止血組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及粉末形式的止血組合物，其包含原纖維型的膠原，所述膠原包含按相對于膠原的總重量的重量計至少70%的纖維膠原和/或原纖維膠原的含量，和至少一種單糖，以及任選地至少一種選自凝血因子和糖胺聚糖的化合物。本發(fā)明還涉及用于制備這類組合物的方法，和涉及包含這類組合物和噴霧設備的單元。
【專利說明】止血組合物
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及止血組合物的領域，涉及具體化合物或組合物作為止血劑的用途，涉及用于制備止血組合物的方法，和涉及止血的方法。
技術背景
[0002]傷口，無論是在外部還是內部，創(chuàng)傷還是外科手術所致的，都經常導致流血。這類流血可大致是顯著的。流血是通過一組稱作“止血”的生理現(xiàn)象而被預防和停止。止血幫助修復血管破損和在一般情況下，確保維持脈管和組織完整性。[0003]當血管受傷時，會觸發(fā)一個包含多個階段的天然機制以阻止血流。首先，血管收縮(vasoconstriction),其使得流血減速,持續(xù)15到60秒并誘導復雜級聯(lián)的反應。在血小板血栓(platelet plug)周圍形成由纖維蛋白(fibrin)構成的纖維網狀物(fibrousmesh):最終的血栓形成并受保護以防被第十三因子(factor XIII)中途溶解，這穩(wěn)定化了纖維蛋白。最后，纖維蛋白網狀物收緊(縮進(retraction))，且傷口的邊緣匯聚:傷口收縮。在穩(wěn)定、交聯(lián)的纖維蛋白內，成纖維細胞可以隨即生長并組織成為血栓中的連接的基質(conjunctive matrix),并最終封閉傷口。
[0004]在循環(huán)的血液中不存在固體纖維蛋白；如果存在，其會立即堵塞至關重要的血管。然而，纖維蛋白的前體，纖維蛋白原(fibrinogen)是存在的。在凝血酶(thrombin)的作用下，纖維蛋白原被轉化為可溶性的纖維蛋白，其中所述凝血酶的合成由凝血因子活化。
[0005]最后,在傷口成功愈合后的幾天或幾周，纖維蛋白簇(fibrin cluster)在血纖蛋白溶解期間被破壞。
[0006]盡管存在該生物化學現(xiàn)象，但是，經常，特別是在傷口太大或是彌漫性出血(diffuse bleeding)的情況下,有必要“人工”進行止血。
[0007]存在幫助獲得止血的“機械性”解決方案，如按壓、繃帶(ligature)、和電凝法(electrocoagulation),其用于一線治療。然而，在某些情況下這些解決方案效果很小或沒有效果，如滲出性毛細血管出血(oozing capillary hemorrhages);多血管器官(hypervascularized organ)如脾或肝的出血；導致彌漫性流血的出血,如骨，和/或在神經外科(neurosurgery)中。
[0008]還存在“化學的”解決方案，特別是在某些現(xiàn)有止血產品中實現(xiàn)的。所述化學解決方案的組分通常是“吸收性”或“活性”類型的。
[0009]吸收性止血產品，特別地包括多糖如再生氧化纖維素(regenerated oxidizedcellulose)或藻酸鹽(alginates),主要通過機械作用和簡單吸收而實現(xiàn)功能。它們經常呈現(xiàn)過度泡脹的問題。如果所述泡脹導致液體，特別是血液，的迅速吸收，則當用于“封閉的”環(huán)境時其會導致不合意的壓力，所述封閉的環(huán)境例如與硬膜(dura mater)接觸或在泌尿外科(urology)中。
[0010]此外，某些產品，特別是包含植物多糖如纖維素或藻酸鹽的那些產品，還可能在它們的再吸收(resorption)期間造成炎性反應和/或可以導致宿主不能識別的降解產物。其結果是，將這類產物去除以使得它們不留存在體內且因此不產生這些不良效果是合意的。[0011 ] 活性止血產品，如含有凝血酶或纖維蛋白的產品，經常是衍生自血液的產品。這類產品牽涉變應反應和疾病傳播的風險，特別是在疾病載體不會被傳統(tǒng)施用的處理所滅活的情況中。此外，所述下游處理一般是復雜和/或昂貴的。最后，它們在使用前一般需要準備，在緊急情況下其可以是限制性的，并且的確很麻煩。
[0012]此外，既含有纖維蛋白也含有凝血酶的產品的作用模式基于在產品中所包含的兩種衍生自血液的產物之間的相互作用。偶爾反應可以不與血液相互作用而發(fā)生，在這種情況中所述產物被稱作漂浮的(float)。換句話說，所述產物被血液推開且血液繼續(xù)流動，可能造成產物稀釋或在血液的頂端凝結并形成膠體，在這種情況下血液的流動不受阻斷。因此止血沒有達成。
[0013]現(xiàn)在在市場上可以獲得的產品可以是以下面的形式:
[0014]-海綿(sponge)或基質:該物理形式有助于操作，但是在復雜的區(qū)域中使用或在腹腔鏡手術(laparoscopic application)中使用可能是有問題的，
[0015]-纖維:該形式可以容易地置于待治療的區(qū)域，如果該區(qū)域是可到達的話，且可以減少待植入的產品的量；另一方面，其對于血管是強烈禁忌的(stronglycontraindictated),尤其是要避免纖維進入循環(huán)中，因為這類情形會帶來栓塞(embolism)的風險，以及粘附在器材上的風險，
[0016]-固化的液體，如生物粘合劑:這類組合物經常包含至少兩種產品，其準備期間混合在一起以進行反應和聚合。一般所述產品必需在使用前，特別是在手術室中制備，這使得它們的制備冗長且需要能夠預期到它們的使用。
[0017]-噴霧劑:粘合劑可以以噴霧劑的形式，其需要使用特別的設備以供將注射器連接至提供氣體的設備，所述氣體對于推動產品是必需的。劑量、分配的同質性和/或所堆積的層的厚度是很難調控或不可能調控的。
[0018]-粉末:一些由淀粉制成的粉末是市場上可獲得的。粉末對血液的吸收使得實現(xiàn)止血粉末。淀粉對血液沒有任何生物特性。該粉末的密度和粒度(大小等級)非常小，且粉末在沒有形成云霧(cloud)的情況下不能噴霧，這不適于腹腔鏡手術。例如，在W02005/072700中描述的粉末不適于在傷口上均質和精確的噴霧，尤其是在腹腔鏡中。
[0019]現(xiàn)有技術的組合物一般都是以海綿、纖維、或粘稠液體的形式提供的，如纖維蛋白粘合劑，其可以噴霧。然而，現(xiàn)在無法獲得適于噴霧的粉末。
[0020]因此本發(fā)明的目的是獲得解決以上所提到的所有或一些問題的組合物，且特別是在安全性、有效性、易用性和/或成本方面令人滿意的組合物。具體地，所述產品或組合物可以滿足每個國家施行的管制性批準(regulatory approval)。
[0021]更加精確地，本發(fā)明目的在于獲得組合物，其具有令人滿意的吸收能力、良好的止血能力、最小的不良效果(或沒有不良效果)、良好的錨定(anchor)在傷口邊緣的能力和用于噴霧的可能性、當噴霧時令人滿意的對血流的穿透、和/或有限的泡脹。
[0022]具體地，所述組合物目的在于能夠在多數外科手術步驟中施用，如剖腹手術(laparotomy)、腹腔鏡、體腔鏡(coelioscopy)和自動外科手術技術(robotic surgicaltechnique)、和/或可以噴霧。所述組合物及其代謝物優(yōu)選具有令人滿意的無害性，具有改進的安全性，造成較弱的免疫應答或沒有免疫應答，不具致癌性，和/或可再吸收。具體地，再吸收是與止血和愈合的現(xiàn)象相容的，以便能在所述過程之后留在原位。
[0023]組合物的目標還可以是以可以噴霧的形式提供。
[0024]除了解決以上提到的所有或一些問題之外，本發(fā)明的目的還可以是獲得下述組合物:
[0025]-使得可獲得產品，特別是包含對止血作用有用的所有組分的干燥、可噴霧的粉末，特別是在儲藏期間，換句話說，以隨時可用的形式儲藏且在使用前不需要混合的產品，和/或
[0026]-其主要組分或其組分不會吸收過多的血液以至存在不合意的壓力的風險，和/或
[0027]-其組分同時具有止血、機械和生物化學、或生物活性，和/或
[0028]-其可以無需準備、無需處理止血產品而立即使用，且其可以例如在腹腔鏡以及在剖腹手術中使用。
[0029]發(fā)明概述
[0030]根據第一個方面,本發(fā)明涉及止血組合物,其包含或構成為(constituted of):
[0031]-膠原，其包含重量按相對于膠原總重量的重量計至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，其是原纖維類型的膠原，
[0032]-至少一種單糖，和
[0033]-任選地，至少一種選自下組的化合物
[0034]〇凝血因子(coagulation factors),特別是凝血酶,其可以特別地來自血液或通過生物技術方法獲得，和
[0035]〇糖胺聚糖(glycosaminoglycans),特別是硫酸軟骨素(chondroitinsulfate)、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、透明質酸(hyaluronic acid)及其混合物。
[0036]優(yōu)選地，提出了粉末形式的止血組合物，其包含原纖維類型的膠原，所述原纖維類型的膠原包含按相對于膠原總重量的重量計的至少70%的纖維膠原和/或原纖維膠原的含量，以及至少一種單糖。
[0037]本發(fā)明可以具體使得可獲得組合物，其具有特別好的止血特性，同時產生有限的泡脹，所述止血特性具體是由于所述組合物的大小和/或顆粒的密度的特征以及是由于其組分。
[0038]根據一種變化，所述組合物不含從血液中直接或間接獲得的組分。例如當存在凝血酶時，其可以是從血液中提取的或是重組凝血酶。非常具體地，組合物構成為(isconstituted of)在體內迅速降解的和/或生物相容的化合物,換句話說,其不誘導不合意的應答。
[0039]組合物的優(yōu)選但不受限制的， 單獨或組合的方面為下述:
[0040]-組合物包含按相對于組合物的總重量的重量計80%至90%范圍的膠原含量。
[0041]-組合物包含按相對于組合物的總重量的重量計1%至12.5%范圍的單糖含量。
[0042]-組合物包含重量比值范圍為10至50,優(yōu)選19的膠原/單糖。
[0043]-膠原包含按相對于膠原總重量的重量計的從85%至95%范圍的纖維膠原和/或原纖維膠原含量。
[0044]-組合物還包含按相對于組合物的總重量的重量計從2%至25%范圍的糖胺聚糖含量。
[0045]-組合物還包含重量比值范圍為從2至40的膠原/總糖化合物，其中總糖化合物的重量是單糖的重量和糖胺聚糖重量之和。
[0046]-組合物還包含凝血因子，特別是凝血酶，其量的范圍為從組合物的0.01IU/mg至20IU/mg。
[0047]-組合物具有大于0.4g/mL的致密密度(tapped density)。
[0048]-組合物包含按重量計至少50%的大小在200μ m和400 μ m之間的顆粒。 [0049]-權利要求1至10任一項的組合物，其包含
[0050]〇膠原,其量按相對于組合物的總重量的重量計為86.36%,
[0051]〇葡萄糖，其量按相對于組合物的總重量的重量計為4.54%,
[0052]〇硫酸軟骨素，其量按相對于組合物的總重量的重量計為9.09%ο
[0053]-組合物還包含凝血酶,其量為組合物的0.2IU/mg至2IU/mg。
[0054]根據進一步的方面，本發(fā)明涉及用于制備止血組合物的方法，其至少包括下述步驟:
[0055]a)形成包含原纖維類型的膠原的水性懸液，所述原纖維類型的膠原具有重量按相對于膠原總重量的重量計至少70%的纖維膠原和/或原纖維膠原含量，以及至少一種單糖，其中在該步驟中使用的膠原優(yōu)選通過堿性提取獲得；
[0056]b)以沉淀、糊或凝膠的形式回收產物，特別是通過離心或傾析，
[0057]b)干燥產物，
[0058]c)將產物研磨至合意的粒度。
[0059]這種方法可以包括步驟d)之后的步驟e)，其包括添加選自下組的化合物:
[0060]-凝血因子，特別是凝血酶，和
[0061]-糖胺聚糖，特別是硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質酸及其混合物。
[0062]本發(fā)明還涉及試劑盒，其包含以上描述的組合物和適于容納和推進這類組合物的噴霧設備。
[0063]附圖簡述
[0064]其它本發(fā)明的特征和優(yōu)勢將從以下描述而變得清楚，所述描述僅作為例示性的目的給出且絕非限制性，且應該參考所附的附圖而解讀，其中圖1是如在實施例13中所描述的電泳結果的實例。
[0065]發(fā)明詳述
[0066]在下述描述中，在沒有相反的陳述的情況下，重量百分數是按相對于組合物的總干重計而給出的。
[0067]在本發(fā)明的語境中，“組合物的總干重”指沒有溶劑，特別是水的組合物的總重量，且因此是相對于無水產品的總重量。
[0068]此外，組分的重量和所得的百分數可以對應于這些組分的無水重量，換句話說，當組分可以含有水時，組分不包括水的重量。這也可適用于所獲得的百分數。
[0069]組合物可以包含按相對于組合物的總重量的總量計大于或等于70%的膠原含量，特別是按重量計大于或等于75%，特別是大于或等于77%，事實上大于或等于80%。
[0070]此外，組合物可以包含按相對于組合物的總重量的重量計小于或等于99%的膠原含量，特別是按重量計小于或等于96%，特別是小于或等于93%，事實上小于或等于90%。
[0071]因此，組合物可以包含按相對于組合物的總重量的重量計從70%至99%范圍的膠原含量，特別是按重量計從75%至96%范圍，特別是從77%至93%范圍，事實上從80%至90%范圍。優(yōu)選地，膠原的含量是按相對于組合物的總重量的重量計約86%。
[0072]膠原是哺乳動物中的主要結構蛋白質。膠原由原膠原(tropocollagen, TC)分子組成，所述原膠原分子具有大約280-300nm的長度和大約1.5nm的直徑。
[0073]術語“纖維膠原”指代纖維形式的膠原，對應于原纖維的集合(assembly offibrils)。纖維一般具有范圍為從Iym至10 μπι的直徑。術語“原纖維膠原”指代原纖維形式的膠原。更精確地，原纖維一般具有IOnm至I μπι的直徑。因此，原纖維是由原膠原分子的交錯的陣列(staggered array)形成的，且這些原纖維可以排列以形成膠原纖維。纖維和/或原纖維膠原一般是不可溶的，而非原纖維膠原是高度可溶的。
[0074]纖維膠原和原纖維膠原的定義可以具體是由Markus Buehler在“Nature designstough collagen:explaining the nanostructure of collagen fibrils,，，in PNAS, Augustl5, 2006, vol.103, n0.33, pp.12285-12290 中所給出的。
[0075]已經發(fā)現(xiàn)了多于28種不同的膠原，其可以分類為3個主要類別:原纖維類型的膠原(collagens of the fibrillar type)、非原纖維類型的膠原(collagens of thenon-fibrilIar type)、和 FACIT 膠原。
[0076]原纖維類型的膠原是大部分包含原纖維和/或纖維膠原且?guī)缀醪话窃w維膠原的膠原(例如I型膠原)。 相似地，非原纖維類型的膠原是大部分包含非原纖維膠原的膠原。一些非原纖維類型的膠原可僅包含非原纖維膠原(consist only in)(例如IV型或V型膠原)。
[0077]膠原的工業(yè)提取和純化一般包括(consists in)將初始組織(initial tissues)去結構化(destructuration)以I)去除所有或大多數雜質蛋白質,和2)取決于產品的最終用途而獲得所需的結構化(structuration)水平。膠原提取一般在酸性或堿性條件中進行以允許將非原纖維的單分子可溶性膠原溶解。最終膠原自然含有纖維/原纖維膠原和非原纖維膠原的混合物。原纖維/纖維膠原和非原纖維膠原之間的比例取決于所挑選的用于提取的組織和提取工藝。
[0078]最終產物不同于通過將僅原纖維膠原和僅非原纖維膠原人工混合而獲得的膠原。在標題為“Extraction of collagen from connective tissue by neutral saltsolutions” (Proceedings of the NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES Volume 41 Number IJanuary 15,1955 by Jerome Gross, John H.Highberger and Francis 0.Schmitt)的文獻中，顯示了在具體的提取工藝之后獲得的原纖維和非原纖維膠原之間的區(qū)別，所述提取工藝-如前文所描述-導致了這兩種膠原的混合物。
[0079]在本發(fā)明的組合物中，膠原是原纖維類型的，且包含其量為按相對于膠原的總重量的重量計至少60%的纖維和/或原纖維膠原，特別是按重量計至少70%，特別是至少75%，實際上至少80%。
[0080]更具體地，膠原包含按相對于組合物中膠原的總重量的重量計至少85%，特別是至少90%，特別是至少95%，實際上至少98%的纖維和/或原纖維膠原。
[0081 ] 優(yōu)選組合物包含按相對于組合物中膠原的總重量的重量計從85%至95%范圍的纖維和/或原纖維膠原的含量，且最優(yōu)選按重量計從85%至90%。
[0082]這意指在優(yōu)選的實施方案中，組合物因此包含按相對于組合物中膠原的總重量的重量計從5%至15%范圍的非原纖維膠原的含量，且最優(yōu)選按重量計從10%至15%。
[0083]具有纖維和/或原纖維膠原相對于非原纖維膠原的這種比值的組合物是非常有利的，特別是用作止血粉末。事實上，纖維和/或原纖維膠原應以足夠以進行止血的量存在，而非原纖維膠原也應為足以用于產品的粘著(cohesion)的量，且不應為太大量以避免過度的泡脹。
[0084]膠原可以選自I型膠原或I型和III型膠原。膠原可以從多種源組織中提取，特別是來自所有物種，特別是豬、牛、或馬物種的皮膚和/或腱。 [0085]膠原可以大部分由源自豬、從皮膚和/或腱提取的纖維膠原制得。在膠原從腱提取的情況中，提取可以是如在國際申請W02010/125086中所描述的。
[0086]前述的膠原，特別是纖維膠原和/或原纖維膠原，可以來自酸性或堿性提取。根據一個具體實施方案，所述膠原來自堿性提取。根據一個具體實施方案，膠原可以是如在專利申請FR2944706中所描述的。
[0087]優(yōu)選地，膠原來自堿性提取，其使得能夠在提取的膠原中最大化纖維和/或原纖維膠原的含量。此外，可以優(yōu)化這類堿性提取以控制提取的膠原中的原纖維/纖維膠原和非原纖維膠原的比例。與酸性提取不同，堿性提取允許對蛋白聚糖的水解。該作用導致組織的去結構化并在不改變纖維形狀的前提下將其分離。在酸性條件中，纖維中內部膠原分子的膨脹導致其在工藝中的部分去結構化，其釋放更大量的非原纖維可溶性膠原。
[0088]可以將膠原交聯(lián)，特別是通過經典的交聯(lián)模式如熱脫水；使用橋聯(lián)劑(bridgingagents)，例如甲醛和/或戊二醛；通過氧化的多糖，如根據在國際專利申請W02010/125086中所描述的方法；和/或通過氧化的支鏈淀粉(amylopectins)或糖原。
[0089]組合物包含至少一種單糖，其單獨存在或與其它單糖形成混合物。所述單糖可以選自核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物。存在于本發(fā)明的組合物中、單獨存在或是與單糖形成混合物的單糖，特別地是葡萄糖。
[0090]組合物可以包含按相對于組合物的總重量的重量計從1%至12.5%范圍的單糖含量，特別是按重量計從1.5%到10%范圍，特別是按重量計從2%至8%范圍，且相當特別的是按重量計從2.5%至7.5%范圍。最優(yōu)選地，單糖含量按相對于組合物的總重量的重量計為約5% ο
[0091]組合物可以包含范圍為從5至100的膠原/單糖重量比值，特別是從7至65，更特別是從10至50，且還更特別是從11至40。最優(yōu)選地，組合物包含約19的膠原/單糖重量比值。
[0092]所述單糖，特別是核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物，且特別是葡萄糖，可以特別的使得可能獲得具有合意的特征、主要包含纖維和/或原纖維膠原和單糖的顆粒，所述合意的特征特別地是大小和密度。將單糖組入膠原的混合物中還允許降低組合物中的電荷，這使得能夠形成適于放置在如管、鼓風機(blower)、噴霧罐的容器中的粉末。
[0093]相當特別地，單糖的存在使得更容易和/或更便宜地獲得具有合意的密度和/或大小的顆粒，特別是在改進組合物的粉末的止血特性方面。
[0094]在沒有任何添加劑的情況下研磨膠原會減少纖維的大小和降低粉末的密度。此外，最終制備物含有大量的電荷，其阻止對最終產品的處理。因此提出在研磨膠原之前添加單糖，其造成待混合的制備物變硬(hardening)允許迅速的研磨(限制變性)，因此使得能夠制備電荷減少(適于將粉末放置于容器中，例如噴霧罐)、且具有適于噴霧組合物的最終密度的粉末。
[0095]與所預期的不同，這類對單糖的添加對于產品的最終活性沒有作用。特別地，其不改變最終產品的生物活性。單糖沒有止血效果。
[0096]此外，這類單糖的添加不使得其作為發(fā)泡劑起作用，如在W001/97873中的情況。在TO01/97873中，對稀釋的溶液加熱導致形成明膠?？梢灾瞥筛邼舛鹊拿髂z以獲得非常濃的溶液，但是最終產品含有明膠而非膠原。已知明膠不如膠原止血性好，因為血小板聚集需要存在膠原原纖維和天然膠原的結構，這在明膠中是不存在的。
[0097]根據一個實施方案，組合物包含，或事實上組成為顆粒，所述顆粒包含或實際上組成為膠原和單糖，特別是選自核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物的糖，特別是葡萄糖。
[0098]組合物可以包含至少一種，特別是一種，凝血因子。所述凝血因子是本領域技術人員所熟知的。優(yōu)先地，所述凝血因子是凝血酶。
[0099]所述凝血因子，特別是凝血酶，可以來自動物來源(從動物組織或體液中提取)或來自重組來源(通過培養(yǎng)經遺傳修飾細胞而產生)。所述凝血因子可以例如是從人組織中提取的凝血酶。
[0100]當存在凝血因子，特 別是凝血酶時，其含量可以按組合物的總重量的重量計小于0.1%。
[0101]在凝血酶的情況中，一般使用國際單位(international unit, IU)。因此，組合物可以包含從組合物的0.01IU/mg至20IU/mg范圍的凝血酶含量，特別是從0.05IU/mg至10IU/mg,特別是從0.lIU/mg至5IU/mg，特別是從0.2IU/mg至2IU/mg。最優(yōu)選凝血酶的含量-如果有的話-是組合物的約0.83IU/mg。
[0102]除了單糖，組合物還可以包含至少一種其它糖化合物，其可以是糖胺聚糖。這類糖化合物可以是組合物的一部分，所述組合物含或不含凝血因子如凝血酶。
[0103]所述糖胺聚糖可以選自硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質酸及其混合物，特別是硫酸軟骨素。
[0104]糖胺聚糖可以使得改進粉末吸收血液的速度成為可能。更特別地，糖胺聚糖可以加速血液與止血產品的接觸，特別是與膠原和凝血酶的接觸。
[0105]組合物可以包含按相對于組合物的總重量的重量計從2%至25%范圍的糖胺聚糖含量，特別是按重量計從3%至20%范圍，特別是按重量計從4%至15%范圍，相當特別的是按重量計從5%至12.5%范圍。最優(yōu)選糖胺聚糖的含量-如果有的話-是按相對于組合物的總重量的重量計約9%。
[0106]組合物可以包含重量比值為從2.5至50范圍的膠原/糖胺聚糖，特別是從3.5至35，更特別是從5至25，且還更特別是從6.5至20。
[0107]根據一個實施方案，組合物包含至少一種，特別是一種單糖以及至少一種，特別是一種，糖胺聚糖，特別是如以上所定義的單糖和糖胺聚糖，且特別是以上面所定義的量。
[0108]糖化合物相當特別地是單糖和糖胺聚糖。
[0109]組合物可以包含按相對于組合物的總重量的重量計從2%至25%范圍的糖含量,特別是按重量計從5%至23%范圍，特別是按重量計從7%至21%范圍，相當特別地是按重量計從10%至18%范圍。
[0110]組合物可以包含重量比值為從2至40范圍的膠原/糖，特別是從2.5至30，更特別是從3至20，且還更特別地是從3.5至15。
[0111]表述方法“糖化合物的總重量”指以上所定義的單糖的重量和以上所提到的其它糖化合物的重量之和。
[0112]根據一個實施方案，本發(fā)明包含或事實上組成為:
[0113]-膠原，其主要包含按相對于膠原的總重量的重量計至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，和
[0114]-至少一種，特別是一種，單糖。
[0115]相當特別地，組合物包含或事實上組成為:
[0116]-膠原，其量特別為按相對于組合物的總重量的重量計從70%至99%范圍，特別是按重量計從75%至96%范圍，特別是按重量計從77%至93%范圍，特別是按重量計從80%至90%范圍，其中所述膠原包含按相對于膠原的總重量的重量計至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，和
[0117]-至少一種單糖，特別是葡萄糖。其量為按相對于組合物的總重量的重量計從1%至12.5%范圍，特別是按重量計從1.5%至10%范圍，特別是按重量計從2%至8%范圍，和相當特別地是按重量計從2.5%至7.5%范圍。
[0118]根據另一個實施方案，組合物包含或事實上組成為:
[0119]-膠原，其主要包含按相對于膠原的總重量的重量計至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，
[0120]-至少一種，特別是一種，單糖，
[0121]-至少一種，特別是一種，凝血因子。
[0122]相當特別地，組合物包含或事實上組成為:
[0123]-膠原，其量特別地是按相對于組合物的總重量的重量計從70%至99%范圍，特別是按重量計從75%至96%范圍，特別是按重量計從77%至93%范圍，事實上是按重量計從80%至90%范圍，其中所述膠原含量包含按相對于膠原總重量的重量計至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，
[0124]-至少一種單糖，特別是葡萄糖，其量為按相對于組合物的總重量的重量計從1%至12.5%范圍，特別是按重量計從1.5%至10%范圍，特別是按重量計從2%至8%范圍，且相當特別地是按重量計從2.5%至7.5%范圍，和
[0125]-至少一種，特別是一種，凝血因子，特別是凝血酶，其量為組合物的從0.01IU/mg至20IU/mg范圍，特別是從0.05IU/mg至10IU/mg,特別是從0.lIU/mg至5IU/mg,事實上是從 0.2IU/mg 至 2IU/mg。
[0126]根據另一個實施方案，組合物包含或事實上組成為:
[0127]-膠原，其主要包含按相對于膠原總重量的重量計至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量的，
[0128]-至少一種，特別是一種，單糖，和
[0129]-至少一種，特別是一種，糖胺聚糖。[0130]相當特別地，組合物包含或事實上組成為:
[0131]-膠原，其量特別為按相對于組合物的總重量的重量計從70%至99%范圍，特別是按重量計從75%至96%范圍，特別是按重量計從77%至93%范圍，事實上是按重量計從80%至90%范圍，其中所述膠原包含按相對于膠原總重量的重量計至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，
[0132]-至少一種單糖，特別是葡萄糖，其量為按相對于組合物的總重量的重量計從1%至10%范圍，特別是按重量計從1%至12.5%范圍，特別是按重量計從1.5%至10%范圍，特別是按重量計從2%至8%范圍，且相當特別地是按重量計從2.5%至7.5%范圍，和
[0133]-至少一種糖胺聚糖，特別是硫酸軟骨素，其量為按相對于組合物的總重量的重量計從2%至25%范圍，特別是按重量計從3%至20%范圍，特別是按重量計從4%至15%范圍，相當特別地是按重量計從5%至12.5%范圍。 [0134]根據還另一個實施方案，組合物包含或事實上組成為:
[0135]-膠原，其主要包含按相對于膠原總重量的重量計至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，
[0136]-至少一種，特別是一種，單糖，
[0137]-至少一種，特別是一種，凝血因子，和
[0138]-至少一種，特別是一種，糖胺聚糖。
[0139]相當特別地，組合物包含或事實上組成為:
[0140]-膠原，其量特別為按相對于組合物的總重量特別是干重的重量計從70%至99%范圍，特別是按重量計從75%至96%范圍，特別是按重量計從77%至93%范圍，特別是按重量計從80%至90%范圍，其中所述膠原包含按相對于膠原總重量的重量計至少50%的纖維和/或原纖維膠原含量，
[0141]-至少一種單糖，特別是葡萄糖，其量為按相對于組合物的總重量的重量計從1%至10%范圍，特別是按重量計從1.5%至12.5%范圍，特別是按重量計從1.5%至10%范圍，特別是按重量計從2%至8%范圍，且相當特別地是按重量計從2.5%至7.5%范圍，
[0142]-至少一種凝血因子，特別是凝血酶，其量為組合物的從0.01IU/mg至20IU/mg范圍，特別是從0.05IU/mg至10IU/mg范圍，特別是從0.lIU/mg至5IU/mg范圍，事實上是從0.2IU/mg 至 2IU/mg 范圍，和
[0143]-至少一種糖胺聚糖，特別是硫酸軟骨素，其量為按相對于組合物的總重量的重量計從2%至25%范圍，特別是按重量計從3%至20%范圍，特別是按重量計從4%至15%范圍，相當特別地是按重量計從5%至12.5%范圍。
[0144]根據一個相當具體的實施方案，組合物包含或事實上組成為:
[0145]-原纖維類型的膠原，大部分包含纖維和/或原纖維膠原，所述原纖維類型的膠原是通過例如在堿性介質(basic medium)中提取而獲得的,且量為按相對于組合物的總重量的重量計約85%，
[0146]-葡萄糖，其量為按相對于組合物的總重量的重量計約4.9%，
[0147]-凝血酶，其量為組合物的0.2IU/mg至2IU/mg，和
[0148]-硫酸軟骨素，其量為按相對于組合物的總重量的重量計約10%。
[0149]根據另一個具體的實施方案，組合物包括或事實上組成為:[0150]-原纖維類型的膠原，大部分包含纖維和/或原纖維膠原，所述原纖維類型的膠原是通過例如在堿性介質中提取而獲得的，且量為按相對于組合物的總重量的重量計約85%，
[0151]-葡萄糖，其量為按相對于組合物的總重量的重量計5%，
[0152]-硫酸軟骨素，其量為按相對于組合物的總重量的重量計10%。
[0153]在本發(fā)明的語境中，表述“約X%的量”指正負20%的變化，換句話說，約10%的量意指從8%至12%，特別是正負10%的變化，事實上是正負5%的變化。
[0154]當添加凝血酶時，將凝血酶粉末與已經制備的膠原/單糖的均質分子混合物物的粉末混合。當添加硫酸軟骨素時，將凝血酶首先添加至硫酸軟骨素粉末，并將該混合物添加至之前的膠原/單糖混合物(已經研磨成粉末)。凝血酶不受糖或膠原穩(wěn)定化。凝血酶從不與單糖的溶液接觸(與W098/57678相反)，這阻止蛋白質的任何變性和粉末的再水化(rehydration),這會使得無法再適當地將粉末干燥。
[0155]組合物可以以幾種形式的固體粉末提供，特別是可噴霧的粉末。本發(fā)明的組合物優(yōu)選是可噴霧的粉末。
[0156]粉末形式的組合物可以具體包含或組成為:
[0157]-顆粒，其包含或組成為原纖維類型的膠原和至少一種單糖，特別是葡萄糖，其中特別地所述顆粒具有如在本發(fā)明說明書中所定義的大小、粒度和/或密度，和
[0158]-任選地，顆粒，其包含或組成為至少一種糖胺聚糖，特別是硫酸軟骨素，和/或至少一種凝血因子，特別是凝血酶，其中特別地所述顆粒具有如在本發(fā)明說明書中所定義的大小、粒度和/或密度。
[0159]粉末形式的本組合物，相當特別地可噴霧粉末，可以有利地具有大于0.4g/mL，相當特別地大于或等于0.4g/mL的致密密度(tapped density)。事實上，當將粉末用作止血劑時，其密度必須足以防止血流對產品的任何稀釋和排斥。提供給具有大于0.4g/mL的密度的粉末組合物防止粉末被血液沖走。
[0160]當手動施用時，外科醫(yī)師應當以紗布(a gauze)壓制粉末而在壓制最后不去除產
品O
[0161]當意圖將粉末組合物噴霧在流血的傷口上時，優(yōu)選這類組合物具有高得多的密度以允許粉末顆粒在從噴霧器中射出時達到一定的動能。事實上，氣體不能完美地移動具有低密度的粉末以抵達傷口而不形成云霧，而這與在多數情況中所需要的精確的施用不相容。具有較高的密度還使得噴霧器能夠賦予粉末足夠的動能以使粉末較好的沖擊至傷口上。因此，粉末組合物優(yōu)選具有高于0.4g/mL的致密密度。甚至更優(yōu)選粉末組合物具有小于或等于0.6g/mL的致密密度。
[0162]獲得具有這類密度特征的粉末組合物的一種方式包括:研磨干燥的膠原的餅(cake of dry collagen),此種餅是膠原的硬而致密的制備物。所需的密度不可通過研磨膠原的凍干的制備物而達到，因為該最終顆粒將會是扁平的且因此不能噴霧，其具有重要的靜電電荷。例如，如在W001/97873中制備的產品不能制成具有這樣的密度和這樣可噴霧特征的粉末。
[0163]在W02005/072700中描述的粉末具有非常低的密度，且該粉末因此不能被噴霧以抵達目標器官，特別是在腹腔鏡中。特別地，其在需要沖擊以防止來自血流的排斥的時候不會抵達傷口。[0164]本組合物，特別是粉末形式的組合物，相當特別地是可噴霧的，可以優(yōu)選具有高于0.4g/mL的致密密度，特別是高于0.41g/mL。
[0165]還更優(yōu)選地，組合物粉末的致密密度高于0.4g/mL,且最優(yōu)選小于或等于0.6g/
mLo
[0166]散裝密度(bulk density) —般大于或等于0.3g/mL,相當特別地大于或等于
0.31g/mL。
[0167]散裝密度有利地高于0.3g/mL，相當特別地高于0.31g/mL。
[0168]這些密度是根據在實施例中所描述的規(guī)程而測量的。
[0169]本發(fā)明的組合物有利地具有范圍為從I秒至600秒的止血能力，特別是從I秒至200秒，更特別是從I秒至60秒，事實上是從I秒至40秒。止血能力是根據在實施例中呈現(xiàn)的規(guī)程測量的。
[0170]本發(fā)明的組合物有利地包含按重量計至少50%的顆粒，其大小在200 μ m和400 μ m之間。
[0171]構成粉末的顆粒有利地具有從10 μ m至500 μ m的平均粒度范圍，特別是從50 μ m至 400 μ m。
[0172]有利地，按重量計至少90%，特別是按重量計100%的構成所述粉末的顆?？梢源┻^篩網，所述篩網的篩目是500 μ m,特別是400 μ m。
[0173]按重量計至少90%重，且特別是按重量計至少95%的構成所述粉末的顆?？梢员缓Y目為10 μ m,顯著地20 μ m,事實上30 μ m,事實上50 μ m的篩網保留。
[0174]選擇該再分配(repartition)以允許噴霧粉末。顆粒大小太小的話，粉末過于粉狀以致不能適當地抵達目標，且具有過高的顆粒大小使得粉末不能噴霧。
[0175]組合物的主要化合物，特別是膠原，可以在20分鐘處具有范圍從0.7至I的溶脹比(swelling ratio),如根據在實施例中所描述的規(guī)程所測量的(見實施例4)。
[0176]組合物，特別是當所述組合物包含至少一種糖胺聚糖時，且特別是當所述組合物包含硫酸軟骨素時，可以在20分鐘處具有從5至15的溶脹比，特別是從8至12，且相當特別地是從10至12，如根據在實施例中所描述的規(guī)程而測量的(見實施例5)。
[0177]根據一個優(yōu)選的實施方案，組合物是以可噴霧的干燥粉末的形式而提供的。
[0178]粉末形式的組合物特別地包含:
[0179]-包含膠原和單糖的顆粒，和
[0180]-任選地，至少一種糖胺聚糖和/或凝血酶。
[0181]組合物可以包含:
[0182]-包含膠原、單糖、和任選地至少一種糖胺聚糖和/或凝血因子的顆粒，
[0183]-包含膠原、單糖、和任選地凝血因子和任選地糖胺聚糖顆粒的顆粒
[0184]-包含膠原和單糖的顆粒以及包含至少一種糖胺聚糖和/或凝血因子的顆粒。
[0185]在本發(fā)明的語境中，表述“干燥的粉末”意指組合物包含有限的溶劑含量，特別是水。所述有限的含量可以是按相對于組合物的總重量的重量計小于20%，特別是按重量計小于15%，特別是按重量計小于10%，且相當特別地是按重量計小于5%。
[0186]所述干燥的形式可以通過將所使用的溶劑簡單地蒸發(fā)、通過脫水或通過有機溶劑獲得。[0187]干燥粉末形式的組合物可以特別地通過噴霧而施用。
[0188]特別地，本發(fā)明涉及包含試劑盒，其包含:
[0189]-根據本發(fā)明的組合物，和
[0190]-噴霧設備。
[0191]所述組合物是如根據本發(fā)明說明書所定義的。本領域技術人員知曉用于噴霧粉末形式的藥物組合物的噴霧設備。
[0192]特別地，所述設備可以包含壓縮氣體的儲備，其中通過激活裝置的激活，特別是通過觸發(fā)器(trigger)，而將所述壓力釋放。 [0193]所述設備可以包含:
[0194]-激活裝置，
[0195]-粉末儲備，特別包含根據本發(fā)明的粉末，
[0196]-氣體儲備,其連接至粉末儲備，
[0197]-連接至粉末儲備的噴霧器，
[0198]-與激活手段偶聯(lián)的閥門A，其中當激活裝置靜止時所述閥門A關閉且因此阻斷氣體儲備和粉末儲備之間的氣體的流通，且其中當激活裝置被激活時所述閥門開啟以輸送氣體的注入(an injection of gas)以噴霧至少部分的粉末。
[0199]可以將氣體儲備與供應壓縮氣體的裝置，例如壓縮氣體的系統(tǒng)或壓縮氣體的罐(tank)偶聯(lián),特別是為了使得系統(tǒng)自主(autonomous)。
[0200]設備可以在氣體儲備和供應裝置之間包含閥門B，其中所述閥門B與激活裝置偶聯(lián)。
[0201]閥門B默認處在開啟位置，除非當激活裝置被激活時，在該情況中其關閉。
[0202]因此，當閥門A開啟時，閥門B關閉，反之亦然。這使得能夠遞送預定量的壓縮氣體以遞送粉末的劑量，而防止污染物接觸設備的內部。
[0203]當設備不與供應氣體的裝置偶聯(lián)時，優(yōu)選閥門B關閉。這可以幫助限制污染設備內部的風險。
[0204]相當特別地，粉末儲備是以圓筒的形式，其包含幾個劑量的粉末。所述圓筒可以與由氣流所激活的推進器偶聯(lián)，其使得在激活裝置激活后粉末能夠被噴霧，且因此旋轉圓筒并改變粉末的劑量。
[0205]存在于圓筒中的劑量可以密封以使得無菌，所述密封特別是具有當氣流穿過所述的劑量時會掀開(tears open)的組件。這使得有可能將劑量保存在無菌的環(huán)境中。
[0206]劑量的體積可以是約0.2cm3至Icm3,特別是約0.3cm3。
[0207]所使用的氣體可以是空氣、二氧化碳或任意惰性氣體(inert gas)。
[0208]特別地，設備是如在歐洲專利EP11163820.1和美國臨時申請?zhí)?1/479，805中描述的，其都在2011年4月27日提交，并通過提述并入本文。
[0209]本發(fā)明還涉及用于制備止血組合物的方法，特別地如上面所定義的，其包括至少以下步驟:
[0210]a)形成水性懸液，其包含、或事實上組成為，原纖維類型的膠原——主要包含纖維和/或原纖維膠原——和單糖，如葡萄糖，
[0211]b)以沉淀、糊或凝膠形式回收產物，特別是通過離心或傾析，[0212]c)干燥產物，例如通過蒸發(fā)。
[0213]d)將產物研磨至合意的粒度,特別是通過錘式粉碎機(hammer mill),和
[0214]e)任選地，添加凝血酶和/或硫酸軟骨素，特別是以固體形式，特別是以粉末形式添加。
[0215]步驟a)中形成包含纖維/原纖維膠原和單糖的水性懸液導致單糖在膠原分子周圍的再分配(repartition)。此外，膠原和單糖分子種之間緊密的接觸導致在脫水后形成硬的餅，其適于通過研磨獲得具有所需的高密度的粉末。與之相反，將膠原粉末和葡萄糖粉末混合無法獲得均質和可噴霧的粉末，特別是因為密度和電荷的緣故。
[0216]在步驟a)中，膠原可以以從30g/L至150g/L范圍的濃度存在。
[0217]可將單糖以如在說明書中所定義的量添加至懸液或添加至均質膠原糊中，且更特別地為按相對于膠原重量的重量計2%至5%。
[0218]在步驟a)中單糖可以以從0.3g/L至10g/L范圍的濃度而存在。
[0219]步驟a)的膠原的水性懸液可以是酸，且特別是包含酸如鹽酸。所述酸可以以從
0.01M至0.5M范圍的濃度而存在，且特別是從0.02M至0.1M，事實上是約0.05M。所述懸液可以為均質糊的形式。
[0220]步驟b)可以包括將懸液傾入鑄模(mold)中。
[0221]進行步驟c)以獲得盡可能厚的餅(比所期望的最終粒度更好(superior thefinal granulometry wanted)),其具有非常高的密度且餅內部具有盡可能少的氣泡(小于5%)。
[0222]步驟d)可以繼以篩選粉末的步驟，特別是用于獲得合意的粒度。
[0223]根據一個優(yōu)選的實施方案，步驟a)包括形成包含按重量計95%的原纖維類型的膠原和按重量計5%的葡萄糖的混合物。在已經將該混合物干燥(步驟b))和研磨(步驟c))后，添加按相對于混合物的總重量的重量計10%的硫酸軟骨素，使得最終組合物包含:
[0224]-膠原:其按相對于組合物的總重量的重量計為86.36% ；
[0225]-葡萄糖:其按相對于組合物的總重量的重量計為4.54% ；
[0226]-硫酸軟骨素:其按相對于組合物的總重量的重量計為9.09% ；
[0227]當也添加凝血酶時，其代表按相對于組合物的總重量的重量計低于0.01%的最終含量。在上述的混合物中，凝血酶的量可以是組合物的0.083IU/mgo
[0228]根據另一個實施方案，本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明的方法可獲得的粉末。
[0229]對于所有前述的粉末產品，很明顯可能施以大致徹底的研磨以根據研磨的類型及其持續(xù)時間獲得具有不同粒度的粉末。
[0230]根據其另一個方面，本發(fā)明涉及如上所定義的組合物作為止血劑的用途。
[0231]根據其還另一個方面，本發(fā)明涉及藥物組合物或藥物，其包含、或事實上組成為，如以上所定義的組合物，特別是作為止血劑。
[0232]根據其另一個方面，本發(fā)明涉及如上所定義的組合物用于制備藥物或藥物組合物的用途，特別是止血性藥物或藥物組合物。
[0233]根據其另一個方面，本發(fā)明涉及止血方法，其包括將如以上所定義的組合物沉積和/或噴霧在動物的身體的出血的部分。特別地，所述組合物可以用于外科手術步驟，特別是剖腹手術、腹腔鏡、體腔鏡、和自動步驟(robotic procedures)。[0234]本發(fā)明還涉及止血方法，其包括將本發(fā)明的組合物噴霧的步驟。
[0235]根據其另一個方面，本發(fā)明涉及將如以上所定義的組合物用作生物粘合劑。
[0236]根據其還另一個方面，本發(fā)明涉及如以上所定義的組合物作為瘢痕形成劑(cicatrizing agent)用于內部和外部傷口的用途。表述“瘢痕形成劑”指使得與其接觸的組織獲得臨床上令人滿意的瘢痕形成成為可能的產品。
實施例
[0237]實施例1:用于測量密度的規(guī)程
[0238]將待測試的產品(600mg)，特別是粉末形式的產品，引入5mL的帶刻度的量筒(graduated cylinder)中。測量了產品的高度并記錄了相應的體積。將測量重復3次。然后將產品物通過在堅硬表面上敲擊100次而將產品壓縮(pack) 3次。再次測量產品的高度和對應的體積。由此獲得了壓縮前和壓縮后的產品的密度，分別稱為散裝密度和致密密度。
[0239]實施例2:用于體外測量止血能力的規(guī)程
[0240]在整個測量過程中將檸檬酸化(約0.1M)的人血液在水浴中保持在37°C。將要測量的產品(IOmg)沉積于帶有扣蓋(snap-on cap)的5mL聚丙烯試管中，然后添加檸檬酸化的新鮮血液(2mL)。然后添加CaCl2使得血液中的CaCl2終濃度為15mM，然后將試管封閉。將內含物通過劇烈地反轉(10次)混合，然后將試管浸沒在水浴中；每10秒將試管回復至垂直位置。記錄形成血塊所需的時間并與止血能力相對應。
[0241]實施例3:用于測量顆粒大小的規(guī)程
[0242]將已知量的產品，特別是粉末，通過50 μ m，100 μ m, 200 μ m, 300 μ m和400 μ m篩網
過篩2分鐘(每次篩選)。將來自每次篩選的級分稱重。確定粒度范圍的比例。
[0243]實施例4:用于測量組合物的多數化合物的泡脹的規(guī)程
[0244]將組合物,特別是膠原(40mg至70mg)在稱量舟(weighing boat)中稱量。將6mL的0.15M NaCl沉積于另一個稱量舟中。將待測試的化合物沉積于0.15M NaCl上(t=0)。在20分鐘后，去除過量的液體并稱量泡脹了的產品。溶脹比對應于吸收的水的量相比于干燥的初始產品的重量。
[0245]實施例5:用于測量組合物的泡脹的規(guī)程
[0246]稱量了 15mL的燒瓶(以mg計的mQ)，然后添加X mg的干燥組合物的粉末(以mg計的IVx)。添加0.15M水性NaCl溶液(2mL)并允許組合物泡脹20分鐘；然后將燒瓶在
I,OOOrpm 離心。
[0247]以巴斯德吸管將過量的NaCl去除并通過將燒瓶反轉到濾紙上而消除了微滴(droplets);然后稱量帶有潮濕粉末的燒杯(以mg計的Iii1)。
[0248]溶脹比是如下所述計算的:(Oii1-m。) / (m0+x-m0))。
[0249]實施例6:通過堿性提取制備原纖維類型的膠原
[0250]將豬真皮的片(30kg)以丙酮脫脂，并允許其在IOOkg的0.05M NaOH溶液中泡脹3小時。以切割碎機(cutting mill)將真皮精細地切碎并將所獲得的糊以50升的0.05MNaOH稀釋。然后使混合物·在壓力下通過Imm篩網。然后以HCl將所獲得的糊調節(jié)至pH6_7.5并通過離心或經過1_篩網過濾收集所獲得的糊。
[0251]根據本領域技術人員已知的方法以丙酮將滲余物(retentate)脫水。因此脫水的滲余物包含原纖維類型的膠原，其具有相對于非原纖維膠原的大量的纖維/原纖維膠原。一般地，此種提取的膠原包含按相對于膠原的總重量的重量計從85%至95%的纖維/原纖維膠原，和按相對于膠原的總重量的重量計5%至15%的非原纖維膠原。
[0252]實施例7:制備止血粉末#1
[0253]將30g如在實施例6中所制備的原纖維類型的膠原添加至IL的0.02M水性HCl溶液，然后攪拌混合物5小時。接著，向所獲得的均質糊添加量為按相對于膠原的重量的重量計2%(0.6g)的粉末化的果糖。
[0254]將混合物均質化I小時并且然后傾倒出并脫水。在干燥后，使用7，OOOrpm的Fitzpatrick錘式粉碎機在受控的加熱下以25g/min的速率將干燥的產物研磨。然后將產物通過機械過篩(mechanical sifting)篩選以消除大小大于400 μ m的顆粒。
[0255]然后向粉末添加量為按相對于粉末的干物質的重量計2%的硫酸皮膚素(0.612g)。
[0256]然后使用球磨機(ball mill)將混合物均質化，以粉末的15IU/mg的量將凍干的凝血酶添加至混合物，且最后使用球磨機將混合物均質化。
[0257]實施例8:制備止血粉末#2
[0258]將7.5kg如在實施例6中制備的原纖維類型的膠原添加至50L的0.05M水性HCl溶液，然后攪拌混合物16小時。 接著，向所獲得均質糊中添加量為按相對于膠原的重量的重量計5%的粉末化的果糖(375g)。
[0259]將混合物均質化3小時且然后分布至板上并脫水。在干燥后，通過使用在12，OOOrpm的錘式粉碎機在受控的加熱下的以5g/min的速率通過分級研磨干燥的產物。然后通過機械過篩篩選產物以消除大小大于400 μ m的顆粒和大小小于50 μ m的顆粒。
[0260]測量了粒度以驗證其分布為按重量計60%的樣品具有大于200 μ m的粒度。
[0261]然后向粉末添加量為按粉末的干物質的重量計20%的純化的硫酸軟骨素(1.575kg)。使用球磨機將混合物均質化。
[0262]最終，向混合物中添加量為粉末的10IU/mg的凍干的凝血酶。如同之前，使用球磨機將混合物均質化。
[0263]實施例9:制備止血粉末#3
[0264]將1000g如在實施例6中制備的原纖維類型的膠原添加至60mL的0.02M水性HCl溶液，然后攪拌混合物5小時。接著，向所獲得的均質糊添加量為按相對于膠原的重量的重量計5%的粉末化的葡萄糖(50g)。
[0265]將混合物均質化I小時并傾倒出和脫水。在干燥后，使用Fitzpatrick錘式粉碎機以7，OOOrpm在受控的加熱下以25g/min的速率將干燥的產物研磨。然后將產物通過機械過篩篩選以消除大小大于400 μ m的顆粒和大小小于50 μ m的顆粒。
[0266]然后向粉末添加量為按粉末的干物質的重量計10%的硫酸軟骨素(105g)。然后使用球磨機將混合物均質化。
[0267]這類的粉末組合物具有約0.408g/mL的致密密度。
[0268]實施例10:制備止血粉末#4
[0269]將500g如在實施例6中制備的原纖維類型的膠原添加至30mL的0.02M水性HCl溶液，然后攪拌混合物5小時。下一步，向所獲得的均質糊添加按相對于膠原的重量的重量計5%的粉末化的葡萄糖(25g)。
[0270]將混合物均質化I小時并然后傾倒出和脫水。在干燥后，使用7，OOOrpm的Fitzpatrick錘式粉碎機在受控的加熱下以25g/min的速率將干燥產物研磨。然后將產物通過機械過篩篩選以消除大小大于400 μ m的顆粒和大小小于50 μ m的顆粒。
[0271]然后向粉末添加量為按粉末的干物質的重量計10%的混合了凝血酶粉末的硫酸軟骨素(52.5g)。以0.85U/mg的最終量向混合物中添加凝血酶。然后使用球磨機將混合物均質化。
[0272]這類粉末組合物具有約0.425g/mL的致密密度。
[0273]實施例11:基于粉末#3的止血膠原的性能
[0274]在體內實驗期間測試了如在實施例9中所制備的含有膠原、葡萄糖、硫酸軟骨素，不含凝血酶的基于膠原的粉末#3。
[0275]該實驗的規(guī)程如下:
[0276]-在左旁正中肝葉表面上造成大小為大約10*10*l-3mm3的傷口。
[0277]-然后在30秒期間施用測試中產物。施用了足量的產物以覆蓋傷口；將測試材料使用紗布通過溫和按壓保持在傷口位點。
[0278]-然后做了出血評級(bleedinggrading)以評價所達到的止血的百分數。如果達到了臨床可接受的止血，則停止實驗。否則，再完成另一輪按壓-評級，最多5輪按壓。在每一輪都更新接受實驗的產物。
[0279]用下述產物進行了實驗:不帶任何止血組合物的紗布(稱為“對照”)，由止血粉末#3所覆蓋的紗布(稱為“GHP#3”)，來自Davol的止血紗布“Avitene” (稱作“Avitene”，由膠原纖維構成)，來自Ethicon的止血紗布“Surgicel ”(稱為“Surgicel ”，由氧化纖維素(oxidized cellulosis)構成)。
[0280]結果在下述表1中總結，其顯示了每種產物所達到的止血的百分數:
[0281]表1
[0282]
【權利要求】
1.一種粉末形式的止血組合物，其包含 -原纖維類型的膠原，所述膠原包含按相對于膠原的總重量的重量計至少70%的纖維膠原和/或原纖維膠原含量，以及 -至少一種單糖。
2.權利要求1的組合物，其中所述組合物包含按相對于組合物的總重量的重量計80%-90%范圍的膠原含量。
3.權利要求1至2任一項的組合物，其中所述組合物包含按相對于組合物的總重量的重量計1%到12.5%范圍的單糖含量。
4.權利要求1至2任一項的組合物，其中所述組合物包含從10到50范圍，且優(yōu)選為19的膠原/單糖重量比值。
5.權利要求1至4任一項的組合物，其中所述膠原包含按相對于膠原的總重量的重量計85%到95%范圍的纖維膠原和/或原纖維膠原含量。
6.權利要求1至5任一項的組合物，其中所述組合物還包含按相對于組合物的總重量的重量計2%到25%范圍的糖胺聚糖含量。
7.權利要求1至8任一項的組合物，其中所述組合物還包含在2到40范圍的膠原/總糖化合物的重量比值，其中總糖化合物的重量是單糖的重量和糖胺聚糖的重量之和。
8.權利要求1至7任一項的組合物，其中所述組合物還包含凝血因子，特別是凝血酶，其量的范圍為0.01IU/mg至20IU/mg組合物。
9.權利要求1至8任一項的組合物，其中所述組合物具有大于0.4g/mL的致密密度(tapped density)。
10.權利要求1至9任一項的組合物，其中所述組合物包含按重量計至少50%的顆粒，所述顆粒的大小在200 μ m和400 μ m之間。
11.權利要求1至10任一項的組合物，其包含: -按相對于組合物的總重量的重量計86.36%的量的膠原， -按相對于組合物的總重量的重量計4.54%的量的葡萄糖， -按相對于組合物的總重量的重量計的9.09%的量的硫酸軟骨素。
12.權利要求11的組合物，還包含凝血酶，其量為0.2IU/mg至2IU/mg組合物。
13.一種用于制備止血組合物的方法，其至少包括以下步驟: a)形成包含原纖維類型的膠原和至少一種單糖的水性懸液，所述原纖維類型的膠原具有按相對于膠原的總重量的重量計的至少70%的纖維膠原和/原纖維膠原含量， b)以沉淀、糊、或凝膠形式回收產物，特別是通過離心或傾析， c)干燥產物， d)將產物研磨至合意的粒度。
14.權利要求13的方法，其中所述在步驟a)中使用的膠原是通過堿性提取獲得的。
15.權利要求13或14任一項的方法，還包括在步驟d)之后的步驟e)，其包括添加至少一種選自下組的化合物: -凝血因子，特別是凝血酶，以及 -糖胺聚糖，特別是硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質酸、及其混合物。
16.權利要求1至12的組合物或可以通過如權利要求13所定義的方法而獲得的組合物，其用于與止血劑相同的用途。
17.—種試劑盒，其包含 -權利要求1至12和16任一項的組合物，和 -噴霧設備。`
【文檔編號】A61P7/04GK103635202SQ201280031849
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年4月26日 優(yōu)先權日:2011年4月27日
【發(fā)明者】C.加格尼厄, P.福里斯特, S.皮科特 申請人:比奧馬普公司