用于測定至少一種酶之代謝能力的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于測定至少一種酶之代謝能力的方法。所述方法包括以下步驟：對個體呼出空氣中產(chǎn)物的濃度進行時間分辨測定，其中所述產(chǎn)物通過個體的至少一種酶對預先施用于個體之底物的代謝而產(chǎn)生，并且其中測定產(chǎn)物濃度至少直至達到所述個體呼出空氣中的最大產(chǎn)物濃度；使模型函數(shù)擬合所述產(chǎn)物濃度的測量值，所述產(chǎn)物濃度的測量值通過開始時間與終止時間之間產(chǎn)物濃度的時間分辨測定而獲得；以及基于說明所述模型函數(shù)的模型函數(shù)之參數(shù)來測定酶的代謝能力。本方法的特征在于：基于所述模型函數(shù)的至少兩個參數(shù)進行測定所述酶的代謝能力，前提是在模型函數(shù)為單指數(shù)函數(shù)的范圍內(nèi)，模型函數(shù)的最大值和模型函數(shù)的時間常數(shù)不被同時選作參數(shù)，以及另一個前提是起始時間和/或終止時間不被選作參數(shù)。
【專利說明】用于測定至少一種酶之代謝能力的方法
[0001]說明書
[0002]本發(fā)明涉及權利要求1前序部分的用于測定至少一種酶的代謝能力的方法，以及分別根據(jù)權利要求16或17的多種13C標記的底物在該方法中的用途。
[0003]在動物和人的體內(nèi)，酶對有害物質(zhì)的降解有重要貢獻。存在眾多不同的酶(例如，細胞色素)，它們催化地轉(zhuǎn)化底物。[0004]由于酶或酶系統(tǒng)(在下文中將只提及酶，但將意指酶、酶系統(tǒng)二者)發(fā)揮重要功能，因此，測定其在生物體中的功能能力(functional capacity)十分重要?，F(xiàn)今,該測定例如通過直接在生物體外檢驗細胞培養(yǎng)物來進行，但缺點是酶未在其天然環(huán)境中進行檢驗。在生物體內(nèi)進行檢驗一般涉及施用可被酶代謝的同位素標記的底物。該施用或應用通過外科介入(surgical intervention)(例如直接注入心臟)或者通過其他方法(例如口服底物)來進行。
[0005]此處非外科應用幾乎總是具有這樣的缺點:底物在血中的可得性(availability)需要數(shù)分鐘。換言之，從底物S在血中的濃度開始升高直至其達到最大濃度(不考慮由代謝引起的可能的濃度降低)的時間長度需要數(shù)分鐘。
[0006]替代方法是痕量氣體的高靈敏度檢測，無需預先施用底物。但其缺點是:必須已知受試個體的確切既往病史以及引起呼吸空氣中某種氣體富集的所有原因。然而，從原則上來說，無法足夠準確地測定既往病史。
[0007]本發(fā)明的根本目的是提供方法，通過所述方法可以高度精確地、時間分辨地(time-resolved)測定酶的代謝能力。此外，還應提供適合于該方法的底物。
[0008]用具有權利要求1之特征的方法實現(xiàn)了該目的。這種用于測定至少一種酶之代謝能力的方法包括下文中闡明的步驟:
[0009]首先，進行個體呼出的空氣中產(chǎn)物之濃度的時間分辨測定。此處，該產(chǎn)物是由預先施用于個體的底物經(jīng)個體的至少一種酶代謝而產(chǎn)生的。通常，整個酶系統(tǒng)都參與相應底物的代謝。測定產(chǎn)物濃度至少直至達到個體所呼出空氣中最大產(chǎn)物濃度。
[0010]隨后，用模型函數(shù)擬合所測量的產(chǎn)物濃度值，這些值是通過起始時間至結(jié)束時間之間的產(chǎn)物濃度的時間分辨測定而獲得的。換言之，用數(shù)學函數(shù)擬合所獲得的經(jīng)驗測量值，該數(shù)學函數(shù)可用方程式說明。
[0011]最后，基于說明模型函數(shù)的模型函數(shù)參數(shù)來測定酶的代謝能力。為此，基本上可以使用模型函數(shù)的多種參數(shù)。
[0012]所要求保護之方法的特別之處在于:酶代謝能力的測定是基于模型函數(shù)的至少兩個參數(shù)進行的。然而，這些參數(shù)不可以同時為該模型函數(shù)的最大值和該模型函數(shù)的時間常數(shù)，特別是當該模型函數(shù)為單指數(shù)函數(shù)時也是如此。此外，不可以選擇模型函數(shù)的起始時間t0和/或結(jié)束時間tm作為參數(shù)。
[0013]當滿足這些基本條件之后，可以分析多種底物的不同進程中的代謝動力學，并且因此可以分析多種產(chǎn)物之產(chǎn)生的動力學，從而最終能夠測定酶或酶系統(tǒng)的代謝能力。模型函數(shù)的所選參數(shù)允許直接得出關于酶之代謝能力的結(jié)論。酶的代謝能力可用作就特定身體機能而言地定量測定個體之健康狀態(tài)的基礎。這可以在所述過程的后續(xù)步驟中進行，這些后續(xù)步驟并非所要求保護之方法的一部分。由于酶存在于身體的多種器官或隔室(compartment)內(nèi)，所以本方法適合作為多種后續(xù)檢驗的基礎。優(yōu)選地，本方法可成為分析肝狀況(例如，表征為肝功能能力或肝中的微循環(huán))的基礎。
[0014]為了獲得所測定的酶代謝能力之可靠且重要的數(shù)據(jù)，十分有利的是確保底物在個體血中的快速可得性?？诜孜镆话悴贿m合這個目的。
[0015]將血中底物濃度(無代謝)的時間依賴(temporal dependency)表不為函數(shù)S(t)。為了給出血中底物的可得性或釋放之更為準確的定義，此處定義釋放期(releaseperiod)FZ0設Cmax為血中的預期最大底物濃度(無代謝)，t0為血中底物濃度升高至Cmax的4%至6%時所處的時刻，tm為血中底物濃度升高至Cmax的40%至60% (特別地血中底物濃度大于Cmax的40%、大于Cmax的50%或大于Cmax的60%)時所處的時刻，那么釋放期FZ由tm與tQ之間的時間差給出換言之，釋放期為血中底物濃度(基于這樣的假設:該濃度稍大于Cmax的0%，但仍然處于Cmax的個位數(shù)百分比范圍內(nèi))達到升高10倍、特別地12倍、特別地15倍以及尤其是20倍所需的時間長度。
[0016]底物的標準經(jīng)口施用的釋放期通常為大于5分鐘，并且隨著時間進展而在個體間差異很大。因此，以長釋放期施用導致歪曲的結(jié)果(distorted result)，因為這些測量結(jié)果使函數(shù)S(t)變得復雜，因未知的函數(shù)而變得“模糊(blurred)”。
[0017]從現(xiàn)有技術已知，長釋放期和在隨后測定酶代謝能力時所伴隨的缺點可通過個體的代謝裝置的靶向誘導來避免，即通過非外科施用底物來檢驗。就靶向誘導而言，底物的劑量是預定的，因此在隨后的闡明步驟中可以估算關于底物劑量的代謝裝置的反應。優(yōu)選地，單獨將氣體作為產(chǎn)物來檢驗，氣體的濃度通過因施用底物而引起的代謝裝置之誘導來改變。由底物引起的代謝裝置之誘導以及在其之后迅速速代謝應答是所要求保護之方法的后續(xù)應用的關鍵點。
[0018]在一個實施方案中，所解釋的代謝裝置之靶向誘導是本方法的一部分，其在產(chǎn)物濃度的時間分辨測定步驟之前進行。
[0019]底物的施用和釋放(其取決于施用的種類和方式)最好以這樣的方式進行:釋放期(并且因此血中底物的可得性)小于60秒，特別地小于50秒，特別地小于40秒，特別地小于30秒，特別地小于20秒，尤其是小于10秒。
[0020]因此，底物最好以能使個體血中底物的釋放時間在上述時間以內(nèi)的劑型施用。這樣的短釋放期基本上可以通過多種施用或應用形式來實現(xiàn)。此處提供幾種方法(不作為限制性的闡明):a)吸入含有底物的氣霧劑；b)經(jīng)皮膚施用，例如用高效納米載體；c) 口服通過能量吸收而釋放的可切換(特別是可活化)底物。經(jīng)口施用后，所述底物(其處于束縛態(tài)，不可降解)可因此通過施用能量(特別是光)而在一秒內(nèi)完全釋放。這樣的處于束縛態(tài)的底物在技術術語中也被稱為籠鎖化合物(caged compound)ο使用這樣的籠鎖化合物允許相應可代謝底物的超迅速且選擇性的釋放，所述釋放可在任意時間誘導。
[0021 ] 血中底物的迅速可得性保證了待檢驗代謝能力之酶的底物的迅速可得性。
[0022]當?shù)孜锎嬖谟谘胁⑶椅挥诿柑帟r，其可被酶代謝。從而產(chǎn)生一種或更多種產(chǎn)物(在下文中僅將其稱為單個產(chǎn)物)。代謝步驟必須十分迅速，最好是在10秒內(nèi)、特別地在5秒內(nèi)、特別地在I秒內(nèi)、特別地在0.1秒內(nèi)、特別地在0.0I秒內(nèi)、特別地在0.001秒內(nèi)完成。這在底物可得性的時間標度上保證了幾乎是瞬時的代謝。在底物代謝期間形成的產(chǎn)物P溶解在血中并經(jīng)肺呼出，使得其之后可以在由個體呼出的空氣中被檢測到。即使僅提及一種產(chǎn)物,從而也還包括這樣的本方法的實施方案,其中不是檢測到單個產(chǎn)物,而是檢測到多種產(chǎn)物。
[0023]可使用多種擬合函數(shù)的不同參數(shù)來說明酶的代謝能力。合適的參數(shù)之實例是來自包括以下之組的參數(shù):模型函數(shù)的最大值、模型函數(shù)的第i矩(moment)(其中i=l、2、3、4...)、模型函數(shù)的第j中心矩(其中j=l、2、3、4...)、模型函數(shù)的標準差、模型函數(shù)的時間常數(shù)、時間常數(shù)的重心、時間常數(shù)與重心之間的平均偏差、時間常數(shù)的變異(variation)、時間常數(shù)的分布、時間常數(shù)的權重、時間常數(shù)之分布的權重、時間常數(shù)之變異的權重。
[0024]模型函數(shù)的矩在例如Bronstein 和 Semendjajew 的 Handbook of mathematics(665至668頁，第25版，1991)中闡明。在該參考文獻中，還能找到許多可以在本發(fā)明范圍內(nèi)單獨使用或彼此組合使用的其他模型函數(shù)和模型參數(shù)。
[0025]十分適合說明模型函數(shù)的兩個參數(shù)的實例是呼吸空氣中產(chǎn)物P的最大濃度或量Pmax和模型函數(shù)的從h到tm的第一矩(f irst moment)。第一矩M1定義為:
【權利要求】
1.用于測定至少一種酶之代謝能力的方法，其包括以下步驟: ?對個體呼出空氣中產(chǎn)物的濃度進行時間分辨測定，其中所述產(chǎn)物通過所述個體的至少一種酶對預先施用于所述個體之底物的代謝而產(chǎn)生，并且其中對所述產(chǎn)物濃度的測定至少進行到達到所述個體呼出空氣中的最大產(chǎn)物濃度； ?使模型函數(shù)擬合所述產(chǎn)物濃度的測量值，所述產(chǎn)物濃度的測量值通過開始時間與終止時間之間所述產(chǎn)物濃度的時間分辨測定而獲得；以及 ?基于說明所述模型函數(shù)的所述模型函數(shù)之參數(shù)來測定所述酶的代謝能力， 其特征在于， 基于所述模型函數(shù)的至少兩個參數(shù)進行測定所述酶的代謝能力，前提是如果所述模型函數(shù)為單指數(shù)函數(shù)，則模型函數(shù)的最大值和模型函數(shù)的時間常數(shù)不被同時選作參數(shù)，以及另一個前提是起始時間和/或終止時間不被選作參數(shù)。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述參數(shù)選自包含以下的組:所述模型函數(shù)的最大值；所述模型函數(shù)的第i矩，其中i=l，2，3，4，...；所述模型函數(shù)的第j中心矩，其中j=l，2，3，4，...；所述模型函數(shù)的標準差；所述模型函數(shù)的時間常數(shù)；所述時間常數(shù)的重心；所述時間常數(shù)與所述重心之間的平均偏差；所述時間常數(shù)的變異；所述時間常數(shù)的分布；所述時間常數(shù)的權重；所述時間常數(shù)之分布的權重；所述時間常數(shù)之變異的權重。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述模型函數(shù)是一階微分方程的解函數(shù)、二階微分方程的解函數(shù)、三階微分方程的解函數(shù)、多種階的微分方程之組合的解函數(shù)或作為時間之函數(shù)的多指數(shù)函數(shù)。
4.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，以流過的方式進行所述產(chǎn)物濃度的測定。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，測定所述呼出空氣流經(jīng)用于測定所述濃度之測量裝置的流率。
6.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，使用測量裝置以測定所述產(chǎn)物濃度，所述測量儀器的呼吸阻力小于100毫巴。
7.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，將所述個體的至少一次呼吸的全部呼出空氣用作呼出空氣。
8.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，在所述個體基本處于靜息位時測定所述產(chǎn)物濃度。
9.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，在所述個體處于臥位或坐位的位置時測定所述產(chǎn)物濃度，其中，與預定位置相比，所述個體的腿和/或身體上部的位置改變小于45度，特別地小于30度，尤其是小于15度。
10.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述產(chǎn)物濃度的測定基本進行到達到所述呼出空氣中所述最大產(chǎn)物濃度。
11.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，通過紅外吸收光譜、質(zhì)譜、計算機斷層顯像和/或核磁共振波譜測定所述產(chǎn)物濃度。
12.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述模型函數(shù)可由以下公式表不:
MetPow=cal* [F (產(chǎn)物，t) -f (產(chǎn)物，t)nat] *g (P) *h (n) *L (η/Μ) * (η/Μ2) *V (η/Μ),其中: MetPow是指代謝能力； cal是考慮了校正的常數(shù)； F(產(chǎn)物，t) 是表示呼出產(chǎn)物之動力學的函數(shù)； f(產(chǎn)物，t)nat 是表示所述個體在施用底物之前呼出空氣中產(chǎn)物天然豐度的函數(shù)； g(P)是表示所述個體的產(chǎn)物產(chǎn)生速率P對所述個體活動狀態(tài)之依賴性的函數(shù)； h(n)是表示每分子底物所產(chǎn)生的產(chǎn)物分子數(shù)的函數(shù)； L (η/Μ)是表示代謝能力依賴于所施用底物分子數(shù)η之非線性行為的函數(shù)，其中M代表所述個體的體重；以及 V(η/Μ)是表示因不同的底物施用過程而產(chǎn)生的依賴性的函數(shù)。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其特征在于，g(P)=P和/或h(n)=l和/或V(n/M)=l。
14.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，所述模型函數(shù)可由以下公式來表示:
MetPow=cal* [F (13CO2, 12CO2, t) -f (13CO2,12CO2, t) n J *g (Pc02) *h (n) *L (η/Μ) * (η/Μ2) *V (n/Μ), 其中: MetPow是指代謝能力； cal是考慮了校正的常數(shù)； F (13CO2,12CO2, t) 是表示作為產(chǎn)物之呼出13CO2的動力學的函數(shù)或表示呼出13co2/12co2比值之動力學的函數(shù)； f (13CO2,12CO2, t)nat是表示所述個體在施用底物之前呼出空氣中13CO2和12CO2的天然豐度的函數(shù)； g (Pc02)是表示所述個體的CO2產(chǎn)生速率Pro2對所述個體之活動狀態(tài)的依賴性的函數(shù)； h(n)是表示每分子底物所產(chǎn)生的CO2分子數(shù)的函數(shù)； L(η/Μ)是表示代謝能力依賴于所施用底物分子數(shù)η的非線性行為的函數(shù)，其中M代表所述個體的體重；以及 V(η/Μ)是表示因不同的底物施用過程而產(chǎn)生的依賴性的函數(shù)。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其特征在于，g(Pc02) =Pc02和/或h (n) =1和/或V (n/M)=l。
16.13C標記的美沙西汀、非那西汀、氨基吡啉、咖啡因、紅霉素和/或乙氧基香豆素，其用作在根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法中的底物。
17.13C-美沙西汀與增溶劑的水溶液，其用作在根據(jù)權利要求1至15中任一項所述的方法中的底物。
18.根據(jù)權利要求17所應用的13C-美沙西汀與增溶劑的水溶液，其特征在于，所述增溶劑的濃度為10至100mg/ml，所述13C-美沙西汀的濃度為按重量計0.2%至0.6%。
19.根據(jù)權利要求17所應用的13C-美沙西汀與增溶劑的水溶液，其特征在于，所述13C-美沙西汀的濃度按重量計大于3%。
【文檔編號】A61B5/083GK103547215SQ201280024565
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年4月13日 優(yōu)先權日:2011年4月13日
【發(fā)明者】卡斯滕·海涅, 梅爾廷·施托克曼, 湯姆·魯賓 申請人:休姆迪奇有限責任公司