Xf=1g (f); δ為各個(gè)毛力度取log后的均差，在此約等于0.224;k為根據(jù)測(cè)量所得“X”、“0”序列查表后得到的值，此部分查表和計(jì)算均由軟件自動(dòng)處理。為避免頻繁或長(zhǎng)時(shí)間的刺激造成動(dòng)物耐受或痛敏，每根毛每次刺激時(shí)間為I~2s，前后兩次不同刺激間隔5min,即弗萊毛實(shí)驗(yàn)。
[0031]免疫熒光
I)標(biāo)本制備:在造模后第十一天測(cè)痛后灌流取材，大鼠麻醉后取仰臥位，開胸暴露心臟，從左心室插入灌流針頭，灌注溶液注入后，在右心耳剪口，用0.9%生理鹽水洗凈組織內(nèi)血液，速度宜快，待從右心耳流出的液體已變清亮?xí)r停止灌洗改用4%多聚甲醛灌注，然后取脊髓L4-L5段，放入20%蔗糖溶液中4°C冰箱過(guò)夜，待組織沉底后放入30%蔗糖溶液中4°C冰箱過(guò)夜，恒溫切片機(jī)(Leica 2000)，制備30 μ m厚的脊髓薄片，放入保護(hù)液中，_20°C冰箱保存。
[0032])免疫熒光的方法:取出脊髓片，用0.01M的PBS漂洗3X5min，放入封閉液中37°C孵育Ih,取出后放入一抗(兔抗ALX為1: 400，小鼠抗NeuN為1: 500，小鼠抗CDllB為1: 200，小鼠抗GFAP為1:1000)，4°C搖床過(guò)夜。次日，脊髓片自一抗中取出，用0.01M的PBS漂洗3X10min，放入二抗(羊抗兔1:1000，羊抗小鼠1:1000)，避光37°C孵育Ih后，用
0.01M的PBS漂洗3X lOmin，用抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡下拍照。
[0033])蛋白樣品制備:常規(guī)處理大鼠，取脊髓L4-L5段，按20mg/100 μ I加入Ripa裂解液(含PMSF)，冰浴IOmin,低溫超聲勻漿，以13000 r/min 4_7°C離心15min，取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，按比例添加5X凝膠上樣緩沖液，放入沸水中煮8min，室溫靜置30min后，分裝置于_20°C冰箱備用。
[0034]) SDS-PAGE電泳:分別制備10%分離膠和5%基層膠，待膠凝固后上樣，每孔7 μ I約40 μ g,加樣后凝膠放置于裝有電泳緩沖液的電泳槽進(jìn)行電泳，電泳條件:積層膠70V約50min跑至分離膠時(shí)換成電壓120V，待樣品中的溴酚藍(lán)遷移至膠的邊緣時(shí)結(jié)束電泳，將膠卸下，在IOOV電壓下轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為llOmin，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入封閉液中4°C搖床孵育2h，封閉后將PVDF膜放入一抗反應(yīng)液(兔抗ALX，1:1000溶于封閉液)4°C搖床孵育過(guò)夜，次日將PVDF膜自一抗中取出，I XTBST漂洗3X lOmin，放入二抗(羊抗兔，按照 1:5000)，4°C搖床孵育 2h，I X TBST 漂洗 3 X lOmin，加 ECL 發(fā)光液，用 Image QuantLAS 4000mini化學(xué)發(fā)光成像儀拍照；
3)用成像儀自帶軟件分析，以各組GAPDH條帶的掃描值標(biāo)化相應(yīng)組的ALX的蛋白表達(dá)量。
[0035])總RNA提取:每組大鼠麻醉后取脊髓，按照Trizol法提取總RNA。
[0036])引物設(shè)計(jì):IL-1@，IL-6，TNF-α引物參考文獻(xiàn)(Wang J, Li J, Sheng X，Zhao H，Cao XDj Wang YQj Wu GC: Beta—adrenoceptor mediated surgery-1nducedproduction of pro-1nflammatory cytokines in rat microglia cells.J Neuroiwmunol2010，223:77-83.)并用Blast驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)釆用GAPDH作為內(nèi)參，引物序列如下:
Primer GAPDH:Forward: 5’ -cccttcattgacctcaactac_3’
Reverse: 5’ -cttctccatggtggtgaagac-3^
Primer IL-1β: Forward: 5’ -atgagagcatccagcttcaaatc-3^
Reverse: 5’ -cacactagcaggtcgtcatcatc -3’
Primer IL-6: Forward: 5’ - gacaaagccagagtccttca -3’
Reverse: 5’ - actaggtttgccgagtagac -3’
Primer TNF- a: Forward: 5’ - cgagatgtggaactggcaga -3’

Reverse: 5’ - ctacgggcttgtcactcga -3’
3)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈:在0.2ml無(wú)RNase的PCR管中依次加入以下試劑:TotalRNA (lug/ μ I) 2 μ 1，Oligo dT (0.5ug/ μ I) I μ I, DEPC H2O (Rnase-free)調(diào)體積至12μ 1 7(TC變性 5min，冰浴 5min。加入 5XRT buffer 5μ1，10 mM 4dNTPs 2μ1，RNase inhibitor(40U/μ I) 0.5μ 1，M-MLV Reverse Transcriptase (200U/μ I) I μ 1，DEPC H2O 4.5μ 10 37°C水浴 60 min，95°C水浴 5min，冰浴 5min。
[0037]) Real-Time PCR:在 0.2ml PCR 管中依次加入以下試劑:2X SybrGreen12.5 μ I, Sense primer I μ 1，Antisense primer I μ 1，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μ I, dd H2O8.5μ1 混勻，瞬時(shí)離心，上機(jī)，94°C 45s，59DC (IL-1 β，IL-6，TNF-α ) lmin，72°C lmin。參照 Livak 等(Livak KJj Schmittgen TD: Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.MetAods2001，25:402-408.)，用 2 aaCT 法分析結(jié)果。
[0038]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSSl 1.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以
X 土 S表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，P〈0.05為顯著性差異。
[0039]行為學(xué)結(jié)果顯示:
脛骨癌痛模型評(píng)價(jià):各組在造模前基礎(chǔ)痛閾無(wú)差異，造模后從第三天開始，Cancer組和Sham組相比,痛閾顯著降低(Ρ〈0.001)持續(xù)到觀察結(jié)束，Sham組和Naive組間無(wú)差異(如圖1A所示)。
[0040]鞘內(nèi)給予脂氧素及其類似物對(duì)脛骨癌痛大鼠痛閾影響:各組在造模前基礎(chǔ)痛閾無(wú)差異，造模后第i 天測(cè)痛，各模型組痛閾均顯著降低，組間無(wú)差異，給藥后，與Cancer+NS組相比，Cancer+ATL組從給藥后2h開始痛閾顯著升高(P〈0.001)持續(xù)到給藥后6h，Cancer+LXA4組在給藥后2h痛閾升高(P〈0.01)，Cancer+LXB4組在給藥后2h痛閾也有提升(P〈0.05)，與 Cancer+ATL 組相比，Cancer+LXA4 組在給藥后 4，6h 有差異(Ρ〈0.01)，Cancer+LXB4組在給藥后2，4，6h均有差異(如圖1B所示)，LXA4，ATL, LXB4三者從鎮(zhèn)痛時(shí)程和峰值比較，ATL對(duì)脛骨癌痛大鼠鎮(zhèn)痛效果更好，因此后續(xù)關(guān)于脂氧素對(duì)脛骨癌痛大鼠鎮(zhèn)痛效果的研究均以ATL為主。
[0041]鞘內(nèi)給予 脂氧素及其類似物對(duì)正常大鼠痛閾影響:各組在給藥前測(cè)基礎(chǔ)痛閾，無(wú)差異，給藥后2，4，6h測(cè)痛，各組間無(wú)差異(如圖1C所示)，表明脂氧素及其類似物對(duì)正常大鼠的痛閾無(wú)影響。
[0042]鞘內(nèi)給予不同劑量ATL對(duì)脛骨癌痛大鼠痛閾影響:各組在造模前測(cè)基礎(chǔ)痛閾，無(wú)差異，造模后第i 天測(cè)痛，各模型組痛閾均顯著下降，組間無(wú)差異，與Cancer+NS組相bt, Cancer+ATL 0.03 nmol 和 Cancer+ATL 0.3 nmol 從給藥后 2h 痛閾提高，持續(xù)到 6h(P<0.05)；Cancer+ATL 0.45 nmol從給藥后2h痛閾升高，持續(xù)到給藥后8h (p〈0.05)，并且在4h和6h (Ρ〈0.001)如圖1D所示。
[0043]系統(tǒng)給予不同劑量ATL對(duì)脛骨癌痛大鼠痛閾影響:各組在造模前測(cè)基礎(chǔ)痛閾，無(wú)差異，造模后第i 天測(cè)痛，各模型組痛閾均顯著下降，組間無(wú)差異。給藥后，與Cancer+NS組相比，Cancer+ATL 120 nmol/kg組在給藥后痛閾顯著升高持續(xù)到給藥后4h,其中
3,4h(P<0.01) ; Cancer+ATL 30 nmol/kg 在給藥后 3h 痛閾升高(Ρ〈0.05)，如圖1E 所示。
[0044]免疫組化結(jié)果:
脂氧素受體(ALX)在脊髓背角的表達(dá)與分布:
I) ALX主要分布于脊髓背角淺層,在Naive, Sham和Cancer組間無(wú)顯著差異，如圖2B所示。
[0045]2)ALX與神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞均有共標(biāo),但是與小膠質(zhì)細(xì)胞沒有共標(biāo),提示,ALX主要分布于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，如圖3，4，5所示。
[0046]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯不,脂氧素受體蛋白在Naive, Sham和Cancer組無(wú)顯著差異(如圖2A所示)。
[0047]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Naive組相比，Cancer+NS組IL-1 β，IL-6，TNF-α均顯著升高(Ρ〈0.01),與Cancer+NS組相比，Cancer+ATL組的IL-1 β和TNF-α的表達(dá)是下調(diào)的(P<0.05)， 如圖6所示。
【權(quán)利要求】
1.脂氧素及其類似物在制備治療疼痛制劑中的用途。
2.脂氧素及其類似物在制備治療急/慢性痛的鎮(zhèn)痛疫苗中的應(yīng)用。
3.脂氧素及其類似物在制備治療急/慢性痛的鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
4.按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于疼痛是骨癌痛。
5.按權(quán)利要求1，2或3所述的用途，其特征在于，所述的脂氧素其類似物包括LXA4，LXB4 和 ATL。
【文檔編號(hào)】A61P29/00GK103845337SQ201210518315
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月5日
【發(fā)明者】胡珊, 王彥青, 王志福, 吳根誠(chéng) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)