專利名稱：一種防治奶牛乳房炎的多價卵黃免疫球蛋白的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及到奶牛養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到一種防治奶牛乳房炎的卵黃免疫球蛋白(IgY)及其制備方法，此種IgY可以用作飼料添加劑或藥物浸浴劑或潑灑劑的活性成分防治奶牛乳房炎。
2.
背景技術(shù)：
2. I奶牛乳房炎奶業(yè)是節(jié)糧、高效、產(chǎn)業(yè)關(guān)聯(lián)度高的產(chǎn)業(yè)。奶業(yè)的平穩(wěn)健康發(fā)展，對于改善居民膳 食結(jié)構(gòu)、提高全民身體素質(zhì)，促進(jìn)農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、農(nóng)民增收及城鄉(xiāng)協(xié)調(diào)發(fā)展，帶動國民經(jīng)濟(jì)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展等，都具有十分重要的意義。改革開放以來，我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，1990年全國奶牛存欄量為268萬頭，2000年存欄量達(dá)490萬頭，2006年存欄量達(dá)到1401萬頭、牛奶產(chǎn)量3245萬噸，成為僅次于美國、印度的第三大產(chǎn)奶國。但是，奶牛乳腺炎作為奶牛養(yǎng)殖業(yè)中一種常見、復(fù)雜的疾病，給各國奶業(yè)帶來巨大的負(fù)面影響，是造成奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要原因。據(jù)報道，在美國，被淘汰的奶牛中26. 5%是因為患有乳腺炎，而在芬蘭、挪威和瑞典因為乳房健康問題而被淘汰的奶牛分別占35 %、19 %和22 % (儲明星等，2001)。在我國，奶牛乳腺炎被認(rèn)為是奶牛場最嚴(yán)重的疾病之一，其發(fā)病率達(dá)20 9Γ70 %，每年因乳腺炎造成的經(jīng)濟(jì)損失為15(Γ450億人民幣。此外，奶牛乳腺炎在造成經(jīng)濟(jì)損失、降低牛奶品質(zhì)的同時，也間接的危害著人類的健康。乳腺炎是奶牛的一種常見多發(fā)病，分為臨床型和隱性型兩種。臨床型乳腺炎是乳腺體或乳腺體周圍結(jié)締組織的炎癥或是兩者同時發(fā)炎，隱性型乳腺炎是乳腺體的部分乳腺小葉的炎癥。隱形乳腺炎由于沒有臨床癥狀，易被忽視，更易造成經(jīng)濟(jì)損失。而奶牛乳腺炎的主要形成原因是由病原微生物引起的。已發(fā)現(xiàn)約有150種病原體可引起奶牛乳腺炎，其中，金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌是3種最主要的致病菌。盡管西方一些國家對此病已進(jìn)行一百多年的研究，但至今仍未能提出一個徹底解決的辦法。而我國對此病的研究起步較晚，始于20世紀(jì)80年代初，雖在20多年的研究中取得了顯著的成績，但仍未達(dá)到徹底解決的目標(biāo)。早期，對乳腺炎防治的研究主要集中在抗生素上，自從1945年青霉素用于治療乳腺炎以來，因其療效顯著而使抗生素治療奶牛乳腺炎得到了不斷的發(fā)展。大量抗生素在乳腺炎的治療中得到廣泛應(yīng)用，如四環(huán)素、慶大霉素、紅霉素、頭孢菌素、多粘菌素等。抗生素的療效與抗生素本身的性質(zhì)、到達(dá)乳房的有效濃度、用藥次數(shù)及給藥時間等有關(guān)。在抗生素治療奶牛乳腺炎的過程中諸多不利因素也逐漸呈現(xiàn)出來一，致病細(xì)菌易出現(xiàn)抗藥性，導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)；二，單一藥物抗菌譜不夠廣，往往需要幾種抗生素聯(lián)合使用，花費較高；三，導(dǎo)致其他一些副作用，如腸道菌群失調(diào)，影響食欲等；四，造成牛奶中藥物殘留及奶牛體內(nèi)藥物積蓄，間接危及人類健康。GUler等檢測了 265株分離自乳腺炎奶樣的金黃色葡萄球菌，其中63. 3 %對青霉素和阿莫西林有耐藥性，27. 9 %對四環(huán)素不敏感，對復(fù)方新諾明產(chǎn)生耐藥性的占I. 8 %，未分離到對諾氟沙星、卡那霉素的耐藥菌株。在抗生素治療奶牛乳腺炎的諸多不利因素中，細(xì)菌耐藥性導(dǎo)致抗生素對奶牛乳腺炎的療效降低是急需解決的問題。中草藥治療是目前國內(nèi)外關(guān)注的熱門課題，中草藥不僅能夠抗菌消炎還具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能、行氣活血、散結(jié)消腫、通經(jīng)下乳等功能，在治愈乳腺炎的同時，還能促進(jìn)奶牛乳汁分泌。現(xiàn)報道治療乳腺炎的中草藥主要有魚腥草、蜂膠合劑、公英瓜萎湯、桃紅散、復(fù)方丹參液、枇杷葉、綠草素等。其不足之處表現(xiàn)在一，品種較少，大多停留在散劑、煎劑等劑型上；二，生產(chǎn)工藝相對滯后，有效成分不能充分提取利用；三，中藥配方無固定標(biāo)準(zhǔn)，使用者大多自行配方；四，奶中殘留大量的中藥，嚴(yán)重影響牛奶的風(fēng)味。免疫療法作為控制奶牛乳腺炎的新的突破口正日益受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。作為主動免疫療法，采用疫苗防治乳腺炎是通過注入滅活菌或弱毒苗激發(fā)病牛體內(nèi)的特異抗體達(dá)到殺菌消炎的目的。金黃色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的主要致病菌，針對該菌的疫苗研究較多，包括滅活菌苗、活菌苗和亞單位苗。Watson等采用活的金黃色葡萄球菌苗,Nordhaug 等采用滅活的金黃色葡萄球菌苗治療奶牛乳腺炎。金黃色葡萄球菌有多種血清型，引起乳腺炎的主要是5、8和336三種血清型的金黃色葡萄球菌。Ma等以5株此三種血清型的金黃色葡萄球菌的混合菌苗治療奶牛乳腺炎。目前使用的亞單位苗主要針對金黃色葡萄球菌的莢膜多糖、細(xì)菌毒素及黏附因子等菌體的組成部分或分泌物。這些疫苗只能一定程度地預(yù)防乳腺感染，對已經(jīng)感染的乳腺療效不佳。大腸埃希氏桿菌J5 (0111:B4)是一種粗糙型變種，具有不完全O-多糖成分，核心抗原暴露在外，容易產(chǎn)生免疫應(yīng)答。Hogan等以該疫苗免疫奶牛，可使奶牛臨床型乳腺炎的發(fā)生率降低，但并沒有減少乳腺感染革蘭陰性的菌幾率，產(chǎn)奶量和陰性對照組比較也無明顯差異。但這些疫苗只能一定程度地預(yù)防乳腺感染，對已經(jīng)感染的乳腺療效不佳，同時，由于致病因素復(fù)雜，目前的疫苗很難對各種乳腺炎都起到良好的治療效果，多聯(lián)疫苗有望解決此問題。卵黃免疫球蛋白(egg yolk immunoglobulin, IgY),又稱為卵黃抗體,是大量存在于禽類卵黃中的免疫球蛋白。當(dāng)用某種抗原免疫雌性禽類后，機(jī)體可產(chǎn)生針對這一抗原的持久性應(yīng)答，血清中首先產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體，隨后這些抗體會被選擇性地轉(zhuǎn)移到卵黃中。IgY具有無毒、無殘留、不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，發(fā)展前景備受矚目。目前研究較多的是雞卵黃抗體。IgY的特點及優(yōu)越性體現(xiàn)在如下方面一，禽類與哺乳類種系發(fā)生學(xué)距離遠(yuǎn)，因此禽類更適于生產(chǎn)抗哺乳動物抗原的抗體，并且IgY比哺乳動物IgG對抗原的親和力更高。二，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。卵黃抗體作為一種具有生物活性的免疫球蛋白，在貯存、生產(chǎn)和加工以及攝食及消化過程中，保證抗體活性的穩(wěn)定性是非常關(guān)鍵的。多項試驗表明，雞IgY具有較好的穩(wěn)定性，耐酸、耐堿、耐熱。三，在實際生產(chǎn)中，動物的采血不僅對動物本身是極大的應(yīng)激，而且費時、費工，大規(guī)模生產(chǎn)是不切實際的，而利用蛋雞生產(chǎn)抗體要方便的多。四，IgY作為外源性抗體給予動物口服或外用后，可與抗原物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，從而發(fā)揮其中和、抑制、清除病原體(如細(xì)菌、毒素、病毒等)的生物學(xué)功能。五，IgY來源于卵黃，作為藥物使用，不會導(dǎo)致不良反應(yīng)，也不會因為蓄積而造成中毒?；贗gY的上述種種優(yōu)良特性，人們先后開發(fā)了一些用于口服或注射的卵黃抗體產(chǎn)品，這些產(chǎn)品在防治人畜疾病方面均取得了一定的效果。2. 2金黃色葡萄球菌外毒素與乳房炎關(guān)系
2.2.1 PVL殺白細(xì)胞素及α-毒素與乳房炎的關(guān)系Bramley等在小鼠乳房炎模型中發(fā)現(xiàn)，表達(dá)α-毒素及β-毒素的金葡菌與其突變株相比明顯更易于在乳腺中定殖并增殖，而且這項研究表明α -毒素表達(dá)株可使60%的小鼠在48小時內(nèi)致死，α-毒素突變株可引起慢性乳房炎，但是小鼠并不死亡。奶牛乳腺內(nèi)的嗜中性粒細(xì)胞(PMNs)是機(jī)體對抗感染的主要殺傷性細(xì)胞。Barrio等研究表明，O. InM的PVL-殺白細(xì)胞素在Ih內(nèi)就可裂解掉約90%的PMNs。由于金葡菌可表達(dá)眾多細(xì)胞外毒素，所以很難建立動物模型考察單一毒素(只表達(dá)一種毒素)對乳房炎的作用，研究人員只能將毒素純化或者通過定點突變的方式使細(xì)菌不能表達(dá)某一毒素，從而考察其在乳房炎中的作用。這些方法雖然有用，但是很難避免其他毒素對這一毒素的影響。這也是為什么人們猜測很多毒素都對乳房炎有致病力，但是只有少數(shù)的幾種有詳細(xì)的研究。如今，人們已經(jīng)把體外表達(dá)技術(shù)及信號標(biāo)簽突變技術(shù)應(yīng)用其中，期待著有更有力的數(shù)據(jù)問世。2. 2. 2金葡菌超抗原與奶牛乳房炎關(guān)系超抗原是一種很強(qiáng)的T細(xì)胞激活劑，不需要抗原提成細(xì)胞的提呈就能激活T細(xì)胞。 其主要依靠與牛T細(xì)胞受體的區(qū)結(jié)合，這個區(qū)域位于與普通抗原結(jié)合的區(qū)域的外面。因此，超抗原的激活反應(yīng)特異性很低，絕大多數(shù)T細(xì)胞都可被其激活，結(jié)果釋放出大量細(xì)胞因子，T細(xì)胞大量增殖，同時可能使牛T細(xì)胞能量耗盡而凋亡。很多金黃色葡萄球菌超抗原與奶牛乳房炎相關(guān)，尤其是其中的葡萄球菌腸毒素c (SEC)及毒素休克綜合癥毒素-I(TSST-1)，這兩種毒素是典型的引起人類及動物疾病的細(xì)菌超抗原家族成員。金葡菌超抗原有一定宿主特異性，如牛專一'I"生葡萄球菌腸毒素C (SEC-bovine),其氨基酸結(jié)構(gòu)與人、羊和狗身上分離出的金葡菌所表達(dá)的腸毒素C略有不同。用SEC處理牛外周血單核細(xì)胞后會引起IL-4表達(dá)水平的升高，而IL-12水平下降，這是典型的2型反應(yīng)，這與其他動物對超抗原的反應(yīng)(I型反應(yīng))明顯不同。這個效應(yīng)的結(jié)果尚不清楚，而有些研究人員認(rèn)為表達(dá)超抗原的金葡菌易于侵入機(jī)體細(xì)胞，而且引起長時間感染，癥狀難以消退。本項目以奶牛乳腺炎的主要致病菌金黃色葡萄球菌和及其外毒素，免疫蛋雞，制備多價特異性IgY，并將其開發(fā)成不同劑型，用于奶牛乳腺炎的預(yù)防和治療。特異性IgY的應(yīng)用將為奶牛乳腺炎的預(yù)防和治療提供一條新的途徑，可大大降低引乳腺炎給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失；用安全、綠色的IgY替代抗生素治療奶牛乳腺炎，可避免牛奶中抗生素的殘留，對保證人類的身體健康具有重要意義。目前，已公開的03117508. 2,200310112151. 8 和 US005585098A 專利文獻(xiàn)雖然提供了一種使用卵黃免疫球蛋白預(yù)防或治療奶牛乳房炎的方法，但上述發(fā)明依然存在以下不足(I).以上現(xiàn)有專利都存在抗菌譜覆蓋不全的問題。致奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌莢膜的主要血清型為5型，8型和336型。由于卵黃抗體的高度特異性，單獨針對一種血清型生產(chǎn)卵黃抗體不能對抗所有類型的金黃色葡萄球菌。(2).忽略了金黃色葡萄球菌外毒素在奶牛乳房炎中的作用。金黃色葡萄球菌的α -溶血素被認(rèn)為是破壞奶牛乳腺上皮細(xì)胞的關(guān)鍵毒力因子，其能在細(xì)胞上打孔使內(nèi)容物釋放引起炎癥反應(yīng)。此外PVL殺白細(xì)胞素能夠在納克級殺死98%的嗜中性粒細(xì)胞，而這種細(xì)胞是乳房炎的主要防御性細(xì)胞。(3).以上專利沒有體外的細(xì)胞實驗作為理論支持。本實驗在制備特異性IgY的基礎(chǔ)上，在體外進(jìn)行了特異性抗體對金黃色葡萄球菌侵入奶牛上皮細(xì)胞的阻斷作用研究，以及特異性抗體中和外毒素對乳腺上皮細(xì)胞及奶牛嗜中性粒細(xì)胞裂解作用的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種防治金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎的卵黃免疫球蛋白(IgY)，并且進(jìn)一步完善該IgY的制備方法，將其通過乳池注射應(yīng)用于奶牛乳房炎的防治，達(dá)到抑殺細(xì)菌和增強(qiáng)牛體免疫功能的雙重效果，顯著降低乳汁中的體細(xì)胞數(shù)，提高治愈率，解決目前在防治奶牛乳房炎方面大量使用抗生素的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種防治奶牛乳房炎的多價卵黃免疫球蛋白的制備方法，采用5型、8型和336型三種血清型金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)全菌及其外分泌毒素經(jīng)滅活處理后 分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑混合，充分乳化，制成弗式完全佐劑疫苗和弗式不完全佐劑疫苗；初免采用弗氏完全佐劑疫苗，二免和三免采用弗式不完全佐劑疫苗；初免每只雞胸肌注射2到6點，頸部皮下注射I到3點，每點O. I ml-0. 3 ml ;初免后2周進(jìn)行二免，方法同初免，每點免疫劑量增加至O. 2 ml-0. 4 ml ;二免后2周進(jìn)行三免,每點免疫劑量增加至O. 3 ml-0. 5 ml ;定期收集免疫雞蛋的蛋黃，運用水稀釋法、二次鹽析法、超濾技術(shù)分離純化特異性卵黃免疫球蛋白。本發(fā)明制備的多價卵黃免疫球蛋白的應(yīng)用，制劑用于乳池注射。4.多價卵黃抗體制備及其實施例4. I多價卵黃抗體制備4. I. I金黃色葡萄球菌5型，8型，336型全菌抗原的制備將5 型(Lowenstein， ATCC49521)，8 型(Wright， ATCC49525)，336 型(336，ATCC55804)金黃色葡萄球菌劃線接種于補(bǔ)加2% NaCl的哥倫比亞瓊脂平板上，37° C倒置培養(yǎng)24小時，這一方法可以加強(qiáng)莢膜的表達(dá)。用接菌環(huán)將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到PBS中，4° C下6000rpm離心15分鐘。棄去上清，用含1%福爾馬林的PBS重懸，放于4° C過夜。用PBS將菌體清洗2次后取一定量涂于大豆蛋白胨培養(yǎng)基上，檢測是否有活菌。剩余菌液于6000 rpm離心后凍干，菌體于4° C保藏于離心管中。4. I. 2金黃色葡萄球菌混合外毒素的制備將金黃色葡萄球菌菌株V8和RN6390分別接種于改良的CCY培養(yǎng)基和大豆蛋白胨培養(yǎng)基中，此兩種培養(yǎng)基有利于毒素的表達(dá)。接種物于37° C震蕩(200 rpm)培養(yǎng)過夜，將菌液離心(6000 rpm, 4° C，10分鐘)，上清經(jīng)過O. 22 Mm濾膜過濾后混合于大燒杯中后放于4° C。緩慢加入80%飽和度(0° C)的硫酸銨同時不斷攪拌，待硫酸銨全部溶解后放于4° C過夜。離心(6000 rpm，4° C，10分鐘)棄上清，用蒸餾水將沉淀重懸后加入等體積的2%甲醒溶液(溶于蒸懼水)。4° C放置過夜。將滅活的毒素溶液放于1000道爾頓的透析袋中對蒸餾水透析。透析在4° C下進(jìn)行，透析要持續(xù)三天。透析完畢后進(jìn)行冷凍干燥，待成粉末后于4° C保存。4. 2蛋雞免疫4. 2. I免疫方法采用上述方法制備的單一抗原或復(fù)合抗原，與福氏完全佐劑或福氏不完全佐劑分別等體積混合后，分別對待開產(chǎn)或新開產(chǎn)的健康無病雞進(jìn)行初免和加強(qiáng)免疫，共計三次，每次免疫前取血測定抗體效價，當(dāng)效價達(dá)到平臺期后，收集免疫蛋，置4° C保存。以上免疫方法和注射頻率可根據(jù)實際情況適當(dāng)調(diào)整和變化；亦可用上述同樣的免疫技術(shù)，采用上述抗原，分別對產(chǎn)蛋母鴨或母鵝或火雞或鴕鳥等不同產(chǎn)蛋禽類進(jìn)行免疫，獲得相應(yīng)的IgY。4. 2. 2 ELISA檢測莢膜特異性卵黃抗體水平每隔一周收集一次各組蛋雞所廣雞蛋。將蛋黃液分尚出來后收集在一起，加入5倍體積的蒸餾水充分混勻。將混合物PH調(diào)至5. O到5. 2放于4° C過夜。離心取得上清即為水溶性組分，最后將水溶性組分過O. 22ΜΠ1濾膜。對于IgY-336，將凍干的336菌體溶于碳酸氫鈉緩沖液中(O. 4 mg/ml )，取ΙΟΟμΙ加入ELISA板中37° C孵育90分鐘。對于5型和8型的細(xì)菌，包被濃度相同，不同的是包 被緩沖液用的是PBS，而且孵育時間為6小時。將水溶性組分稀釋1:250進(jìn)行ELISA檢測。二抗稀釋倍數(shù)為1:5000。結(jié)果經(jīng)5型，8型及336型全菌免疫后相應(yīng)的抗體IgY_T5，IgY_T8，IgY-336水平有非常顯著升高，OD值可達(dá)I. 2。具體的，經(jīng)過第一次免疫抗體水平?jīng)]有明顯變化，而第二次免疫后也即第一次加強(qiáng)免疫后抗體水平顯著升高，第二次加強(qiáng)免疫后抗體水平繼續(xù)升高。第五至七周抗體水平達(dá)到平臺期。4. 2. 3抗毒素IgY水平檢測采用間接ELISA法測定免疫后不同時間卵黃水溶性組分中的抗體效價，效價以WSF的稀釋倍數(shù)表示。操作如下(I)用包被緩沖液稀釋混合毒素至Img蛋白/mL，包被酶標(biāo)板，100 μ I/孔，37 ° C溫育2小時；(2)洗滌液洗板三次，封閉液封閉，100 μ I/孔，37° C溫育I小時；(3)洗滌液洗板三次，每孔加入以稀釋液倍比稀釋(I :250)的WSF 100 μ L。同時加入陰性對照(用BSA免疫所得的WSF，I :250稀釋)和空白對照(生理鹽水)，100 μ I/孔，37° C溫育2小時；(4)洗滌液洗板三次，加過氧化物酶HRP標(biāo)記二抗，100 μ I/孔，37° C溫育Ih;(5)洗滌液洗板三次，加TMB工作液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，100 μ I/孔，陰暗處反應(yīng)20分鐘；(6)加終止液，50 μ I/孔，酶標(biāo)儀檢測OD值(檢測波長450 nm，參比波長630nm)；結(jié)果經(jīng)混合毒素免疫后雞蛋中產(chǎn)生大量抗毒素的卵黃抗體，其ELISA檢測的OD值可達(dá)O. 4左右而BSA組蛋雞所產(chǎn)生的抗體相應(yīng)的ELISA OD值只有約O. 02。抗毒素IgY水平呈現(xiàn)持續(xù)升高的狀態(tài)。4. 2. 4三種表面抗原特異性IgY的交叉反應(yīng)96孔ELISA板用金黃色葡萄球菌菌株336, RN6390, Lowenstein, Wright以及保加利亞乳桿菌全菌粘板。用PBS將特異及非特異性抗體進(jìn)行2倍梯度稀釋(I :2-1:1024)加到孔內(nèi)，37C作用I個半小時后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞抗體。作用一段時間后加入TMB,反應(yīng)20分鐘后在450/630nm測0D，以達(dá)到I. 2的稀釋度評價抗體的特異性。
結(jié)果三種IgY (IgY-T5, IgY-T8, IgY-336)與各自的免疫原所結(jié)合達(dá)到OD值I. 2所對應(yīng)的稀釋度都達(dá)到約1:256，而對于非特異性免疫原，其相應(yīng)稀釋度均為1:8。同時實驗結(jié)果告訴我們?nèi)N金黃色葡萄球菌特異性IgY對乳酸發(fā)酵用保加利亞乳桿菌沒有結(jié)合作用。4. 3特異性卵黃抗體的大規(guī)模分離純化(I)水稀釋當(dāng)免疫禽蛋達(dá)一定數(shù)量后，用O. 2^0. 5%的新潔爾滅或高錳酸鉀水溶液洗凈蛋殼表面，再用5%碘酊消毒，最后用75%的酒精脫碘兩次。打蛋機(jī)打碎免疫蛋，分離卵黃。用滅菌水或緩沖液將具有免疫活性的卵黃液稀釋6 10倍，HCl調(diào)pH至5 5. 2，于4° C下靜置12 18h，4。C 10000 r/min離心25分鐘，取上清，經(jīng)O. 45 μπι濾膜過濾，收集濾液即為WSF。
⑵鹽析在WSF中緩慢加入(NH4)2SO4至60%飽和度，混勻，待完全溶解后置4° C過夜。4° C 10000 rpm離心15分鐘，棄上清，用去離子水重新懸浮沉淀至原體積，再加入14 %(w/V)的Na2SO4混勻，置室溫過夜。25。C 10000 rpm離心15分鐘，棄上清，用去離子水重新懸浮沉淀至原體積，即為二次鹽析組分。⑶超濾采用截流分子量為100 KD的超濾膜對二次鹽析組分進(jìn)行脫鹽、濃縮。(4)冷凍干燥在-70° C低溫冰箱中將待干燥樣品預(yù)凍2 h，然后置于干燥盤中，在真空度20 Pa條件下，進(jìn)行冷凍干燥，凍干粉保存、待用。
4.具體實施例方式以下結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的實施例。實施例I三種不同IgY對乳腺上皮細(xì)胞的保護(hù)作用此實驗用奶牛乳腺上皮細(xì)胞系MAC-T細(xì)胞進(jìn)行。在24孔板中將MAC-T細(xì)胞培養(yǎng)至近95%鋪滿孔底形成細(xì)胞單層。用DMEM培養(yǎng)基將特異性及非特異性抗體溶解至10mg/ml，用兩次O. 22Mm濾膜過濾除菌。用無菌PBS將三種莢膜血清型的細(xì)菌調(diào)到0D_為O. 06 (約IO7 CFU/ml)。將2毫升菌液與2毫升卵黃抗體液混合加到細(xì)胞單層，此時感染復(fù)數(shù)(MOI)約為50，37C培養(yǎng)6小時后將培養(yǎng)上清吸走用PBS輕輕洗兩次。加入兩毫升lOOPg/ml的慶大霉素孵育2小時殺死細(xì)胞外細(xì)菌。用PBS輕輕將細(xì)胞單層清洗三次后加入一定量的胰酶將細(xì)胞從培養(yǎng)板上消化下來，然后加入Triton X-100裂解細(xì)胞。將裂解液以10倍梯度稀釋涂平板進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。結(jié)果對于三種血清型金黃色葡萄球菌，如果沒有卵黃抗體的話很容易侵入上皮細(xì)胞，非特異性抗體可一定程度上(約I個log單位)降低細(xì)菌對上皮細(xì)胞的侵染，而特異性抗體可以更明顯地抑制細(xì)菌的侵襲(約3個log單位)?？傮w看，無莢膜細(xì)菌(336)型侵入上皮細(xì)胞的能力更強(qiáng)，同樣水平的細(xì)菌在同一時間侵入細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)約為有莢膜菌的10倍。
實施例2抗毒素IgY對乳腺上皮細(xì)胞系的保護(hù)作用將V8，RN6390的24小時培養(yǎng)液離心后收集上清，O. 22 μ m濾菌膜過濾后與DMEM-按I: I混合，分裝于-20 ° C保存。將MAC-T細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，采用DMEM++培養(yǎng)基培養(yǎng)至長滿瓶底95%，消化后轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔10000細(xì)胞，培養(yǎng)至95%融合度。將培養(yǎng)基吸掉，用PBS將細(xì)胞單層清洗三次，加入毒素培養(yǎng)液混合物以及相應(yīng)的抗體，對照組加入抗BSA抗體，培養(yǎng)5小時，吸取上清用LDH試劑盒檢測上清中釋放的LDH水平。結(jié)果抗BSA IgY不能保護(hù)外毒素對乳腺上皮細(xì)胞的裂解，其LDH釋放量達(dá)到約500 U/L。相比之下，抗毒素IgY可明顯抑制外毒素對上皮細(xì)胞的裂解，培養(yǎng)上清中的LDH、釋放量約為120 U/L。實施例3抗毒素IgY對牛嗜中性粒細(xì)胞的保護(hù)作用采用Percoll密度梯度離心法從新鮮牛血中將嗜中性粒細(xì)胞(PMN)分離出來，通過胎盤藍(lán)染色確定其存活率約為95%。將PMN放于24孔板，加入毒素和抗毒素IgY，對照組加入抗BSA抗體，37° C培養(yǎng)5小時。取出一定量的培養(yǎng)上清離心后用乳酸脫氫酶試劑盒測定上清中乳酸脫氫酶的量。結(jié)果抗BSA IgY不能保護(hù)外毒素對奶牛嗜中性粒細(xì)胞的裂解，其LDH釋放量達(dá)到約600 U/L。相比之下，抗毒素IgY可明顯抑制外毒素對上皮細(xì)胞的裂解，培養(yǎng)上清中的LDH釋放量最低時約為120 U/L。實施例4混合抗體對臨床型乳房炎乳腺體細(xì)胞的影響選取臨床型乳房炎病牛其選擇標(biāo)準(zhǔn)為，奶區(qū)發(fā)燒，金黃色葡萄球菌計數(shù)為大于200CFU/ml，體細(xì)胞數(shù)在5 X IO5細(xì)胞/ml以上，每只牛只用一個奶頭。奶牛共分4組(A，B,C，D)，每組5頭，給藥方式為每天的凌晨和傍晚擠奶后給予乳池注射。對于A組，20ml內(nèi)含30mg抗毒素IgY及三種抗莢膜IgY各10mg。B組只注射三種抗莢膜IgY共60mg ；C組20ml PBS內(nèi)含I克青霉素；D組20ml內(nèi)含60mg抗BSA的IgY。SCC計數(shù)為早晚兩次計數(shù)的平均數(shù)。結(jié)果單獨施用抗表面莢膜IgY能夠一定程度上降低SCC，但是并沒有顯著性差另O。合用莢膜及外毒素IgY可明顯降低SCC，其效果與青霉素治療組相當(dāng)。
權(quán)利要求
1.一種防治奶牛乳房炎的多價卵黃免疫球蛋白的制備方法，其特征如下采用5型、8型和336型三種血清型金黃色葡萄球菌全菌及其外分泌毒素經(jīng)滅活處理后分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑混合，充分乳化，制成弗式完全佐劑疫苗和弗式不完全佐劑疫苗；初免采用弗氏完全佐劑疫苗，二免和三免采用弗式不完全佐劑疫苗；第三次免疫后，定期收集免疫雞蛋的蛋黃，獲得特異性卵黃免疫球蛋白。
2.權(quán)利要求I所述的方法制備的多價卵黃免疫球蛋白的應(yīng)用，其特征在于制劑用于乳池注射。
全文摘要
一種防治奶牛乳房炎的多價卵黃免疫球蛋白的制備方法及應(yīng)用，將其通過乳池注射應(yīng)用于奶牛乳房炎的防治，達(dá)到抑殺細(xì)菌和增強(qiáng)牛體免疫功能的雙重效果，顯著降低乳汁中的體細(xì)胞數(shù)，提高治愈率，解決目前在防治奶牛乳房炎方面大量使用抗生素的問題。
文檔編號A61K39/40GK102977209SQ201210555480
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者徐永平, 王林會, 李曉宇, 金禮吉, 甄宇紅, 尤建嵩, 續(xù)繁星, 盧亞楠 申請人:大連理工大學(xué)