用于生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通過使用脂質(zhì)粉末的水溶液的高剪切混合形成脂質(zhì)體的方法；脂質(zhì)粉末可以通過任意已知的技術(shù)來生產(chǎn)。脂質(zhì)體的組分包括但不限于陽離子脂質(zhì)、免疫刺激劑/免疫增強(qiáng)劑和作為用于形成脂質(zhì)體的組分的大分子。所公開的方法描述了一種通過高剪切混合配制單獨(dú)的穩(wěn)定脂質(zhì)體或復(fù)合了具有高濃度的帶與脂質(zhì)體相反的電荷的大分子比如蛋白質(zhì)、DNA和RNA的穩(wěn)定脂質(zhì)體的方法，其中歸因于配制方法，避免了聚集。
【專利說明】用于生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及脂質(zhì)體生產(chǎn)及制劑。尤其，本發(fā)明涉及陽離子脂質(zhì)體的生產(chǎn)和配制，這是通過可由不含有機(jī)溶劑的方法(超臨界流體技術(shù)(fx critical fluid technologies))得到的脂質(zhì)粉末和高剪切混合的獨(dú)特組合，藉此在過程期間沒有使用有機(jī)溶劑下，將脂質(zhì)體組分混合且配制成穩(wěn)定的脂質(zhì)體。在治療和預(yù)防醫(yī)學(xué)中，脂質(zhì)體可以用作抗原組分的佐劑或用作藥物遞送系統(tǒng)。尤其，本發(fā)明涉及用于免疫的在水介質(zhì)中的疫苗的佐劑。
[0002]發(fā)明背景
[0003]術(shù)語脂質(zhì)體是用于由封閉含水區(qū)室(aqueous compartment)的脂質(zhì)雙層組成的囊泡的廣泛定義。膜形成脂質(zhì)是兩親的且因此包含極性和非極性區(qū)域。極性區(qū)域通常由磷酸酯基團(tuán)、酸性基團(tuán)和/或叔胺或季銨鹽組成，且在生理PH下可以具有凈的負(fù)表面電荷(陰離子)、中性表面電荷或正表面電荷(陽離子)，這取決于脂質(zhì)頭基(head group)的組成。非極性區(qū)域通常由具有≤8個碳的一個或多個脂肪酸鏈和/或膽固醇(cholesterol)組成。構(gòu)成囊泡雙層膜的脂質(zhì)被排布(organized)，使得非極性的烴“尾部”指向雙層的中心，而極性的“頭部”分別朝向水相內(nèi)部和水相外部。
[0004]獲得均勻的脂質(zhì)體的一種方法涉及使磷脂溶解在有機(jī)溶劑中，其然后被蒸發(fā)至干燥，在試管內(nèi)部留下薄的脂質(zhì)膜(Bangham等，1965)。干的脂質(zhì)膜然后在適量的水相中水化，且混合物被加熱至高于脂質(zhì)/脂質(zhì)混合物的相轉(zhuǎn)變溫度Tm且脂質(zhì)膜被允許“膨脹”。通過振動試管來分散得到的通常由多層囊泡(Multilamellar Vesicles) (MLV)組成的脂質(zhì)體。這種制備為通過例如超聲處理(Papahadjopoulos等，1967)或如Cullis等在美國專利第5，008, 050號中描述的擠出的方法生產(chǎn)單層囊泡(UV)提供了基礎(chǔ)。
[0005]用于制備小囊泡的其它技術(shù)為由Szoka和Papahadjopoulos介紹的反相蒸發(fā)法(Szoka和Papahadjopoulos，1978 ;美國專利第4，235，871號)。這種技術(shù)包括在有機(jī)溶劑和待包封的(encapsulated)物質(zhì)的緩沖水溶液中形成脂質(zhì)的油包水乳液。在減壓下除去有機(jī)溶劑產(chǎn)生粘性凝膠。當(dāng)這種凝膠崩解(collapse)時(shí),形成脂質(zhì)囊泡的水懸浮液。
[0006]通過用于包封不具有對脂質(zhì)體的強(qiáng)的親和力的水溶性化合物例如蛋白質(zhì)的復(fù)乳法(double emulsion method)來制備憐脂的脂質(zhì)體被Schneider描述在US4, 008, 801和US4, 224，179中。具有包含化合物的脂質(zhì)體的乳液是通過復(fù)乳法制備的:使小體積的具有水溶性的化合物比如蛋白質(zhì)抗原和/或免疫刺激劑(immunostimulator)的水溶液與較大體積的具有溶解的磷脂的有機(jī)溶劑混合。所形成的乳液與較大體積的水溶液混合且用氣流除去有機(jī)溶劑。
[0007]Carmona-Ribeiro 和 Chaimovich (Ribeiro 和 Chaimovich, 1983)所描述的方法涉及向緩沖水溶液注入期望脂質(zhì)的例如氯仿、甲醇、乙醇的有機(jī)溶液，其中當(dāng)溶劑蒸發(fā)時(shí)脂質(zhì)自發(fā)地形成脂質(zhì)體。在近些年中已經(jīng)評估了用于脂質(zhì)體的大規(guī)模生產(chǎn)的乙醇注射方法(Wagner2006, Justo2010)，且這種制造方法被判斷為對于大規(guī)模生產(chǎn)比例如磷脂膜方法更可行。
[0008]已知幾種從有機(jī)溶劑溶液獲得均勻的脂質(zhì)粉末的方法，比如冷凍干燥、噴霧干燥、溶劑蒸發(fā)(Mehnert和Mader，2001 )。在這些方法中，其中溶解了脂質(zhì)的有機(jī)溶劑是通過所描述的技術(shù)來除去的。由于許多方法在藥物產(chǎn)品中留下了殘余的溶劑，因此有機(jī)溶劑的使用具有若干缺點(diǎn)。而且，在大規(guī)模生產(chǎn)上(on upscaling),對于人員和環(huán)境問題,需要非常注意。同時(shí)，已經(jīng)考察了用于制造脂質(zhì)粉末的熱或冷均化方法(Mehnert和Mader, 2001)。
[0009]在近些年中，可選擇地，已經(jīng)通過超臨界流體方法來生產(chǎn)脂質(zhì)粉末，方法被開發(fā)用于生產(chǎn)不溶于水的藥物的穩(wěn)定懸浮液(Badens等,2001, Cape等,2008)。超臨界流體方法利用處于其超臨界狀態(tài)的壓縮氣體例如CO2作為一些方法中的溶劑或作為其它方法中的反溶齊[I (ant1-solvent) (Pasquali等,2008)。這可以有助于通過經(jīng)由從其中化合物被液化或溶解/部分溶解的超臨界溶液中快速膨脹使不溶于水的化合物沉淀，或通過應(yīng)用經(jīng)由將化合物的溶液噴到壓縮氣體、液體或超臨界流體中的反溶劑方法，來制備亞微顆粒。對于生產(chǎn)磷脂囊泡，該方法是公知的(W09714407、US5, 554，382、W02010004287)。最經(jīng)常地，應(yīng)用有機(jī)溶劑或添加的共溶劑。
[0010]已經(jīng)考察了直接從超臨界CO2溶液中制造的用于包封(61103口811131:；[011)的脂質(zhì)體，其應(yīng)用乙醇作為由磷脂和膽固醇組成的脂質(zhì)體的共溶劑(Frederiksen等人，1997)。
[0011]已經(jīng)考察了制造脂質(zhì)體包載/包封的物質(zhì)比如大分子、DNA/RNA、酶、蛋白質(zhì)、肽和激素的技術(shù)。脂質(zhì)體包載技術(shù)的一個實(shí)例是脫水-再水化程序(Gregoriadisl987、1993、1999，Kirby等，1984，Zadi, 2000)0在這個方法中，脂質(zhì)體是通過例如上文所述的脂質(zhì)膜水化方法來進(jìn)行的，其中在脫水-再水化方法之前除去所應(yīng)用的有機(jī)溶劑。脂質(zhì)膜通過使用水/緩沖液來形成“空的”脂質(zhì)體，或可選擇地通過使用含有待包封的物質(zhì)的水溶液來水化。水化程序可以通過已知的技術(shù)來完成，比如通過加熱水溶液直至高于脂質(zhì)組分的相轉(zhuǎn)變溫度Tm且以一定間隔旋轉(zhuǎn)混合。隨后，冷凍干燥脂質(zhì)體制劑，且然后在高于脂質(zhì)的凝膠-液晶轉(zhuǎn)變溫度的控制條件下，首先用少量的水或含有物質(zhì)的溶液再次水化，之后稀釋至最終體積。產(chǎn)生的脫水-再水化囊泡(DRV)可以通過微流化至合適的尺寸來處理，且通過色譜、離心步驟等除去剩下的未 包載的物質(zhì)。然而，包載后的尺寸減少趨向于導(dǎo)致較低的包載載量(entrapment load)和效率。
[0012]然而，所有這些方法都包括了有機(jī)溶劑/共溶劑的使用。由于已知很多有機(jī)溶劑是致癌的和/或?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)具有損傷效應(yīng)，因此重要的是，減少在人用的藥物產(chǎn)品中的殘余的有機(jī)溶劑的含量，且證明(document)留在藥物產(chǎn)品中的痕量沒有超過可容忍的藥典水平。而且，有機(jī)溶劑在生產(chǎn)中的使用導(dǎo)致了大量的這些化合物被丟棄。因此，存在著在使用有機(jī)溶劑時(shí)應(yīng)遵守的許多規(guī)章和條例，這使得生產(chǎn)過程較為復(fù)雜化。使用現(xiàn)今所用的防護(hù)配件和設(shè)備，最小化人員的暴露且維持高標(biāo)準(zhǔn)的工作環(huán)境是可能的。因此，現(xiàn)今當(dāng)局更為關(guān)注的是對于外部環(huán)境的暴露。當(dāng)揮發(fā)性的組分比如有機(jī)溶劑通過抽吸從工作環(huán)境移除到外部環(huán)境時(shí)，那些這些溶劑可以引起空氣中的光化學(xué)污染物比如臭氧或煙霧的形成。因此，新的政府舉措包括限制來自工業(yè)的空氣污染物的指南。這個指南包括保持揮發(fā)性有機(jī)組分的非常精確的平衡，因此必須登記進(jìn)入和出去的每一種物品。這使得在現(xiàn)代工業(yè)中采用有機(jī)溶劑的工作是非常耗時(shí)且昂貴的。在本發(fā)明中，不含有機(jī)溶劑的生產(chǎn)方法的使用因此是高度有利的。
[0013]在最近幾十年中，已經(jīng)廣泛研究了脂質(zhì)體作為疫苗遞送系統(tǒng)和佐劑的應(yīng)用。陽離子脂質(zhì)體是用于疫苗抗原的最有效的脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)且是比其它脂質(zhì)體系統(tǒng)更有效力的免疫增強(qiáng)劑的脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)。然而，盡管一些證據(jù)表明陽離子脂質(zhì)體本身可以改進(jìn)針對共同施用的疫苗抗原的免疫應(yīng)答，但是它們的主要功能是保護(hù)抗原不在體內(nèi)清除且將抗原遞送至專門的抗原呈遞細(xì)胞(Christensen等,2007)。最近的研究表明，對于疫苗在注射部位處的保留，陽離子電荷是重要的因素，使得天然免疫細(xì)胞的延長的抗原呈遞和天然免疫細(xì)胞的延長的免疫刺激成為可能(Henriksen-Lacey等,2010)。此外，陽離子脂質(zhì)體可以用于引入免疫刺激劑，以以所需方向增強(qiáng)且調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答，且因此在設(shè)計(jì)用于特定疾病祀標(biāo)的特制(tailor-made)的佐劑時(shí),提供了有效的工具(Christensen等,2007)。構(gòu)成脂質(zhì)體的陽離子活性劑組分可以包括表面活性劑如二甲基雙十八烷基銨(DDA)、3-[N-(N’，N’ -二甲基氨基乙烷)_氨基甲酰基]膽固醇(DC-Chol)、l，2-酰基-3-三甲基銨-丙烷(DxTAP)、N-[1-(2，3-酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲銨(DxTMA)、酰氧基(乙基-2-酰基-3-羥乙基)咪唑啉鎗(DxTIM)、1, 2-?；?甘油基-3-乙基磷酸膽堿(DxEPC)、3-十四烷基氨基 _ 叔丁基 _N_ 十四烷基丙脈(3-tetradecylamino-tert-butyl-N-tetradecylpropion-amidine) ( 二 C14-脒)、N-棕櫚?；?D-鞘氨氧基(erythrospingosyl) -1-0-氨基甲?；?CCS)和二甲基二?；@(DDxA)，其中X代表具有不同的鏈長度的?；湵热?月桂酰(C12)、肉豆蘧酰(C14)、棕櫚?；?C16)、硬脂?；?C18)、二十烷酰基(C20)和山崳?；?C22)。
[0014]這些脂質(zhì)體的免疫原性(immunogenicity)可以通過包含所謂的模式識別受體(PRR)的免疫刺激配體(又稱免疫增強(qiáng)劑)來增強(qiáng)，所謂的模式識別受體(PRR)識別已知為病原體相關(guān)分子模式(PAMP)的保守分子結(jié)構(gòu)。PAMP調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答且因此調(diào)節(jié)隨后的適應(yīng)性應(yīng)答的能力可以被有利地開發(fā)，用于疫苗。PRR包括C型凝集素受體、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)蛋白質(zhì)和常生 Toll 樣受體(ever-growing toll-like receptor) (TLR)家族。PAMP在病原體之間變化且包括分子比如索狀因子(TDM)、鞭毛蛋白、脂多糖(LPS)、肽聚糖及幾種核酸變體，比如胞嘧啶:磷酸酯:鳥嘌呤(CpG)寡聚脫氧核苷酸和雙鏈核糖核酸(dsRNA)。多年來，已經(jīng)開發(fā)了受PAMPS啟發(fā)的許多免疫刺激劑。這些包括海藻糖二山箭酸酯(trehalose dibehenate) (TDB)、合成的單分枝酸基甘油(monomycolyl glycerol)(MMG)、單磷酰脂質(zhì)A(MPL)、聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(1:C))。對于開發(fā)疫苗佐劑，脂質(zhì)體和這些PAMP/免疫刺激劑的組合是一種有吸引力的方法，因?yàn)橹|(zhì)體不僅遞送疫苗抗原，而且遞送PAMP/免疫刺激劑至抗原提呈細(xì)胞，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
[0015]已經(jīng)提出了誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的多種佐劑，但是總體上沒有任何佐劑對所有的方面都是理想的。
[0016]一種對促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答特別有效的佐劑類型是季銨化合物類，例如二甲基雙十八烷基銨(DDA)。DDA是合成的兩親物，其包括親水的帶正電的二甲基銨頭基和兩個長的疏水烷基鏈。在水環(huán)境中，DDA分子自組裝以形成類似于由天然磷脂形成的脂質(zhì)體的泡狀雙層。從文獻(xiàn)中已知DDA與其它免疫增強(qiáng)劑的組合。
[0017]不幸地，兩親的季銨化合物例如單獨(dú)的DDA的懸浮液是物理學(xué)不穩(wěn)定的，并且在4°C下的延長的儲存而沒有聚集和沉淀的發(fā)生是不可能的。由于沉淀將會妨礙制劑的臨床使用，因此DDA制劑穩(wěn)定性的缺乏目前已經(jīng)是在人中進(jìn)行任何應(yīng)用的主要障礙。
[0018]已經(jīng)設(shè)想了用來穩(wěn)定兩親的季銨化合物的懸浮液的若干方式。這些方式包括使用例如聚乙二醇(PEG)、糖脂(比 如TDB)和聚合物來穩(wěn)定雙層。W02006002642公開了物理學(xué)穩(wěn)定的脂質(zhì)體制劑。該文件涉及通過將糖脂結(jié)合到脂質(zhì)雙層中來立體穩(wěn)定陽離子脂質(zhì)體以及脂質(zhì)膜的增加的水化。穩(wěn)定的脂質(zhì)體可以用作抗原組分的佐劑或用作藥物遞送系統(tǒng)。尤其，該文件涉及用于免疫的在水相中具有佐劑的疫苗，其中最終產(chǎn)品是穩(wěn)定的且不含有機(jī)溶劑。
[0019]此外，W02006002642公開了糖脂之外的其它免疫增強(qiáng)劑例如聚(1:C)和CpG向囊泡制劑的添加，然而未提出如何將這些進(jìn)一步的組合制成穩(wěn)定的制劑，因?yàn)檫@些免疫增強(qiáng)劑的結(jié)合使得制劑不穩(wěn)定。然而，免疫增強(qiáng)劑和/或抗原向穩(wěn)定制劑的進(jìn)一步添加可造成不穩(wěn)定。尤其，因?yàn)楦叨葞щ姷木酆想娊赓|(zhì)與帶相反電荷的脂質(zhì)體的結(jié)合促進(jìn)了脂質(zhì)雙層膜的自身不穩(wěn)定性的事實(shí)，聚陰離子如(聚(1:C))難以配制到陽離子脂質(zhì)體和脂質(zhì)體佐劑。電荷的中和與外部表面積的伴隨的減少在雙層正常方向中產(chǎn)生側(cè)向壓力的梯度。這產(chǎn)生彎矩(bending moment),其反過來導(dǎo)致脂質(zhì)體不穩(wěn)定，引起較大聚集物隨時(shí)間過去而形成、寬的尺寸分布及結(jié)構(gòu)不均勻性，導(dǎo)致脂質(zhì)體的沉淀。
[0020]存在用于使寡核苷酸、肽或蛋白質(zhì)結(jié)合/復(fù)合脂質(zhì)體中或與脂質(zhì)體結(jié)合/復(fù)合的在文獻(xiàn)中描述的幾種方法，其中在用有機(jī)溶劑結(jié)合/復(fù)合之前已經(jīng)制備了脂質(zhì)體。在一種方法中，存在于水相中的寡核苷酸、肽或蛋白質(zhì)通過冷凍干燥被部分地包載，之后重新水化凍干的脂質(zhì)體(Kirby 和 Gregoriadis, 1984)。
[0021]可選擇地,肽或蛋白質(zhì)通過使用由Pick(Pick, 1981)和由Bally等在美國專利第4，975，282號中描述的冷凍和融解技術(shù)來結(jié)合。在這種技術(shù)中，通過上述方法生產(chǎn)的預(yù)先形成的囊泡與肽或蛋白質(zhì)混合，并且在液氮中反復(fù)地迅速冷凍和加熱到相關(guān)脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變溫度Tm以上的溫度。由于這種方式應(yīng)用了預(yù)先形成的脂質(zhì)體，用于生產(chǎn)此類脂質(zhì)體的上述方法也應(yīng)用到這里，例如有機(jī)溶劑的使用和在規(guī)?；椒〞r(shí)的困難，比如快速冷凍較大的批料。
[0022]對于使用有機(jī)溶劑和復(fù)乳法使高濃度的親水陰離子化合物例如聚陰離子如聚(I:C)吸附到季銨化合物的陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)體的最近的實(shí)例被描述在(Nordly等，2011)中。
[0023]本發(fā)明公開了一種通過不含有機(jī)溶劑的方法從脂質(zhì)粉末，優(yōu)選地從不含有機(jī)溶劑的方法中得到的脂質(zhì)粉末中制造和配制陽離子脂質(zhì)體的方法。本發(fā)明還公開了用來配制具有添加的聚陰離子免疫增強(qiáng)劑的穩(wěn)定的陽離子脂質(zhì)體的方法。
[0024]發(fā)明概述
[0025]本發(fā)明公開了一種通過使用高剪切混合，通過脂質(zhì)粉末的再水化而沒有使用有機(jī)溶劑來形成脂質(zhì)體的新方法，所述脂質(zhì)粉末可優(yōu)選地在沒有有機(jī)溶劑或共溶劑的使用下獲得。本發(fā)明使用超臨界流體技術(shù)，以產(chǎn)生均勻的脂質(zhì)粉末，但脂質(zhì)粉末可通過其它已知的技術(shù)來生產(chǎn)。脂質(zhì)體的組分包括但不限于陽離子脂質(zhì)、免疫刺激劑/免疫增強(qiáng)劑和作為用于形成脂質(zhì)體的組分的大分子。
[0026]本發(fā)明公開了一種用于通過高剪切混合，配制單獨(dú)的穩(wěn)定脂質(zhì)體或復(fù)合了高濃度的帶與脂質(zhì)體相反電荷的大分子比如蛋白質(zhì)、DNA和RNA的穩(wěn)定脂質(zhì)體的方法，其中由于所公開的配制方法，聚集被避免了。
[0027]本發(fā)明還公開了這些復(fù)合有聚陰離子免疫刺激劑的穩(wěn)定脂質(zhì)體作為疫苗佐劑的用途。[0028]發(fā)明詳述
[0029]本發(fā)明公開了一種用脂質(zhì)粉末在水溶液中的高剪切混合來生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法。
[0030]水溶液可以是純水或包含緩沖液、鹽、糖、大分子、酸、堿、氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等的水溶液。溶液的pH可以在pHl-14，優(yōu)選地pH5-9，且最優(yōu)選地pH6-8之間。
[0031 ] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，脂質(zhì)粉末是通過超臨界流體方法來生產(chǎn)的。
[0032]優(yōu)選的脂質(zhì)粉末是均勻的混合物，其中一種脂質(zhì)組分是季銨化合物，例如其中季銨化合物為二甲基雙十八烷基銨(DDA)、或二甲基雙十八烯基銨(D0DA)、或1，2_ 二油酸基_3_ 二甲基銨丙烷(D0TAP)、1，2- 二肉蘧酸基-3- 二甲基銨丙烷、I, 2- 二掠櫚酸基-3-三甲基銨丙烷、I, 2- 二硬脂?；?3-三甲基銨丙烷和二油酰基-3- 二甲基銨丙烷(DODAP)、N-[l-(2, 3- 二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨(DOTMA)、十八烯酰氧基(乙基-2-十七烯基-3-羥基乙基)咪唑啉鎗(DOTIM)、I, 2- 二油烯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)和3-十四烷基氨基-叔丁基-N-十四烷基丙脒(二 C14-脒)。
[0033]本發(fā)明的脂質(zhì)體還可以包括中性脂質(zhì)比如磷脂；穩(wěn)定化糖脂，比如a，a '-海藻糖6，6' -二山崳酸酯(TDB)或單分枝酰基甘油(MMG)或其合成類似物；免疫增強(qiáng)劑，比如C型凝集素受體、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)蛋白質(zhì)及toll樣受體(TLR)家族，比如索狀因子(TDM)或合成類似物TDB，鞭毛蛋白，脂多糖，肽聚糖或核酸變體，比如胞嘧啶:磷酸酯:鳥嘌呤(CpG)寡聚脫氧核苷酸和雙鏈核糖核酸(dsRNA)如聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(1:C))。
[0034]在另外的實(shí)施方式中，應(yīng)用高剪切混合程序和控制的添加包含待與脂質(zhì)體復(fù)合的物質(zhì)的溶液，所生產(chǎn) 的脂質(zhì)體與大分子比如寡核苷酸、肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物和/或脂質(zhì)復(fù)合。高剪切混合可以基于其中轉(zhuǎn)子的旋轉(zhuǎn)速度為至少3.400rpm的轉(zhuǎn)子-定子原理。其它高剪切混合技術(shù)包括但不限于均化和擠出。
[0035]通過所述方法生產(chǎn)的脂質(zhì)體可以用于佐劑、遞送系統(tǒng)、藥物或藥妝品的制造。
[0036]在應(yīng)用氧化敏感的組分如磷脂、不飽和脂肪酸或在應(yīng)用對氧化、脫氨基等敏感的活性藥物成分的情況下，在本發(fā)明中的所有步驟易于在惰性氣氛下處理。
[0037]本發(fā)明還公開了被穩(wěn)定以用作疫苗佐劑的脂質(zhì)體產(chǎn)品，其中疫苗可以針對任意的疾病比如流感、鏈球菌、結(jié)核病、糖尿病、癌癥、瘧疾、衣原體等。
[0038]通過本發(fā)明的方法制造或穩(wěn)定的脂質(zhì)粉末或脂質(zhì)體可以在藥學(xué)上用于注射，用于遞送系統(tǒng)、局部應(yīng)用、皮膚內(nèi)應(yīng)用、鼻內(nèi)應(yīng)用、肺應(yīng)用或應(yīng)用在其它制劑中，比如但不限于化妝品。
[0039]定義
[0040]“脂質(zhì)粉末”被定義成組成脂質(zhì)粉末制劑的脂質(zhì)混合物的干燥的微粒材料。對于脂質(zhì)粉末進(jìn)一步用于脂質(zhì)體制造，脂質(zhì)粉末為制劑的脂質(zhì)的均勻混合物是期望的。
[0041]“脂質(zhì)體”被定義成由一個或多個脂質(zhì)雙層圍繞著水性核心(aqueous core)構(gòu)成的封閉的囊泡結(jié)構(gòu)。每個脂質(zhì)雙層由兩個脂質(zhì)單層體組成，每個單層體具有一個疏水的“尾部”區(qū)域和一個親水的極性“頭部”區(qū)域。在脂質(zhì)雙層中，脂質(zhì)單層體的疏水“尾部”朝向雙層內(nèi)部，而親水“頭部”朝向雙層外部。脂質(zhì)體可具有多種物理化學(xué)性質(zhì)，例如尺寸、脂質(zhì)組成、表面電荷、流動性及雙層膜的數(shù)量。根據(jù)脂質(zhì)雙層的數(shù)量，脂質(zhì)體可歸類為包括單個脂質(zhì)雙層的單層囊泡(UV)或小的單層囊泡(SUV)，或包括每一個通過水層與另一個分開的兩個或更多個同心的雙層的多層囊泡(MLV)。水溶性化合物被包載入脂質(zhì)體的水相/核，相反地，親脂性化合物被包載入脂質(zhì)雙層膜的核/中心。
[0042]術(shù)語“陽離子脂質(zhì)”意圖包括具有疏水且極性的頭基部分，在生理可接受的pH下具有凈正電荷，并且可以在水中形成雙層囊泡或者膠束(micelle)的任意的兩親脂質(zhì)，包括天然的及合成的脂質(zhì)和脂質(zhì)類似物。
[0043]用于本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)一種特別優(yōu)選的類型是具有通式NR1R2R3R4-X的季銨化合物，其中R1和R2各自獨(dú)立地是包含從I至3個碳原子的短鏈烷基，R3獨(dú)立地是氫或者甲基或者包含從12至20個碳原子，優(yōu)選從14至18個碳原子的烷基，且R4獨(dú)立地是包含從12至20個碳原子，優(yōu)選從14至18個碳原子的烴基。X是藥物上可接受的陰離子，其本身無毒性。這樣陰離子的實(shí)例為鹵素陰離子，例如氯離子、溴離子和碘離子。還可使用無機(jī)陰離子例如硫酸根和磷酸根，或者由簡單的有機(jī)酸如乙酸衍生的有機(jī)陰離子。R1和R2基團(tuán)可以是甲基、乙基、丙基和異丙基，而R3可以是氧、甲基或者十二烷基、十二烷基、十四烷基、十五烷基、十TK烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基(eicocyl), R4可以是十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基。然而其它C12-C2tl烴基也是可能的，因?yàn)楸M管R3和R4基團(tuán)優(yōu)選是飽和的，且無分支側(cè)鏈，但是它們在較少程度上可以帶有支鏈，例如甲基和乙基側(cè)鏈。R3和R4還可以具有較少的不飽和度，例如每一個包含I至3個雙鍵，但是優(yōu)選地，它們是飽和的烷基。
[0044]陽離子脂質(zhì)最優(yōu)選二甲基雙十八烷基溴化銨或氯化銨(DDA-B或DDA-C)，或者其硫酸鹽、磷酸鹽或者乙酸鹽(DDA-X);或者二甲基雙十八烯基溴化銨或氯化銨(D0DA-B或D0DA-C)，或者其硫酸鹽、磷酸鹽或者乙酸鹽化合物(DODA-X)。
[0045]其它優(yōu)選的 陽離子脂質(zhì)為1，2-二油?；?3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、1，2-二肉豆蘧酰基_3_ 二甲基銨丙烷、1，2- 二棕櫚酰基-3- 二甲基銨丙烷、1，2- 二硬脂酰基-3- 二甲基銨丙烷和二油?；?3-二甲基銨丙烷(DODAP)、N-[l-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨(DOTMA)、十八烯酰氧基(乙基-2-十七烯基-3-羥基乙基)咪唑啉鎗(DOTIM)、1，2-二油烯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)和3-十四烷基氨基-叔丁基-N-十四烷基丙脒(二 C14-脒)。
[0046]烷基鏈?zhǔn)侵缚梢允侵辨湹幕蛑ф湹闹咀鍩N鏈。鏈可以是飽和的，或其可以包含一個或多個雙鍵，例如為不飽和的。
[0047]?；湻Q為烷基-OC(O)基團(tuán)，其中烷基如之前所描述的。
[0048]脂肪酸鏈?zhǔn)侵钢ф湹幕驘o支鏈的、飽和的或不飽和的烷基或酰基的烴鏈。
[0049]術(shù)語藥學(xué)上可接受的是指不會干擾有效成分的效力或者生物活性且對主體或患者沒有毒性的物質(zhì)。
[0050]用于本發(fā)明的相轉(zhuǎn)變溫度或Tm是一種溫度，在此溫度下脂質(zhì)體雙層從較低溫度的凝膠相物理地變成高溫流體相，較低溫度的凝膠相以有序的脂肪酸鏈(有序的固體相)為特征，在高溫流體相中脂肪酸鏈具有高度的構(gòu)象無序(液體無序相)，如通過差示掃描量熱法(DSC)測量的。
[0051]通過將糖脂結(jié)合到脂質(zhì)體膜中來穩(wěn)定陽離子脂質(zhì)體。結(jié)合是指將分子的疏水區(qū)域和親水區(qū)域包埋在膜、膠束、脂質(zhì)體或雙層的相應(yīng)的疏水和親水的區(qū)域或部分中的程序。將糖脂結(jié)合到脂質(zhì)體中的程序可以是“薄膜方法”、“反相蒸發(fā)方法”和“有機(jī)溶液注射方法”，以及將來的目前未知的具有將糖脂結(jié)合到脂質(zhì)體膜中的相同效果的方法。所有目前已知的方法在發(fā)明章節(jié)的背景中提及。
[0052]糖脂被定義成包含通過糖苷鍵與疏水部分例如長鏈脂肪酸、?；视?、鞘氨醇(sphingoid)、神經(jīng)酰胺或異戊二烯磷酸酯結(jié)合的一個或多個單糖或甘油殘基的任何化合物。本發(fā)明的糖脂可以是合成來源的、植物來源的或微生物來源的，例如來自分枝桿菌。
[0053]用于本發(fā)明的一類糖脂是酰化(或烷基化)的糖苷，其包括與一個、兩個或甚至三個脂肪酸酯化的一個或兩個糖殘基。脂肪酸可以是直鏈的，包括飽和脂肪酸例如肉豆蘧酸C14:0、十五烷酸C:15、棕櫚酸C16:0、十七烷酸C17:0、硬脂酸(steric acid)C18:O、十九烷酸C: 19、二十烷酸C:20、二十一烷酸C21:0、二十二烷酸C:22，以及不飽和脂肪酸例如油酸C18: ln-9、亞油酸18:2n-6 ;或復(fù)雜的支鏈脂肪酸例如霉菌酸、甲氧基霉菌酸、酮基霉菌酸、環(huán)氧霉菌酸和棒狀桿菌分支菌酸(corynomycolic acids)。糖殘基可以是簡單的單糖例如葡萄糖和果糖，或含有兩個共價(jià)鍵接的單糖的二糖，例如由葡萄糖和果糖組成的蔗糖和其中兩個葡萄糖單元通過糖苷鍵連接的海藻糖。用于本發(fā)明的一類糖脂是從分枝桿菌分離的細(xì)胞壁糖脂，其包括與一個、兩個或三個正十六烷酸C16:0、油酸C18: ln-9、亞油酸18: 2n-6，或復(fù)雜的羥基支鏈脂肪酸即在60至90個碳原子的長度范圍內(nèi)的霉菌酸殘基酯化的二糖。用于本發(fā)明的其它細(xì)菌糖脂具有較短的脂肪酸鏈，例如從棒狀桿菌、諾卡氏菌中分離的棒狀桿菌分支菌酸(22-36個碳)或者諾卡氏分枝霉菌酸(nocardomycolic acid)(44-60個碳)。優(yōu)選的分枝桿菌糖脂是常稱作索狀因子的a，a ' _海藻糖6，6' -二霉菌酸酯(TDM)，它是分枝桿菌細(xì)胞壁的最重要的免疫調(diào)節(jié)組分之一。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，糖脂包括與兩個二十二烷脂肪酸(山崳酸)酯化的二糖a，a '-海藻糖，例如為TDM的純合成類似物的a，a '-海藻糖6，6' -二山崳酸酯(TDB)。另外優(yōu)選的分支桿菌糖脂是單分枝?；视?，或優(yōu)選地合成類似物3-羥基-2-十四烷基-十八烷酸2，3- 二羥基丙酯或具有較短或較長的 ?；羌艿拿芮邢嚓P(guān)的化合物。
[0054]用于本發(fā)明的其它類型的糖脂包括但不限于:基于甘油的糖脂:這些脂質(zhì)包括與甘油的羥基糖苷鍵連接(linked glycosidically)的單糖或寡糖部分,所述甘油可用一個或兩個脂肪酸?；?或者烷基化)。而且，這些糖脂可以是不帶電荷的且因此通常被稱為中性甘油糖脂，或者可以包含硫酸根或磷酸根。這種類型的優(yōu)選糖脂為單分枝?；视?MMG)(Andersen等2009a, Andersen等2009b )或其合成類似物，比如3-羥基-2-十四烷基-十八烷酸-2，3- 二羥基丙酯或具有較短或較長的酰基骨架的密切相關(guān)的化合物(Andersen等2009b, Nordly 等 2011)。
[0055]基于神經(jīng)酰胺的糖脂:根據(jù)碳水化物部分的結(jié)構(gòu)，鞘糖脂(glycosphingolipid)被分為含有未取代的糖基的中性鞘糖脂和含有帶有酸性的羧基、硫酸根或磷酸根的糖基的酸性鞘糖脂。
[0056]脂多糖(LPS):這些復(fù)雜的化合物是在革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)毒素的抗原(S-脂多糖)。脂質(zhì)部分(脂質(zhì)A)通過糖苷鍵與多糖形成復(fù)合物。脂質(zhì)A包括在氨基葡萄糖I的I位和氨基葡萄糖II的4位具有2個磷酸酯基團(tuán)的b-1，6-氨基葡萄糖-氨基葡萄糖(b-1, 6-glucosaminyl-glucosamine)主鏈。氨基葡萄糖II的3位與長鏈多糖形成酸不穩(wěn)定的(acid-labile)糖苷鍵。用羥基化的脂肪酸如羥基肉豆蘧酸酯(鍵合兩個酯且鍵合兩個酰胺)和常規(guī)的脂肪酸(月桂酸酯)來取代其它基團(tuán)(在埃希氏菌中)。本發(fā)明特別優(yōu)選的脂多糖是脂質(zhì)A的單磷?；苌?MPL)，其是無毒的且具有優(yōu)良的佐劑性能。[0057]留醇類的糖苷:此家族包括與一留醇分子的羥基鍵合的一碳水合物單元。確定甾醇部分包括多種留醇:膽固醇、菜油留醇、豆留醇、谷留醇、菜子留醇和二氫谷留醇。糖部分包括葡萄糖、木糖和甚至阿拉伯糖。
[0058]脂肪酸或脂肪醇的糖苷:許多簡單的糖脂發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、酵母和低等有機(jī)體(海綿)中。這些化合物包括與脂肪醇或羥基脂肪酸的一個羥基鍵合或者與脂肪酸的一個羧基鍵合(酯鍵)的糖基部分(一個或幾個單元)。這些化合物通常具有令人感興趣的物理或生物學(xué)性質(zhì)。它們中的一些由于它們的洗漆劑性能(detergent properties),被工業(yè)化生產(chǎn)(燒基糖苷)。[0059]而且，糖脂例如TDB和MMG本身具有免疫刺激特性且可以以協(xié)同的方式與季銨化合物起作用，以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。而且，大分子例如寡核苷酸、肽或蛋白質(zhì)抗原可以被包載在單層和多層脂質(zhì)體的水相內(nèi)。
[0060]免疫增強(qiáng)劑是指增強(qiáng)疫苗遞送系統(tǒng)和抗原的效果或與疫苗遞送系統(tǒng)和抗原協(xié)同地起作用以獲得免疫應(yīng)答的任意組分。這種增強(qiáng)作用可以通過模式識別受體非特異性地或特異性地完成，模式識別受體包括但不限于c型凝集素受體、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)蛋白質(zhì)和toll樣受體(TLR)。
[0061]物質(zhì)的復(fù)合包括但不限于非共價(jià)結(jié)合，例如大分子與相同或相反帶電的脂質(zhì)體的靜電相互作用、疏水引力。
[0062]大分子:大分子被定義成由連接到一起的許多較小的結(jié)構(gòu)單元組成的非常大的分子，比如蛋白質(zhì)；同時(shí)，復(fù)雜的和非常大的分子比如DNA和RNA被定義成大分子。術(shù)語被用于四種常規(guī)的生物聚合物(核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物及脂質(zhì))，以及具有大的分子量的非聚合分子。本發(fā)明的大分子的使用中包括但不限于寡核苷酸、肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物及脂質(zhì)。
[0063]本發(fā)明公開了在水化之前和在可能用于與其它大分子的隨后復(fù)合的水化后，脂質(zhì)體的脂質(zhì)組分比如陽離子型表面活性劑如DDA和糖脂如TDB的均勻混合。脂質(zhì)組分與其它大分子(例如，寡核苷酸)的混合也可以在水化前完成，且在進(jìn)行復(fù)合時(shí)具有高剪切混合。陽離子脂質(zhì)和尤其是帶負(fù)電荷的大分子(例如，寡核苷酸)之間的復(fù)合物通常是熱力學(xué)不穩(wěn)定的，導(dǎo)致較大的聚集物隨著的時(shí)間的過去而形成、寬的尺寸分布及結(jié)構(gòu)不均勻。高度帶電的聚合電解質(zhì)與帶相反電荷的脂質(zhì)體的結(jié)合增強(qiáng)了膜本身的不穩(wěn)定性。電荷的中和外部表面積的伴隨的減少產(chǎn)生在雙層正常方向中的側(cè)向壓力的梯度。這產(chǎn)生彎矩，其反過來引起脂質(zhì)體的不穩(wěn)定性。
[0064]生產(chǎn)脂質(zhì)粉末
[0065]為干燥的微粒材料的脂質(zhì)粉末必須是制劑的脂質(zhì)的均勻混合物。較不均勻的脂質(zhì)粉末將導(dǎo)致較不穩(wěn)定的且較不均勻的脂質(zhì)體制劑。存在獲得均勻粉末的幾種已知的方式，比如冷凍干燥、噴霧干燥、溶劑蒸發(fā)，所有均為其中從脂質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶液中除去有機(jī)溶劑的方法。由于許多方法在藥物產(chǎn)品中留下殘余溶劑，因此有機(jī)溶劑的使用具有若干缺點(diǎn)。而且關(guān)于擴(kuò)大規(guī)模時(shí)，重點(diǎn)在于人員及環(huán)境問題。
[0066]本發(fā)明公開了一種方法，其在從脂質(zhì)原料到配制的陽離子脂質(zhì)體或具有添加的聚陰離子免疫增強(qiáng)劑的配制的陽離子脂質(zhì)體的整個脂質(zhì)體制造過程期間避免了有機(jī)溶劑的使用。重點(diǎn)在于應(yīng)用可以在沒有使用有機(jī)溶劑的情況下獲得的均勻的脂質(zhì)粉末。均勻的粉末可以通過將進(jìn)入的初始材料溶解、液化或熔化成均勻的共混物來獲得，其在從超臨界流體或從得到的熔化物的冷卻中固化時(shí)，得到可以被研磨至粉末的脂質(zhì)粉末或固體脂質(zhì)粉末。一種這樣的方法超臨界流體，例如超臨界C02。脂質(zhì)在超臨界CO2中被液化/分散/溶解，這可保證脂質(zhì)的均勻混合。產(chǎn)生的干燥脂質(zhì)粉末可通過包含脂質(zhì)混合物的超臨界CO2的快速膨脹來獲得。以這種方式，獲得細(xì)微粒脂質(zhì)粉末。
[0067]在本發(fā)明中實(shí)現(xiàn)均勻粉末的其它類型包括但不限于化合物的簡單熔化。在熔化過程例如攪拌或?；陂g或之后，這可使用或不使用壓力，使用或不使用有效的冷卻且使用或不使用機(jī)械攪拌來進(jìn)行。
[0068]優(yōu)選地，脂質(zhì)粉末是通過使用超臨界流體技術(shù)來生產(chǎn)的，以產(chǎn)生均勻的脂質(zhì)粉末，但任意的脂質(zhì)粉末可以被用作脂質(zhì)體生產(chǎn)的基礎(chǔ)材料。
[0069]生產(chǎn)脂質(zhì)體
[0070]根據(jù)本發(fā)明， 在脂質(zhì)粉末水化步驟期間使用高剪切混合(圖1)，以簡單的方式從脂質(zhì)粉來配制脂質(zhì)體，而沒有使用有機(jī)溶劑。這種高剪切混合方法可以用于復(fù)合與脂質(zhì)體和帶相反電荷的大分子比如寡核苷酸、肽或蛋白質(zhì)，得到穩(wěn)定的脂質(zhì)體-大分子復(fù)合物。
[0071]高剪切混合的結(jié)果是至少以下兩種物質(zhì)的混合:不溶解在彼此中，難于溶解在彼此中，或彼此間沒有化學(xué)反應(yīng)。兩個不互溶的物質(zhì)的一個此類實(shí)例是將脂質(zhì)水化到緩沖水溶液以形成脂質(zhì)體。在高剪切混合期間，一種物質(zhì)被分布遍及另一種物質(zhì)。
[0072]高剪切混合的優(yōu)選方法是基于轉(zhuǎn)子-定子(rotor-stator)原理。在此，以高的圓周速度轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)子。旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生抽吸，這拉動介質(zhì)至轉(zhuǎn)子中且然后在來自定子的齒的幫助下將其推動至外部。這確保了脂質(zhì)體制劑和任意添加的免疫增強(qiáng)劑或其它物質(zhì)的完全混合。穩(wěn)定的脂質(zhì)體和脂質(zhì)體-大分子復(fù)合物是用從3400至40000rpm的旋轉(zhuǎn)速度來形成的；現(xiàn)今，旋轉(zhuǎn)速度被限制到約40000rpm，但是對于制備穩(wěn)定的脂質(zhì)體溶液，似乎沒有上限。在制造過程中，將溫度保持為低于沸點(diǎn)且高于5°C。
[0073]所用的其它類型的高剪切混合包括但不限于:均化，超聲及擠出。均化是通過脂質(zhì)體或脂質(zhì)體-大分子復(fù)合物的強(qiáng)烈共混來進(jìn)行的。超聲被用于混合多層(微米級)囊泡且縮減(downsize)多層(微米級)囊泡的尺寸,所述多層囊泡是通過加熱且攪拌成小的(納米級)單層囊泡中來制造的。擠出被用于混合如上所制造的多層囊泡且縮減如上所制造的多層囊泡的尺寸，其中限定尺寸且均勻的脂質(zhì)體是通過穿過聚碳酸酯膜的連續(xù)擠出來制備的。
[0074]在本發(fā)明呈現(xiàn)的方法被用于制造脂質(zhì)體制劑和包括結(jié)合或封裝大分子和免疫調(diào)節(jié)劑的脂質(zhì)體-單分子復(fù)合物。
[0075]使用本發(fā)明，可以形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體制劑且尤其是脂質(zhì)體-大分子復(fù)合物的穩(wěn)定制劑。在本方法中，可以使具有對脂質(zhì)體膜的化合物的靜電親和力的所有物質(zhì)實(shí)際上結(jié)合。靜電親和力是在多種帶相反電荷的原子形成離子鍵時(shí)產(chǎn)生的在兩種或更多種化合物之間的親和力。制造的脂質(zhì)體是具有高度正的]-電勢的陽離子。這導(dǎo)致物質(zhì)的高的吸附程度，所述物質(zhì)包括但不限于例如在生理PH下具有低于7.4的pi的大分子，因?yàn)樗鼈儙ж?fù)電荷且具有對帶正電荷的脂質(zhì)體的靜電親和力。
[0076]通過本發(fā)明所呈現(xiàn)的方法形成的脂質(zhì)體和脂質(zhì)體-大分子復(fù)合物隨著時(shí)間的過去是非常穩(wěn)定的。藥物制劑的穩(wěn)定性是指在產(chǎn)品的貯存期限過程中制劑維持在限定的范圍內(nèi)的能力。脂質(zhì)體分散體展示化學(xué)及物理的穩(wěn)定特征。
[0077]化學(xué)穩(wěn)定性涉及化學(xué)降解，而物理穩(wěn)定性涉及系統(tǒng)的膠體穩(wěn)定性。[0078]脂質(zhì)體分散體的物理穩(wěn)定性是通過囊泡間的相互作用來確定，其依賴吸引力和排斥力之間的平衡。膠體系統(tǒng)是通過排斥力即靜電排斥和立體排斥來穩(wěn)定，這是由于在主體(bulk)中和在相互作用區(qū)域中的水之間的化學(xué)電勢的差。
[0079]本發(fā)明還呈現(xiàn)這些脂質(zhì)體作為佐劑例如用于疫苗組合物中的應(yīng)用。尤其，本發(fā)明涉及用于免疫的具有在水介質(zhì)中的佐劑的疫苗，其中最終產(chǎn)品是穩(wěn)定的。
[0080]佐劑是可增強(qiáng)其它化合物的效力或效價(jià)，但本身具有很少的藥理作用或不具有藥理作用的劑。佐劑還可以作為穩(wěn)定劑或遞送系統(tǒng)起作用。佐劑是廣泛用于人的治療(humantherapies)中，比如廣譜的疫苗、聯(lián)合治療(其中使用多種藥物)、癌癥治療例如化學(xué)治療、激素治療、放射治療、免疫治療和革G向治療，王要為小分子和大克隆抗體。在化妝品工業(yè)中，佐劑主要用于皮膚癌、光老化及在傷口愈合的區(qū)域內(nèi)的藥妝品，但也可以用于其它應(yīng)用中。佐劑還被用于農(nóng)業(yè)中，例如用于動物保健和農(nóng)業(yè)噴霧劑兩者中，以增強(qiáng)殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、取食刺激劑等的性能。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0081]圖1通過高剪切混合制造的CAFOl脂質(zhì)體的Cryo-TEM圖。制劑包含小的單層囊泡，如SUV或如多囊泡UV’ S。
[0082]圖2超臨界流體方法之前DDA和TDB作為單一組分原料的DSC分析。使用來自TAinstruments的微量熱計(jì)來測量。
[0083]圖3超臨界流體方法(RESS)生產(chǎn)的DDA/TDB脂質(zhì)粉末(DDA:TDB比例為5: lw/w)的DSC分析。使用來自TA instruments的微量熱計(jì)來測量。對于沒有使用有機(jī)溶劑的方法，比較了超臨界流體方法期間的攪拌和沒有攪拌的影響。
[0084]圖4在標(biāo)準(zhǔn)的高壓釜中通過超臨界CO2方法制造的DDA/TDB脂質(zhì)粉末(DDA: TDB比例為5: lw/w)的DSC分析。脂質(zhì)粉末的峰明顯地區(qū)別于圖2所示的DDA和TDB原料的那些峰。使用來自TA instruments的微量熱計(jì)來測量。
[0085]圖5用高剪切混合再水化的DDA脂質(zhì)體和CAFOl (DDA/TDB)脂質(zhì)體的DSC溫度過程線(thermograph)。從30_55°C，以30°C /小時(shí)掃描，操作壓力為35psi。VP-DSC微熱量計(jì)(Microcal, Northhampton, MAX
[0086]圖6用高剪切混合再水化的CAFOl (DDA/TDB)脂質(zhì)體的尺寸分布。尺寸分布是用來自 Malvern Instruments Ltd.,英國的 Malvern Zetasizer-Nano 來測量的。
[0087]圖7A)通過以 16000rpm(- ? -)、12000rpm和 24000rpm(- ▲-)的高剪切混合制備的CAFOl (DDA/TDB)脂質(zhì)體的平均粒徑的時(shí)間進(jìn)展(Time development)。脂質(zhì)體被分散在調(diào)節(jié)至PH7.4的IOmM Tris緩沖液中。在6000rpm下制備的CAF01脂質(zhì)體聚集到一定的程度，使得在71天后通過PCS進(jìn)行進(jìn)一步測量是不可能的。B)來自血液淋巴細(xì)胞的IFN-Y的釋放，所述血液淋巴細(xì)胞從用通過超聲或高剪切方法制備的CAF01 (DDA/TDB)中的2 ii g的Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB免疫的C57BI/6j小鼠中分離。血液淋巴細(xì)胞是在第三次免疫的I周后分離的且用0.05,0.5和5 ii g/ml的Ag85B_ESAT_6體外再刺激。
[0088]圖8A)來自血液淋巴細(xì)胞的IFN-Y的釋放，血液淋巴細(xì)胞從用通過在6000、12000和24000rpm下的高剪切方法制備的CAF05(DDA/TDB/聚(1:C))中的5 y g的卵白蛋白來免疫的C57Bl/6j小鼠中分離。在第三次免疫后3周分離脾細(xì)胞(spleenocyte)，且用g/ml的卵白蛋白體外再刺激。B)用通過在6000、12000和24000rpm下的高剪切方法制備的CAF05 (DDA/TDB/聚(1:C))中的卵白蛋白三次免疫后的％SIINFEKL-陽性⑶8+T細(xì)胞(%SIINFEKL-positive CD8+T_cell)。在第三次免疫后3周分離脾細(xì)胞，且用5 y g/ml的SIINFEKL體外再刺激。
[0089]圖9A)來自血液淋巴細(xì)胞的IFN- y的釋放，所述血液淋巴細(xì)胞從用通過高剪切混合、DRV、凍融、復(fù)乳和超聲方法制備的CAF05 (DDA/TDB/聚(1:C))中的5 y g卵白蛋白來免疫的C57Bl/6j小鼠中分離。在第三次免疫后3周分離脾細(xì)胞，且用5 ii g/ml的卵白蛋白體外再刺激。B)用通過高剪切混合、DRV、凍融、復(fù)乳和超聲方法制備的CAF05 (DDA/TDB/聚(1:C))中的g卵白蛋白免疫三次后的％SIINFEKL-陽性⑶8+T細(xì)胞。
[0090]圖10用高剪切混合制造的H56-CAF01疫苗的尺寸分布。粒徑分布為148.7±0.6d.nm,用來自 Malvern Instruments Ltd.,英國的 Malvern Zetasizer-Nano 測量。
[0091]圖11CAF05 (DDA/TDB/聚(1:C))的DLS穩(wěn)定性。通過動態(tài)光散射來測量隨著時(shí)間的變化的平均粒徑(n=3 )。在2-8 V下儲藏時(shí)，CAF05制劑在160天內(nèi)是穩(wěn)定的，并且在規(guī)定(specification)內(nèi)。
[0092]圖12CAF05 (DDA/TDB/ 聚(1: C))的 HPLC 穩(wěn)定性。
[0093]隨著時(shí)間的過去，測量CAF05中的DDA和TDB含量。CAF05佐劑樣品的兩種極性脂質(zhì)DDA和TDB的含量是用反相HPLC和通過蒸發(fā)光散射檢測(ELSD)的檢測來量化的。CAF05佐劑中的DDA和TDB的含量在360天內(nèi)沒有改變，是穩(wěn)定的，并且在規(guī)定(specification)內(nèi)，表明當(dāng)根據(jù)所公開的發(fā)明來制造時(shí)，CAF05是穩(wěn)定的。
[0094]圖13增加聚IC含量的穩(wěn)定CAF05制劑的粒徑。
[0095]在時(shí)間0下，具有從5/1:0.1至5/1:1的不同DDA/TDB:聚(1:C)比率的CAF05(DDA/TDB/聚(1:C))的制劑的直徑都在157-220nm內(nèi)。觀察到，對于含有較高的聚(1.C)的制劑，粒徑隨著時(shí)間的增加較為顯著，盡管所有的制劑都是穩(wěn)定的。
[0096]圖14粒徑對濃度。
[0097]在時(shí)間0下，對于所有濃縮的整體產(chǎn)品，CAF05(DDA/TDB/聚(1:C))和CAF09(DDA/MMG/聚(1:C))的制劑的直徑都在165-225nm內(nèi)。
[0098]圖15CAF04 (DDA/MMG)的DLS穩(wěn)定性。在此，MMG是類似物3_羥基_2_十四烷基-十八烷酸_2，3- 二羥基丙酯。通過動態(tài)光散射來測量隨著時(shí)間變化的平均粒徑(n=3)。在2-8 °C下儲藏時(shí)，CAF04制劑在240天內(nèi)是穩(wěn)定的并且在規(guī)定內(nèi)。
[0099]圖16CAF04(DDA/MMG)的 HPLC 穩(wěn)定性
[0100]測量隨著時(shí)間變化的CAF04中的DDA含量。? DDA/MMG類似物10.000/4.000 ； DDA/MMG類似物10.000/2.000。CAF04佐劑樣品的極性脂質(zhì)DDA的含量是用反相HPLC和通過蒸發(fā)光散射檢測(ELSD)的檢測來量化的。CAF04佐劑中的DDA的含量在60天內(nèi)沒有改變，是穩(wěn)定的，并且在規(guī)定內(nèi)，表明當(dāng)根據(jù)所公開的發(fā)明來制造時(shí)，CAF04是穩(wěn)定的。
實(shí)施例
[0101]實(shí)施例1:用差不掃描儀(differential scanning calometry)(DSC)來檢測 DDA、TDB和脂質(zhì)粉末混合物的熔化溫度。
[0102]起始材料和在超臨界CO2流體方法后產(chǎn)生的粉末的DSC溫度過程線呈現(xiàn)在圖2和圖3中。溫度過程線是用來自TA instruments的微量熱計(jì)獲得的。用TA instruments的通用軟件版本3.9A (universal software v.3.9A)來進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。
[0103]在圖2中，DDA的相轉(zhuǎn)變顯示出具有89°C的頂點(diǎn)的窄峰。TDB的相轉(zhuǎn)變顯示出分別具有在77°C和93°C處的頂點(diǎn)的兩個峰。
[0104]圖3中所示的溫度過程線表明，在超臨界方法(RESS)期間攪拌沒有影響。用超臨界流體方法制備的粉末顯示出與通過其中使用有機(jī)溶劑/共溶劑的脂質(zhì)膜方法制備的粉末的本質(zhì)相似性(intrinsic similarity)。
[0105]用于獲得圖3中的圖形的超臨界流體方法的條件為75°C和140巴。
[0106]實(shí)施例2:使用超臨界二氧化碳方法，沒有使用乙醇來制備DDA/TDB脂質(zhì)粉末。
[0107]DDA/TDB脂質(zhì)粉末(DDA:TDB比率為5: lw/w)的DSC溫度過程線顯示在圖4中。脂質(zhì)組分被裝載到標(biāo)準(zhǔn)的高壓釜中，密封且加熱至操作條件，對于超臨界流體方法，用于獲得圖4中的圖形的操作條件為75°C和140巴。沒有添加共溶劑。攪拌液化的懸浮液，之后，在通風(fēng)之前，使樣品冷卻至室溫?？色@得的脂質(zhì)粉末塊可以容易地研磨成細(xì)粉末。
[0108]實(shí)施例3:通過高剪切混合生產(chǎn)穩(wěn)定的CAFOl (DDA/TDB)脂質(zhì)體
[0109]根據(jù)所需的最終脂質(zhì)含量，稱取脂質(zhì)體粉末。根據(jù)所稱取的脂質(zhì)含量和所需的最終含量，添加期望的緩沖液，例如1OmM Tris pH7.4。在與應(yīng)用低速下的高剪切混合的同時(shí)，將緩沖液和脂質(zhì)粉末加熱至高于相轉(zhuǎn)變溫度Tm的溫度?？梢詰?yīng)用較高的速度水平，然而，不期望的發(fā)泡風(fēng)險(xiǎn)隨速度的增加而增加。當(dāng)達(dá)到溫度Tm時(shí)，開始在高旋轉(zhuǎn)速度下的高剪切混合。在高旋轉(zhuǎn)速度下攪拌混合物，直到達(dá)到所需的尺寸分布。使脂質(zhì)體混合物冷卻至室溫，然后冷凍。
[0110]實(shí)施例4:通過高剪切混合生產(chǎn)穩(wěn)定的CAF05 (DDA/TDB/聚(1: C))脂質(zhì)體
[0111]CAF05由三種組分DDA、TDB和聚(1:C)組成。首先，將用高剪切混合水化的DDA/TDB (CAFOl)冷卻至60°C。在60°C下，將聚(1:C)溶液滴加到液面下，至脂質(zhì)體溶液中，同時(shí)保持高剪切混合。當(dāng)添加完成時(shí)，繼續(xù)高剪切混合，持續(xù)大約5分鐘。使CAF05溶液冷卻至室溫，然后冷凍。穩(wěn)定性數(shù)據(jù)顯示在圖11 (粒徑分布)和圖12 (DDA和TDB的HPLC)中。通過應(yīng)用本發(fā)明所公開的制造方法，制造高的脂質(zhì)和聚(1:C)含量的CAF05制劑是可能的。對于分別高至 8000ug/mL、1600ug/mL 和 1600ug/mL 的 DDA/TDB/ 聚(1:C)含量的 CAF05 制劑，實(shí)例顯示在圖14中。
[0112]實(shí)施例5:用高剪切混合生產(chǎn)的DDA和CAFOl (DDA/TDB)脂質(zhì)體的熔化溫度的測定。
[0113]脂質(zhì)體的DSC溫度過程線顯示在圖5中。DDA的相轉(zhuǎn)變顯示出具有46.7°C的頂點(diǎn)的窄峰。DDA/TDB的相轉(zhuǎn)變?yōu)榉謩e具有在41.6°C和46.1°C處的兩個頂點(diǎn)的從39至47.5°C的寬峰。
[0114]用VP_DSC微量熱計(jì)(Microcal, Northhampton, MA)來進(jìn)行量熱實(shí)驗(yàn)。使用從30至55°C的30°C/小時(shí)的掃描速率。操作壓力為35psi?？偟闹|(zhì)濃度為2750 y g/mL。用Microcal’ s 0rigin7軟件來進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。相轉(zhuǎn)變溫度被定義成在峰最大值處的溫度。
[0115]實(shí)施例6:脂質(zhì)體的尺寸分布
[0116]在來自英國的 Malvern Instruments Ltd 的 Malvern Zetasizer-Nano 系列上的動態(tài)光掃描來測量脂質(zhì)體的平均尺寸。數(shù)據(jù)是在25°C下獲得的且收集測量值三次。使用Malvern Zetasizer PCS版本6.20軟件來收集并計(jì)算數(shù)據(jù)。用高剪切混合再水化的CAFOl (DDA/TDB)脂質(zhì)體的尺寸分布顯示在圖6中。顯示在圖6中的CAFOl脂質(zhì)體的平均流體動力直徑(hydrodynamic diameter)為163.2±0.493nm。測量值的多分散指數(shù)為0.258±0.008。
[0117]實(shí)施例7 =CAFOl (DDA/TDB)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性
[0118]通過在6000、12000和24000rpm下的高剪切混合方法制備的CAFOl (DDA/TDB)的顆粒的穩(wěn)定性是通過經(jīng)由使用 Malvern ZetaSizer nanoZS (Malvern Instruments Ltd.,英國)的動態(tài)光散射測量來測量隨時(shí)間變化的粒徑來確定的。在第0天，CAFOl (DDA/TDB)的制劑被分散在具有pH7.4的IOmM Tris緩沖液中。沉淀后,在第I天、第6天、第15天、第21天、第29天、第71天、第92天和第132天進(jìn)行測量(圖7A)。隨時(shí)間變化的粒徑穩(wěn)定性的比較表明穩(wěn)定的脂質(zhì)體是通過在12000rpm和24000rpm下的高剪切混合來獲得的。相反，在6000rpm下導(dǎo)致粒徑增加，且在4°C下儲藏71天后觀察到可見的聚集物，且在92天后由于聚集，使進(jìn)一步的粒徑測量是不可能的。
[0119]實(shí)施例8:H56-CAF01TB 疫苗
[0120]疫苗候選物H56-CAF01包含與H56重組亞單元蛋白質(zhì)(ESAT6_Ag85B-Rv2660)復(fù)合的CAF01 (DDA/TDB)脂質(zhì)體。將用高剪切混合水化的DDA/TDB冷卻至室溫，同時(shí)維持高剪切混合。緩慢添加H56蛋白質(zhì)抗原的水溶液，同時(shí)維持高剪切混合，持續(xù)大約5分鐘。在圖10中顯示的是，應(yīng)用這種程序，可獲得疫苗，而沒有可檢測的觀察到的聚集物。呈現(xiàn)在圖10中的CAF01 (DDA/TDB)脂質(zhì)體的平均流體動力直徑為148.7±0.600nm。測量值的多分散指數(shù)為0.251 ±0.007。
[0121 ]實(shí)施例 9:CAF05 (DDA/TDB/ 聚(1:C))的穩(wěn)定性
[0122]具有不同的聚(1:C)含量的通過高剪切混合方法制備的CAF05 (DDA/TDB/聚(1:C))脂質(zhì)體的顆粒的穩(wěn)定性是通過經(jīng)由使用Malvern Zetasizer nano (MalvernInstruments Ltd.，英國)的動態(tài)光散射測量來測量隨時(shí)間變化的粒徑來確定的。在第0天，對于在PH7.4的Tris緩沖液中的不同比率的DDA/TDB:聚(1:C)，如實(shí)施例4中所述地制備CAF05 (DDA/TDB/聚(1:C))的制劑。在制備后的第0天、第7天和第14天進(jìn)行粒徑分布的測量(圖13)。隨時(shí)間變化的粒徑穩(wěn)定性的比較表明是通過根據(jù)所公開的發(fā)明的高剪切混合獲得了穩(wěn)定的CAF05脂質(zhì)體。
[0123]實(shí)施例10:通過高剪切混合和用旋轉(zhuǎn)混合水化脂質(zhì)制備的脂質(zhì)體的免疫原性的比較。
[0124]在尾部的基部(the base of the tail),皮下地(s.c.)免疫小鼠，同時(shí)每一次免疫之間間隔2周。疫苗(0.2ml/小鼠)包含在300 u g CAF01 (DDA/TDB)中乳化的2 y g的熔合蛋白Ag85B-ESAT-6。在末次免疫后三周，純化血液淋巴細(xì)胞且在用0.05,0.5和5 y g的Ag85B-ESAT-6體外再刺激后測量IFN- y釋放水平。與用旋轉(zhuǎn)混合方法產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相比，在12000rpm下的高剪切混合得到較高的(盡管不是顯著較高的)IFN-Y應(yīng)答(圖7B)。而且，如在用低的抗原濃度再刺激后用未改變的回憶應(yīng)答(recall response)所觀察到的，維持抗原親合力(antigen avidity)(圖7B)。
[0125]實(shí)施例11:通過在6000、12000和24000rpm下高剪切混合制備的CAF01脂質(zhì)體的免疫原性的比較。
[0126] 在尾部的基部，皮下地(s.c.)免疫小鼠，同時(shí)每一次免疫之間間隔2周。疫苗(0.2ml/小鼠)包含在通過在6000、12000和24000rpm下高剪切混合制備的300 u g CAFOl中乳化的g的卵白蛋白。末次免疫后三周,從單個小鼠中純化脾細(xì)胞,且在用g的卵白蛋白體外再刺激后測量IFN-Y釋放水平(圖8A)。在不同的制劑之間未觀察到顯著的變化，盡管24000rpm的方法得到稍微較低的應(yīng)答。
[0127]此外，通過FACS考察⑶8+細(xì)胞的量:在I U g/ml抗-⑶28和抗-⑶49d的存在下，用5 u g/ml OVA或5 ii g/ml的OVA的⑶8肽抗原表位來刺激分離的脾細(xì)胞，持續(xù)I小時(shí)。在添加IOii g/ml布雷菲德菌素A和0.7 ii 1/ml莫能菌素/Golg1-stop后,細(xì)胞隨后在37°C下孵育5-6小時(shí)。在4°C下儲存過夜后，在FACS緩沖液中洗滌細(xì)胞，且隨后使用在FACS緩沖液中的抗-CD8-PerCP-Cy5.5的1:200稀釋液，在4°C下用mAb來進(jìn)行表面標(biāo)志物(surfacemarker)染色,持續(xù)30分鐘。
[0128]立即通過流式細(xì)胞術(shù)，使用FACScan流式細(xì)胞儀(BD)來檢驗(yàn)染色的細(xì)胞。在三種制劑之間，沒有獲得以％計(jì)的CD+細(xì)胞的顯著差異(圖SB)。
[0129]實(shí)施例12:通過高剪切混合、DRV、凍融、復(fù)乳和超聲方法制備的CAFOl脂質(zhì)體的免疫原性的比較。
[0130]在尾部的基部，皮下地(s.c.)免疫小鼠，同時(shí)每一次免疫之間間隔2周。疫苗(0.2ml/小鼠)包含在通過高剪切混合、DRV、凍融、復(fù)乳和超聲方法制備的300 ii g CAFOl(DDA/TDB)佐劑中乳化的5 ii g的卵白蛋白。末次免疫后三周，從單個小鼠中純化脾細(xì)胞，且在用5 ii g的卵白蛋白體外再刺激后測量IFN-Y釋放水平(圖9A)。在不同的制劑之間未觀察到顯著的變化，盡管高剪切混合和凍融方法得到比其它方法高的應(yīng)答。
[0131]此外，通過FACS考察⑶8+細(xì)胞的量:在I u g/ml抗-⑶28和抗-⑶49d的存在下，用5 u g/ml OVA或5 ii g/ml的OVA的⑶8肽抗原表位來刺激分離的脾細(xì)胞，持續(xù)I小時(shí)。在添加IOii g/ml布雷菲德菌素A和0.7 ii 1/ml莫能菌素/Golg1-stop后,細(xì)胞隨后在37°C下孵育5-6小時(shí)。在4°C下儲存過夜后，在FACS緩沖液中洗滌細(xì)胞，且隨后使用在FACS緩沖液中的抗-⑶8-PerCP-Cy5.5的1:200稀釋液，在4°C下用mAb來進(jìn)行表面標(biāo)志物染色，持續(xù)30分鐘。立即通過流式細(xì)胞術(shù)，使用FACScan流式細(xì)胞儀(BD)來檢驗(yàn)染色的細(xì)胞。與上述結(jié)果一致，與通過DRV方法但不是復(fù)乳和超聲方法獲得的那些應(yīng)答相比，基于高剪切混合和凍融的制劑誘導(dǎo)顯著較高的CD8應(yīng)答(圖9B)。
[0132]實(shí)施例13:通過高剪切混合生產(chǎn)穩(wěn)定的CAF09 (DDA/MMG/聚(1: C))脂質(zhì)體
[0133]CAF09由三種組分DDA、合成的MMG類似物(3_羥基_2_十四烷基-十八烷酸-2，3-二羥基丙酯)和聚(1:C)組成。首先，將用高剪切混合水化的DDA/MMG (CAF04)冷卻至60°C。在60°C下，將聚(1:C)溶液滴加到液面下，至脂質(zhì)體溶液中，同時(shí)保持高剪切混合。當(dāng)完成添加時(shí)，繼續(xù)高剪切混合，持續(xù)大約5分鐘。使CAF09溶液冷卻至室溫，然后冷凍。用于根據(jù)所公開的發(fā)明制造的CAF09 (165-225nm)的粒徑分布的數(shù)據(jù)顯示在圖14中。
[0134]實(shí)施例14:通過高剪切混合生產(chǎn)的具有不同脂質(zhì)體佐劑的各種疫苗制劑
[0135]已經(jīng)制備了具有來自多種疾病靶標(biāo)如結(jié)核病、HIV、A型流感和衣原體的抗原的用高剪切混合生產(chǎn)的CAF01、CAF04、CAF05和CAF09脂質(zhì)體的穩(wěn)定制劑(表1)。
[0136]
【權(quán)利要求】
1.一種使用脂質(zhì)粉末的高剪切混合來生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，其中一種脂質(zhì)組分是具有通式NR1R2R3R4-X的季銨化合物，其中R1和R2各自獨(dú)立地為含有從I至3個碳原子的短鏈烷基，R3獨(dú)立地為氫或甲基或含有從12至20個碳原子，優(yōu)選地14至18個碳原子的烷基，且R4獨(dú)立地為含有從12至20個碳原子，優(yōu)選地從14至18個碳原子的烴基，且X為本身無毒的、藥學(xué)上可接受的陰離子，所述脂質(zhì)組分在水溶液中水化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，還包括中性脂質(zhì)、糖脂和/或免疫增強(qiáng)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，其中所述高剪切混合基于轉(zhuǎn)子-定子原理、均化、超聲或擠出。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，其中所述轉(zhuǎn)子的旋轉(zhuǎn)速度為至少3.400rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，其中所述脂質(zhì)粉末是通過超臨界流體方法生產(chǎn)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，其中所述季銨化合物為二甲基雙十八烷基銨(DDA)、或二甲基雙十八烯基銨(DODA)、或1，2-二油?；?3-三甲基銨丙烷(DOTAP)U, 2- 二肉豆蘧酰基-3-三甲基銨丙烷、1，2- 二棕櫚酰基_3_三甲基銨丙烷、I, 2- 二硬脂酰基-3-三甲基銨丙烷和二油酰基-3- 二甲基銨丙烷(DODAP)、N-[1-(2，3- 二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基銨(DOTMA)、十八烯酰氧基(乙基_2_十七烯基-3-羥基乙基)咪唑啉鎗(D0HM)、1，2- 二油烯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽堿(DOEPC)和3-十四烷基氨基_叔丁基_N_十四烷基丙脒(二 C14-脒)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，其中所述脂質(zhì)體額外地包含中性脂質(zhì)，比如磷脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求6-7所述的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，其中通過結(jié)合糖脂來穩(wěn)定所述脂質(zhì)體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，其中所述糖脂為a，a'-海藻糖6，6' -二山崳酸酯(TDB)，或單分枝酰基甘油(MMG)或其合成類似物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，其中合成的MMG類似物為3-羥基_2_十四烷基_十八燒酸-2，3- 二羥基丙酯。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10所述的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，其中所述脂質(zhì)體額外地包含免疫增強(qiáng)劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，其中所述免疫增強(qiáng)劑選自C型凝集素受體，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)蛋白質(zhì)及toll樣受體(TLR)家族，比如索狀因子(TDM)或合成類似物TDB，單分枝?；视?MMG)或其合成類似物，鞭毛蛋白，脂多糖，肽聚糖或核酸變體，比如胞嘧啶:磷酸酯:鳥嘌呤(CpG)寡聚脫氧核苷酸和雙鏈核糖核酸(dsRNA)如聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚(1:C))。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12所述的生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，其中所述脂質(zhì)體與大分子比如寡核苷酸、肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物和/或脂質(zhì)復(fù)合。
14.一種根據(jù)任一前述權(quán)利要求生產(chǎn)的脂質(zhì)體產(chǎn)品。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的脂質(zhì)體產(chǎn)品，其中所述脂質(zhì)體包含DDA和TDB。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的脂質(zhì)體產(chǎn)品，其中所述脂質(zhì)體包含DDA和合成的MMG類似物。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16所述的脂質(zhì)體產(chǎn)品，其中所述脂質(zhì)體還包含聚(1:C)。
18.根據(jù)權(quán)利要求14-17所述的脂質(zhì)體產(chǎn)品，其包含抗原。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的脂質(zhì)體產(chǎn)品，其中所述抗原為ESAT6-Ag85B或ESAT6-Ag85B-Rv2660。
20.根據(jù)權(quán)利要求14-19的脂質(zhì)體產(chǎn)品用于制造佐劑、疫苗、遞送系統(tǒng)、藥物或藥妝品的用途。
【文檔編號】A61K47/48GK103619325SQ201280031438
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月4日
【發(fā)明者】拉斯·韋伯·安德烈亞森, 格里斯·柯羅耶·伍德, 丹尼斯·克里斯滕森 申請人:國立血清研究所