Rspo結(jié)合劑和其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及RSPO結(jié)合劑和使用該結(jié)合劑治療諸如癌等疾病的方法。本發(fā)明還提供特異性結(jié)合人RSPO蛋白并調(diào)節(jié)β連環(huán)素活性的抗體。本發(fā)明還提供使用調(diào)節(jié)RSPO蛋白的活性的試劑的方法，所述試劑例如為特異性結(jié)合RSPO1、RSPO2和/或RSPO3并抑制腫瘤生長(zhǎng)的抗體。還描述了治療癌的方法，所述方法包括對(duì)具有腫瘤或癌的患者施用治療有效量的本發(fā)明的試劑或抗體。
【專(zhuān)利說(shuō)明】RSPO結(jié)合劑和其應(yīng)用
【背景技術(shù)】【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明的領(lǐng)域大體上涉及結(jié)合包括RSPOl、RSP02和RSP03在內(nèi)的R-反應(yīng)蛋白(RSPO)(特別是人R-反應(yīng)蛋白)的抗體和其他試劑，以及使用所述抗體或其他試劑來(lái)治療諸如癌等疾病的方法。
[0002]【背景技術(shù)】
[0003]蛋白質(zhì)的R-反應(yīng)蛋白(RSPO)家族在脊椎動(dòng)物中是保守的，并且包括四個(gè)成員，RSPOl、RSP02、RSP03和RSP04。這些蛋白被以各種名稱(chēng)相稱(chēng)，包括頂板特異性反應(yīng)蛋白、hPWTSR(hRSP03)、THS2D(RSP03)、Cristinl_4 和 Futrinl-4。RSPO 是小的分泌蛋白，其共享約40%至60%的序列同源性和結(jié)構(gòu)域組織。所有的RSPO蛋白在N-末端含有兩個(gè)弗林蛋白酶(furin)樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，其連著血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域以及堿性帶電C末端尾部(Kim 等，2006，Cell Cycle, 5:23-26)。
[0004]研究已經(jīng)顯示，RSPO蛋白在脊椎動(dòng)物發(fā)育(Kamata等，2004，Biochim.BiophysActa, 1676:51-62)期間和在非洲爪蟾肌發(fā)生(Kazanskaya 等,2004, Dev.Cell, 7:525-534)中起作用。RSPOl還據(jù)顯示充當(dāng)胃腸上皮細(xì)胞用的強(qiáng)效絲裂原(Kim等，2005，Science, 309:1256-1259)。已知RSPO蛋白激活與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)相似的β連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)，但是仍正在研究RSPO蛋白和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)之間的關(guān)系。已經(jīng)報(bào)道RSPO蛋白對(duì)Wnt配體擁有正向調(diào)節(jié)活性(Nam等，2006，JBC281:13247-57)。該研究報(bào)道了 RSPO蛋白能夠充當(dāng) Frizzled8和LRP6受體配體，并誘導(dǎo)β連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)(Nam等，2006，JBC281:13247-57)。近期研究已經(jīng)鑒定了 RSPO蛋白和諸如LGR5等LGR(富含亮氨酸重復(fù)的G蛋白偶聯(lián)受體)蛋白之間的相互作用(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第2009/0074782和2009/0191205號(hào))，這些數(shù)據(jù)提出了 β -連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的激活的替代途徑。
[0005]Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑已被鑒定為癌治療的潛在靶標(biāo)。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑是胚胎模式形成、胚胎后組織維持和干細(xì)胞生物學(xué)的數(shù)種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素之一。更具體而言，fct信號(hào)傳導(dǎo)在細(xì)胞極性的產(chǎn)生和細(xì)胞命運(yùn)特化(包括干細(xì)胞群的自我更新)中起重要作用。不受調(diào)節(jié)的Wnt途徑的激活與許多人類(lèi)癌癥有關(guān)，據(jù)信在所述癌癥中這樣的激活能夠改變細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn)。fct途徑的激活可以將腫瘤細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)和/或?qū)е虏皇芸氐脑鲋?。因此癌變可以通過(guò)壓制控制正常發(fā)育和組織修復(fù)的體內(nèi)平衡機(jī)制進(jìn)行(在Reya&Clevers，2005，Nature, 434:843-50; Beachy 等，2004，Nature, 432:324-31 中綜述)。
[0006]Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑首次在果蠅發(fā)育突變無(wú)翼體(wg)中闡明，并且來(lái)自鼠類(lèi)原癌基因 int_l (現(xiàn)在的 Wntl) (Nusse&Varmus, 1982, Cell, 31:99-109; Van Ooyen&Nusse, 1984, Ce11，39:233-40;Cabrera等，1987，Cell, 50:659-63;Ri jsewi jk等，1987，Cell, 50:649-57)。Wnt基因編碼分泌的脂修飾的糖蛋白，所述糖蛋白在哺乳動(dòng)物中已被鑒定出其中的19個(gè)。這些分泌的配體激活由Frizzled(FZD)受體家族成員和低密度脂蛋白(LDL)受體相關(guān)蛋白5或6(LRP5/6)組成的受體復(fù)合物。FZD受體是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白，并且含有具有10個(gè)保守性半胱氨酸的大的細(xì)胞外N末端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域被稱(chēng)為富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CRD)或Fri結(jié)構(gòu)域。存在10種人FZD受體，F(xiàn)ZDU FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9 和 FZDlOo 不同的 FZD CRD 對(duì)特定的fct蛋白具有不同的結(jié)合親和性(Wu&Nusse, 2002, J.Biol.Chem.，277:41762-9)，因此將FZD受體分類(lèi)為激活典型β連環(huán)素途徑的受體和激活非典型途徑的受體(Miller等，1999，Oncogene, 18:7860-72)。
[0007]在經(jīng)附近注射鼠類(lèi)病毒而轉(zhuǎn)化的乳腺瘤中將Wntl (最初稱(chēng)為inti)鑒定為致癌基因后，首次揭示了 Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在癌中的作用(Nusse&Varmus, 1982, Cell, 31:99-109)。近期還已經(jīng)積累了 fct信號(hào)傳導(dǎo)在乳腺癌中的作用的額外證據(jù)。例如，乳腺中β-連環(huán)素的轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致增生和腺癌(Imbert等，2001，J.Cell Biol.，153:555-68;Michaelson&Leder, 2001, Oncogene, 20:5093-9)，而Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的喪失干擾正常的乳腺發(fā)育(Tepera 等，2003，J.Cell Sc1.，116:1137_49;Hatsell 等，2003，J.Mammary GlandBiol.Neoplasia, 8:145-58)。在人乳腺癌中，β -連環(huán)素累積在超過(guò)50%的癌中涉及激活的fct信號(hào)傳導(dǎo)，雖然尚未鑒定出具體的突變，但是觀察到Frizzled受體表達(dá)的上調(diào)(Brennan&Brown, 2004, J.Mammary Gland Biol.Neoplasia, 9:119-31;Malovanovic等，2004，Int.J.0ncol.，25:1337-42)。
[0008]Wnt途徑的激活還與結(jié)直腸癌相關(guān)。所有結(jié)直腸癌中的約5%至10%遺傳有作為家族性腺瘤性息肉病(FAP)的主要形式之一，該疾病是一種常染色體顯性疾病，其中約80%的受影響個(gè)體含有腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)基因中的種系突變。還在包括Axin和β-連環(huán)素在內(nèi)的其他fct途徑組分中鑒定出突變。個(gè)體的腺瘤是含有第二失活等位基因的上皮細(xì)胞的克隆外生長(zhǎng)物，大量的FAP腺瘤必然通過(guò)致癌基因和/或腫瘤抑制基因的另外突變導(dǎo)致腺癌的發(fā)展。此外，fct信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活，包括APC中的功能喪失突變和β-連環(huán)素中的穩(wěn)定化突變，能夠誘導(dǎo)小鼠模型中的增生性發(fā)育和腫瘤生長(zhǎng)(Oshima等，1997，CancerRes.，57:1644-9; Hara da 等，1999，EMBO J.，18:5931-42)。
[0009]與乳腺癌和結(jié)腸癌相似，黑素瘤經(jīng)常具有Wnt途徑的組成性激活，這可以通過(guò)β-連環(huán)素的細(xì)胞核累積表明。將fct/β-連環(huán)素途徑在一些黑素瘤和細(xì)胞系中的激活歸因于諸如APC、ICAT、LEF1和β -連環(huán)素等途徑組分的修飾(例如參見(jiàn)Larue等，2006，F(xiàn)rontiers Biosc1., 11:733-742)。但是，關(guān)于Wnt/ β -連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)在黑素瘤中的確切作用在文獻(xiàn)中存在矛盾的報(bào)道。例如，一個(gè)研究從黑素瘤發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核連環(huán)素的水平升高與存活率提高相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)激活的fct/ β -連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)與細(xì)胞增殖減少相關(guān)(Chien 等，2009，PNAS, 106:1193-1198)。
[0010]癌藥物研究的焦點(diǎn)正在轉(zhuǎn)向以參與人癌的基因、蛋白質(zhì)和途徑為目標(biāo)的靶向治療。對(duì)于靶向信號(hào)傳導(dǎo)途徑的新型試劑和靶向能夠?yàn)榘┗颊咛峁┲委熞嫣幍亩喾N途徑的新型試劑組合存在需要。因此，干擾β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的生物分子(例如抗-RSPO抗體)是癌以及其他β-連環(huán)素相關(guān)疾病的新型治療劑的潛在來(lái)源。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0011]本發(fā)明提供諸如抗體等結(jié)合RSPO蛋白的結(jié)合劑，以及包含所述結(jié)合劑的組合物，例如藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑是諸如抗體、抗體片段等新型多肽以及涉及此類(lèi)抗體的其他多肽。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑是特異性結(jié)合人RSP01、RSP02和/或RSP03的抗體。本發(fā)明還提供通過(guò)對(duì)具有腫瘤的受試對(duì)象施用所述RSPO-結(jié)合劑而抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明還提供通過(guò)對(duì)有需要的受試對(duì)象施用所述RSPO-結(jié)合劑而治療癌的方法。在一些實(shí)施方式中，治療癌或抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法包括用所述RSPO-結(jié)合劑靶向癌干細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括減少腫瘤中癌干細(xì)胞的頻率、減少腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量、減少腫瘤的致瘤性(tumorigenicity)和/或通過(guò)減少腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量或頻率來(lái)減少腫瘤的致瘤性。
[0012]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供諸如抗體等特異性結(jié)合人RSPOl的結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑在人RSPOl的21~263位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑在人RSPOl的34~135位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑在人RSPOl的91~135位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑(例如抗體)特異性結(jié)合選自由RSP02、RSP03和RSP04組成的組中的至少一種其他人RSPO0在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑或抗體調(diào)節(jié)β-連環(huán)素活性，是β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑，抑制β_連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)和/或抑制β_連環(huán)素的激活。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑抑制RSPOl信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑抑制或干擾RSPOl與一種或多種LGR蛋白(例如LGR4、LGR5和/或LGR6)的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑抑制RSPOl與LGR5的結(jié)合。
[0013]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供諸如抗體等特異性結(jié)合人RSP02的結(jié)合劑。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合 劑在人RSP02的22~243位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑在人RSP02的22~205位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑在人RSP02的34~134位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑在人RSP02的90~134位氨基酸內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑(例如抗體)特異性結(jié)合選自由RSPOl、RSP03和RSP04組成的組中的至少一種其他人RSP0。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑或抗體調(diào)節(jié)β-連環(huán)素活性，是β_連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑，抑制β_連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)和/或抑制β_連環(huán)素的激活。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑抑制RSP02信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑抑制或干擾RSP02與一種或多種LGR蛋白(例如LGR4、LGR5和/或LGR6)的結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑抑制RSP02與LGR5的結(jié)合。
[0014]在各個(gè)上述方面和實(shí)施方式中的一些實(shí)施方式以及本文所述的其他方面和實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是人源化抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合人RSPOl。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合人RSPOl和小鼠RSPOl。在一些實(shí)施方式中，所述抗體以小于InM的Kd結(jié)合人RSPOl和以小于InM的Kd結(jié)合小鼠RSPOl。
[0015]在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑是抗體，所述抗體含有包含TGYTMH (SEQID NO: 12)的重鏈 CDRl、包含 GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO: 13)的重鏈 CDR2 和包含KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO: 14)的重鏈⑶R3。在一些實(shí)施方式中，所述抗體還含有包含KASQDVIFAVA (SEQ ID NO: 15)的輕鏈 CDR1、包含 WASTRHT (SEQ ID NO: 16)的輕鏈 CDR2 和包含QQHYSTPff (SEQ ID NO: 17)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑是抗體，所述抗體含有包含 KASQDVIFAVA (SEQ ID NO: 15)的輕鏈 CDRl、包含 WASTRHT (SEQ ID NO: 16)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTPW(SEQ ID NO: 17)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑是抗體，所述抗體含有:(a)包含TGYTMH(SEQ ID NO: 12)的重鏈CDR1，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；(b)包含GINPNNGGTTYNQNFKG (SEQ ID NO: 13)的重鏈CDR2，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；(c)包含KEFSDGYYFFAY (SEQ ID NO: 14)的重鏈CDR3，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；(d)包含KASQDVIFAVA (SEQ ID NO: 15)的輕鏈CDRl，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；(e)包含WASTRHT (SEQ ID NO: 16)的輕鏈⑶R2，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；和(f)包含QQHYSTPW(SEQ IDNO: 17)的輕鏈⑶R3，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體。在一些實(shí)施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。
[0016]在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ IDNO: 10具有至少80%序列同一性的重鏈可變區(qū)和/或(b)與SEQ ID NO: 11具有至少80%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ ID NO: 10具有至少90%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQ ID NO: 11具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
[0017]在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ IDNO: 55具有至少80%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQ ID NO: 59具有至少80%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ ID NO: 55具有至少90%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQ ID NO: 59具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
[0018]在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑是單克隆抗體89M5，由在2011年6月30日保藏的ATCC保藏號(hào)為PTA-11970的雜交瘤細(xì)胞系89M5產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑是抗體89M5的人源化形式。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑是人源化單克隆抗體h89M5-H2L2。
[0019]在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑是結(jié)合人RSP02的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合人RSP02和小鼠RSP02。在一些實(shí)施方式中，所述抗體含有包含SSYAMS(SEQ ID NO:29)的重鏈 CDR1、包含 SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:30)的重鏈 CDR2和包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY (SEQ ID NO: 31)的重鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述抗體還含有包含 KASQDVSSAVA (SEQ ID NO:32)的輕鏈 CDRl、包含 WASTRHT (SEQ ID NO: 33)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTP (SEQ ID NO: 34)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑是抗體，所述抗體含有包含KASQDVSSAVA (SEQ ID NO:32)的輕鏈CDRl、包含WASTRHT (SEQ IDNO:33)的輕鏈CDR2和包含QQHYSTP (SEQ ID NO:34)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑是抗體，所述抗體含有:(a)包含SSYAMS (SEQ ID NO: 29)的重鏈CDRl，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；(b)包含SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO: 30)的重鏈CDR2，或者其包含 1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；(c)包含RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQID N0:31)的重鏈⑶R3，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；(d)包含KASQDVSSAVA (SEQ ID NO:32)的輕鏈CDRl，或者包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的其變體；(e)包含WASTRHT (SEQ ID NO:33)的輕鏈CDR2，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體；和(f)包含QQHYSTP (SEQ ID NO: 34)的輕鏈CDR3，或者其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體。在一些實(shí)施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。[0020]在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ IDNO: 27具有至少80%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQ ID NO: 28具有至少80%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ ID NO: 27具有至少90%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQ ID NO: 28具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
[0021]在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ IDNO:63具有至少80%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQ ID NO:67具有至少80%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ ID NO:63具有至少90%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQ ID NO:67具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
[0022]在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ IDNO:63具有至少80%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQ ID NO: 76具有至少80%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑是抗體，所述抗體包含:(a)與SEQ ID NO:63具有至少90%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或(b)與SEQ ID NO: 76具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
[0023]在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑是單克隆抗體130M23，由在2011年8月10日保藏的ATCC保藏號(hào)為PTA-12021的雜交瘤細(xì)胞系130M23產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑是抗體130M23的人源化形式。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑是人源化單克隆抗體hl30M23-HlL2。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑是人源化單克隆抗體 hl30M23-HlL6。
[0024]在另一方面，本發(fā)明提 供與本發(fā)明的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSPO蛋白的特異性結(jié)合的結(jié)合劑(例如抗體)。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑(例如抗體)與含有包含SEQ ID NO: 10的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO: 11的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSPOl的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑(例如抗體)與含有包含SEQ ID NO:55的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO: 59的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSPOl的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，與所述RSPOl-結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)的抗體是89M5或h89M5_H2L2。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑在體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)中與本發(fā)明的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPOl的特異性結(jié)合。
[0025]在一些實(shí)施方式中，所述抗體與本發(fā)明的抗體(例如89M5)所結(jié)合的RSPOl上的表位相同或基本上相同。
[0026]在又一方面，所述結(jié)合劑是抗體，所述抗體結(jié)合的RSPOl上的表位與本發(fā)明的抗體(例如89M5)結(jié)合的RSPOl上的表位重疊。
[0027]在另一方面，本發(fā)明提供與本發(fā)明的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSP02的特異性結(jié)合的結(jié)合劑(例如抗體)。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑(例如抗體)與含有包含SEQ ID NO: 27的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO: 28的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSP02的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑(例如抗體)與含有包含SEQ ID NO:63的重鏈可變區(qū)和包含SEQID NO:67的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSP02的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑(例如抗體)與含有包含SEQ ID NO:63的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO: 76的輕鏈可變區(qū)的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSP02的特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，與所述RSP02-結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)的抗體是130M23、hl30M23-HlL2或hl30M23-HlL6。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑在體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)中與本發(fā)明的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSP02的特異性結(jié)合。
[0028]在一些實(shí)施方式中，所述抗體與本發(fā)明的抗體(例如89M5)所結(jié)合的RSP02上的表位相同或基本上相同。
[0029]在又一方面，所述結(jié)合劑是抗體，所述抗體結(jié)合的RSP02上的表位與本發(fā)明的抗體(例如130M23)結(jié)合的RSP02上的表位重疊。
[0030]在各個(gè)上述方面以及本文別處描述的其他方面和/或和實(shí)施方式中的一些實(shí)施方式中，RSPO-結(jié)合劑或抗體是分離的。
[0031]在另一方面，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO: 10和/或SEQ ID NO: 11的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO: 55和/或SEQ ID NO: 59的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供包含SEQ IDN0:27和/或SEQ ID NO:28的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO:63和/或SEQ ID NO:67的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO:63和/或SEQ ID NO: 76的多肽。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合RSPOl的多肽含有包含SEQ ID NO: 25和/或SEQ ID NO: 26的多肽。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合RSPOl的多肽含有包含SEQ ID NO: 68和/或SEQ ID NO: 69的多肽。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合RSP02的多肽含有包含SEQ ID NO: 41和/或SEQ ID NO: 42的多肽。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合RSP02的多肽含有包含SEQ ID NO: 70和/或SEQ ID NO: 71的多肽。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合RSP02的多肽含有包含SEQ ID NO: 70和/或SEQ ID NO: 74的多肽。在一些實(shí)施方式中，所述多肽是分離的。在一些實(shí)施方式中，所述多肽基本上是純的。在一些實(shí)施 方式中，所述多肽是抗體。
[0032]在另一方面，本發(fā)明提供分離的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含編碼各個(gè)上述方面以及本文描述的其他方面和/或?qū)嵤┓绞降目贵w和/或多肽。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含選自由 SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:58組成的組中的序列。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸包含選自由 SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQID NO: 60、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 72 和 SEQ ID NO: 75 組成的組中的序列。本發(fā)明還提供包含所述多核苷酸的表達(dá)載體以及包含所述表達(dá)載體和/或多核苷酸的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是雜交瘤細(xì)胞系。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是ATCC保藏號(hào)為PTA-11970的雜交瘤細(xì)胞系。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是ATCC保藏號(hào)為PTA-12021的雜交瘤細(xì)胞系。
[0033]在其他方面，本發(fā)明提供抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括使所述腫瘤與有效量的RSPO-結(jié)合劑或抗體(包括本文描述的每種RSPO-結(jié)合劑或抗體)接觸。
[0034]在另一方面，本發(fā)明提供抑制受試對(duì)象中腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑或抗體(包括本文描述的每種RSPO-結(jié)合劑或抗體)。
[0035]在另一方面，本發(fā)明提供抑制細(xì)胞中β_連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的方法，所述方法包括使所述腫瘤與有效量的RSPO-結(jié)合劑或抗體(包括本文描述的每種RSPO-結(jié)合劑或抗體)接觸。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是結(jié)直腸瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是卵巢瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是胰腺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤是肺瘤。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)的RSPO蛋白中的至少一種的水平升高。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)的RSPOl水平升高。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)的RSP02水平升高。在一些實(shí)施方式中，所述腫瘤表達(dá)的RSP03水平升高。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑例如通過(guò)減少腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量和/或頻率而抑制腫瘤生長(zhǎng)。
[0036]在另一方面，本發(fā)明提供治療受試對(duì)象中的癌的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括對(duì)受試對(duì)象施用治療有效量的上述RSPO-結(jié)合劑或抗體以及本文別處描述的RSPO-結(jié)合劑或抗體中的任一種。在一些實(shí)施方式中，所述癌是胰腺癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是結(jié)直腸癌。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)直腸癌包含在腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)基因中的失活突變。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)直腸癌不包含所述APC基因中的失活突變。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)直腸癌包含野生型APC基因。在一些實(shí)施方式中，所述癌是卵巢癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是乳腺癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是肺癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌表達(dá)的至少一種RSPO蛋白的水平升高。在一些實(shí)施方式中，所述癌是表達(dá)升高水平的RSPOl的卵巢癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是表達(dá)升高水平的RSP02的結(jié)腸癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是表達(dá)升高水平的RSP02的胰腺癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是表達(dá)升高水平的RSP02的乳腺癌。在一些實(shí)施方式中，所述癌是表達(dá)升高水平的RSP02的肺癌。
[0037]在另一方面，本發(fā)明提供治療受試對(duì)象中疾病的方法，其中所述疾病與連環(huán)素的激活和/或異常的β_連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，所述方法包括施用治療有效量的RSPO-結(jié)合劑或抗體(包括本文所述的每種RSPO-結(jié)合劑或抗體)。
[0038]在各個(gè)上述方面以及本文別處描述的其他方面和/或?qū)嵤┓绞街械囊恍?shí)施方式中，所述治療方法包括將RSPO-結(jié)合劑與至少一種另外的治療劑組合施用。在一些實(shí)施方式中，所述治療 方法包括將RSPOl-結(jié)合劑與諸如RSP02-結(jié)合劑、RSP03-結(jié)合劑和/或RSP04-結(jié)合劑等第二 RSPO-結(jié)合劑組合施用。在一些實(shí)施方式中，所述治療方法包括將RSP02-結(jié)合劑與諸如RSPOl-結(jié)合劑、RSP03-結(jié)合劑和/或RSP04-結(jié)合劑等第二 RSPO-結(jié)合劑組合施用。在一些實(shí)施方式中，所述治療方法包括將RSPOl-結(jié)合劑與RSP02-結(jié)合劑組合施用。在一些實(shí)施方式中，所述治療方法包括施用RSPOl-結(jié)合劑、RSP02-結(jié)合劑和化學(xué)治療劑的組合。
[0039]在各個(gè)上述方面以及本文別處描述的其他方面和/或?qū)嵤┓绞街械囊恍?shí)施方式中，所述治療方法還包括確定所述腫瘤或癌中至少一種RSPO蛋白的水平的步驟。
[0040]在另一方面，本發(fā)明提供鑒定人受試對(duì)象或選擇人受試對(duì)象以用RSPO-結(jié)合劑或抗體(包括但不限于本文描述的每種RSPO-結(jié)合劑或抗體)進(jìn)行治療的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括確定所述受試對(duì)象是否具有腫瘤，所述腫瘤具有的特定RSPO(例如RSPOl或RSP02)的表達(dá)水平與正常組織中相同的RSPO蛋白的表達(dá)相比升高。在一些實(shí)施方式中，如果所述腫瘤具有升高的RSPO表達(dá)水平，則所述方法包括鑒定治療用受試對(duì)象或選擇治療用受試對(duì)象。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括確定所述受試對(duì)象是否具有包含APC基因中的失活突變的腫瘤。在一些實(shí)施方式中，如果所述腫瘤具有APC基因中的失活突變，則所述方法包括鑒定治療的受試對(duì)象或選擇治療的受試對(duì)象。
[0041]還提供了包含本文所述的RSPO-結(jié)合劑或抗體以及藥學(xué)上可接受的載劑的藥物組合物，以及產(chǎn)生所述RSPO-結(jié)合劑的細(xì)胞系。還提供了治療受試對(duì)象(例如人)中的癌和/或抑制受試對(duì)象(例如人)中的腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用有效量的包含所述RSPO-結(jié)合劑的組合物。
[0042]如果本發(fā)明的方面或?qū)嵤┓绞礁鶕?jù)馬庫(kù)什分組或其他替代分組進(jìn)行描述，則本發(fā)明不僅涵蓋了作為整體列出的整個(gè)組，還單獨(dú)涵蓋了所述組的每個(gè)成員以及主要組的所有可能的亞組，還涵蓋了缺少一個(gè)或多個(gè)組成員的主要組。本發(fā)明還設(shè)想明確排除了在所要求保護(hù)的發(fā)明中的任意一個(gè)或多個(gè)組成員。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0043]圖1.腫瘤和正常組織中的RSPO表達(dá)。顯示了來(lái)自正常組織人樣品、良性組織人樣品和惡性組織人樣品的微陣列數(shù)據(jù)的總結(jié)。各個(gè)刻度標(biāo)記(tick mark)表示RSPOmRNA的表達(dá)水平。A) RSP01B) RSP02C) RSP03
[0044]圖2.RSPO蛋白和LGR5的結(jié)合研究。表達(dá)LGR5的HEK-293細(xì)胞的FACS分析。將HEK-293細(xì)胞用編碼FLAG-LGR5-CD4TM-GFP的cDNA表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，然后與可溶性RSPOl-Fc, RSP02-Fc、RSP03_Fc或RSP04_Fc融合蛋白混合。使用抗FLAG抗體作為陽(yáng)性對(duì)照，使用可溶性FZD8-FC作為陰性對(duì)照。通過(guò)在各個(gè)FACS圖上的黑線框重疊區(qū)(dark linedbox overlay)內(nèi)信號(hào)的存在表示特異性結(jié)合。
[0045]圖3.肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基中抑制活性的鑒定。使用6xTCF_熒光素酶報(bào)告基因檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定HEK-293細(xì)胞中的β -連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。在可溶性LGR5-FC的存在下使ΗΕΚ-293細(xì)胞暴露至含有Wnt3a L細(xì)胞條件培養(yǎng)基的對(duì)照培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)或含有肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基和Wnt3a L細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基。使用可溶性Jag-Fc和抗體LZl作為陰性對(duì)照。使用可溶性FZD8-FC和阻 斷Wnt3a的抗-FZD抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。以10 μ g/ml使用可溶性LGR5-Fc、Jag-Fc和FZD8_Fc融合蛋白。以40 μ g/ml使用抗-FZD抗體和LZl抗體。
[0046]圖4.β -連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的誘導(dǎo)的抑制。使用6xTCF_熒光素酶報(bào)告基因檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定ΗΕΚ-293細(xì)胞中的β -連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。在可溶性LGR5-FC在20 μ g/ml~0.02 μ g/ml的四倍稀釋液存在下，使HEK-293細(xì)胞暴露至含有10ng/ml RSP02和25%Wnt3a L細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基(“RSP02”)或含有25%肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基和25%Wnt3a L細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基(“LT”)；具有LGR5-FC的RSP02 (- □-)和具有LGR5_Fc (- -)的LT。具有RSP02 (_ Λ _)或LT (- ▲-)的20 μ g/ml的可溶性Jag-Fc用作陰性對(duì)照。具有RSP02 (- O _)或LT (-.-)的20 μ g/ml的阻斷Wnt3a的可溶性FZD8_Fc用作陽(yáng)性對(duì)照。
[0047]圖5.結(jié)合RSPOl的抗體的鑒定。A)融合蛋白FLAG-RSP01弗林蛋白酶-⑶4TM-GFP的圖示。B)所產(chǎn)生的針對(duì)人RSPOl的抗體的FACS分析。y軸顯示相對(duì)抗體結(jié)合,x軸表示FLAG-RSP01弗林蛋白酶-⑶4TM-GFP融合蛋白的表達(dá)。通過(guò)在各個(gè)FACS圖上的黑線框重疊區(qū)內(nèi)信號(hào)的存在表示陽(yáng)性結(jié)合。使用抗-FLAG抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。使用抗-PE抗體作為陰性對(duì)照。
[0048]圖6.抑制由RSPOl誘導(dǎo)的β -連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的抗-RSPOl抗體的鑒定。在濃度漸增的抗-RSPOl 抗體(89Μ2、89Μ4、89Μ5、89Μ7、89Μ19 或 89Μ25)或無(wú)關(guān)對(duì)照抗體(254Μ14或254Μ26)的存在下，在將ΗΕΚ-293細(xì)胞暴露至Wnt3a(5ng/ml)和RSPOl (10ng/ml)的組合后，使用TOPflash熒光素酶報(bào)告基因檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定所述HEK-293細(xì)胞中的β -連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)?？贵w以10 μ g/ml~0.625 μ g/ml范圍內(nèi)的2倍稀釋液使用。對(duì)照包括在不存在抗體時(shí)暴露至對(duì)照培養(yǎng)基(無(wú)fct3a和無(wú)RSP0)、單獨(dú)Wnt3a或者Wnt3a和RSPO的組合。[0049]圖7.阻斷RSP01/LGR5結(jié)合的抗-RSPOl抗體的鑒定。表達(dá)LGR5的HEK-293細(xì)胞的FACS分析。將HEK-293細(xì)胞用編碼FLAG-LGR5-⑶4TM-GFP的cDNA表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，然后與組合有各種抗-RSPOl抗體的可溶性RSPO1-Fc融合蛋白混合。用綴合有PE的抗人Fe 二抗檢測(cè)結(jié)合。y軸顯示相對(duì)RSPOl-Fc結(jié)合，x軸表示FLAG-LGR5-CD4TM-GFP融合蛋白的表達(dá)。通過(guò)在各個(gè)FACS圖上的黑線框重疊區(qū)內(nèi)信號(hào)的存在表示陽(yáng)性結(jié)合。使用抗-PE抗體作為陰性對(duì)照。
[0050]圖8.用抗-RSPOl抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。將0V19卵巢瘤細(xì)胞皮下注入N0D/SCID小
鼠中。用89M5 (-.-)、89M25 (-▼-)、紫杉醇(-?-)、抗體89M5和紫杉醇的組合(_〇_)、
抗體89M25和紫杉醇的組合(_ □-)或者對(duì)照抗體1B7.11 (- -)治療小鼠。數(shù)據(jù)顯示為治療后天數(shù)與腫瘤體積(mm3)。
[0051]圖9.抗-RSPOl抗體的表位作圖。A)含有RSPOl結(jié)構(gòu)域的缺失系列的所構(gòu)建的融合蛋白的圖。這些構(gòu)建體都包含允許所述蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)的CD4TM結(jié)構(gòu)域。B)抗-RSPOl抗體與用所述融合蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合的FACS分析。y軸顯示相對(duì)抗體結(jié)合，X軸表示所述融合蛋白的表達(dá)。使用抗-FLAG抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。使用抗-PE抗體作為陰性對(duì)照。
[0052]圖10.結(jié)合RSP02的抗體的鑒定。所產(chǎn)生的針對(duì)人RSP02的抗體的FACS分析。y軸顯示相對(duì)抗體結(jié)合，X軸表示FLAG-RSP02弗林蛋白酶-⑶4TM-GFP融合蛋白的表達(dá)。使用抗-FLAG抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。使用抗-PE抗體作為陰性對(duì)照。 [0053]圖11.抑制RSP02誘導(dǎo)β -連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的抗-RSP02抗體的鑒定。在針對(duì)RSP02 的抗體(mAbsl30M23、130M24、130M25、130M26、130M27 和 130M28)的存在下，在將HEK-293 細(xì)胞暴露至 Wnt3a(5ng/ml)和人 RSP02 (10ng/ml)的組合或 Wnt3a (5ng/ml)和人RSP03 (10ng/ml)的組合后，使用TOPflash熒光素酶報(bào)告基因檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定所述HEK-293細(xì)胞中的β_連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。對(duì)照包括在不存在抗體時(shí)暴露至對(duì)照培養(yǎng)基(不添加fct3a和沒(méi)有RSPO標(biāo)記的“細(xì)胞”)、單獨(dú)Wnt3a (經(jīng)標(biāo)記的“W3A” )或者Wnt3a和RSPO的組合。
[0054]圖12.阻斷RSP02/LGR5結(jié)合的抗-RSP02抗體的鑒定。表達(dá)LGR5的HEK-293細(xì)胞的FACS分析。將HEK-293細(xì)胞用編碼FLAG-LGR5-CD4TM-GFP的cDNA表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，然后與組合有各種抗-RSP02抗體的可溶性RSP02-FC融合蛋白混合。用綴合有PE的抗人Fe 二抗檢測(cè)結(jié)合。y軸顯示相對(duì)RSP02-FC結(jié)合，x軸表示FLAG-LGR5-CD4TM-GFP融合蛋白的表達(dá)。通過(guò)在各個(gè)FACS圖上的黑線框重疊區(qū)內(nèi)信號(hào)的存在表示陽(yáng)性結(jié)合。使用抗FLAG抗體作為陽(yáng)性對(duì)照，使用抗-PE抗體作為陰性對(duì)照。
[0055]圖13.腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基中抑制活性的鑒定。在可溶性LGR5-Fc、FZD8-Fc或?qū)φ杖诤螰e蛋白的存在下，將STF-293細(xì)胞暴露至對(duì)照培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)、含有Wnt3aL細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基、含有腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基或含有腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基和Wnt3a L細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基。以10 μ g/ml使用可溶性LGR5_Fc、FZD8_Fc和對(duì)照-Fe融合蛋白。從肺瘤LU2 (圖13A)、肺瘤LU25 (圖13B)和卵巢瘤0V38 (圖13C)制備腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
[0056]圖14.β -連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的誘導(dǎo)的抑制。使STF-293與LU2細(xì)胞和25%的肺瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基以及25%Wnt3a-L細(xì)胞條件培養(yǎng)基一起溫育。將抗體130M23(- -)和可溶性LGR5-FC (-.-)以50 μ g/ml~0.0006 μ g/ml范圍內(nèi)的5倍連續(xù)稀釋液添加至所述細(xì)胞。使用經(jīng)過(guò)類(lèi)似稀釋的無(wú)關(guān)單克隆抗體(-□-)和對(duì)照Fe融合蛋白(-Δ -，50 μ g/ml)作為陰性對(duì)照。
[0057]圖15.用抗-RSPO抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。將PN31胰腺瘤細(xì)胞皮下注入N0D/SCID小鼠中。用抗-RSPOl 抗體 89M5(- □-)、抗-RSP02 抗體 130M23(- ▲ _)、吉西他濱(二_)、
抗體89M5和吉西他濱的組合'(-▼-)、抗體130M23和吉西他濱的組合(_ O _)或?qū)φ湛贵w
1B7.11 (-O-)治療小鼠。數(shù)據(jù)顯示為植入后天數(shù)與腫瘤體積(mm3)。
[0058]圖16.用抗-RSPO抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。將PN7胰腺瘤細(xì)胞皮下注入N0D/SCID小鼠中。用抗-RSP02 抗體 130M23 (-▼->、抗-FZD 抗體 18R5 (-▲-)、吉西他濱(_._)、130M23 和
18R5的組合(-〇-)、130M23和吉西他濱的組合(_□_)、18R5和吉西他濱的組合(_ Λ _)、130M23U8R5和吉西他濱的組合(_ O _)或?qū)φ湛贵w1Β7.11(- -)治療小鼠。數(shù)據(jù)顯示為治療后天數(shù)與腫瘤體積(mm3)(圖16A)。用Wnt途徑抑制劑FZD8_Fc和吉西他濱的組合(-Δ -)、130M23和吉西他濱的組合(_▼-)、130M23、FZD8-Fc和吉西他濱的組合(_?_)、吉西他濱(_.-)或?qū)φ湛贵w1B7.11 (_ _)治療小鼠。數(shù)據(jù)顯示為治療后天數(shù)的腫瘤體積(mm3)(圖16B)。將所得到的腫瘤處理成單細(xì)胞懸浮液，并連續(xù)移植到小鼠中。將獲自每個(gè)治療組的90個(gè)腫瘤細(xì)胞皮下注入N0D/SCID小鼠中。在不進(jìn)行治療時(shí)使腫瘤生長(zhǎng)。數(shù)據(jù)顯示為第40天的腫瘤體積(mm3)(圖16C)。
[0059]圖17.人源化RSPO抗體的FACS分析。A)人源化89M5抗體(h89M5_H2L2)和親本89M5抗體的FACS分析。測(cè)試每種抗體的5倍連續(xù)稀釋液。y軸顯示相對(duì)抗體結(jié)合，X軸表示FLAG-RSP01弗林蛋白酶-⑶4TM-GFP融合蛋白的表達(dá)。B)人源化130M23抗體(hl30M23-HlL2)和親本130M23抗體的FACS分析。測(cè)試每種抗體的5倍連續(xù)稀釋液。y軸顯示相對(duì)抗體結(jié)合，X軸表示FLAG-RSP02弗林蛋白酶-⑶4TM-GFP融合蛋白的表達(dá)。
[0060]圖18.用抗-RSPOl和抗-RSP02抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。將B39三重陰性(triplenegative)乳腺癌腫瘤細(xì)胞皮下注入N0D/SCID小鼠中。用抗-RSPOl抗體89M5和
抗-RSP02抗體130M23的組合(-O _)、順鉬(-▼-)、89M5U30M23和順鉬的組合(-.-)或
對(duì)照抗體1B7.11(--)治療小鼠。數(shù)據(jù)顯示為治療后天數(shù)的腫瘤體積(_3)。
【具體實(shí)施方式】
[0061]本發(fā)明提供結(jié)合RSPO蛋白(例如人RSP01、RSP02和/或RSP03)的新型試劑，包括但不限于多肽，例如抗體。所述RSPO-結(jié)合劑包括β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑。還提供了相關(guān)多肽和多核苷酸、包含所述RSPO-結(jié)合劑的組合物以及制造所述RSPO-結(jié)合劑的方法。進(jìn)一步提供了使用上述新型RSPO-結(jié)合劑的方法，例如抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法、治療癌的方法、減少癌干細(xì)胞在腫瘤中的頻率的方法、抑制β -連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的方法和/或鑒定和/或選擇治療用受試對(duì)象的方法。
[0062]已經(jīng)鑒定出特異性結(jié)合人RSPOl的單克隆抗體:單克隆抗體89Μ2、89Μ4、89Μ5、89Μ7、89Μ19 和 89Μ25 (實(shí)施例 5、圖 5)?？?RSPOl 抗體 89Μ2、89Μ4、89Μ5 和 89Μ25 抑制 β -連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)(實(shí)施例6、圖6)。抗-RSPOl抗體89Μ2、89Μ4、89Μ5和89Μ25阻斷可溶性RSPOl與LGR5的結(jié)合(實(shí)施例7、圖7)。隨后，序列數(shù)據(jù)證明抗體89Μ2、89Μ4、89Μ5和89Μ25含有相同的重鏈和輕鏈可變區(qū)，并且據(jù)推斷這些抗體會(huì)包含相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)?？?RSPOl抗體89M4、89M5、89M7和89M25對(duì)人和小鼠RSPOl的結(jié)合親和性都小于0.1nM(實(shí)施例8)。產(chǎn)生了 89M5的人源化版本h89M5-H2L2 (實(shí)施例19)，其對(duì)人RSPOl的結(jié)合親和性小于0.1nM(實(shí)施例20)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗-RSPOl抗體89M5和89M25在卵巢瘤異種移植物模型中作為單獨(dú)的試劑和與化學(xué)治療劑組合在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(實(shí)施例9、圖8)?？?RSPOl抗體89M5顯示在胰腺瘤異種移植物模型中與化學(xué)治療劑組合在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(實(shí)施例17、圖15)。初步的表位作圖研究表明，抗-RSPOl抗體89M5的結(jié)合位點(diǎn)涉及RSPOl的弗林蛋白酶2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸(實(shí)施例10、圖9)。
[0063]此外，已經(jīng)鑒定出特異性結(jié)合人RSP02的單克隆抗體:單克隆抗體130M23、130M24、130M25、130M26、130M27 和 130M28(實(shí)施例 11、圖 10)?？?RSP02 抗體 130M23、130M24、130M25、130M26、130M27和130M28據(jù)顯示會(huì)減少或完全阻斷β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)(實(shí)施例12、圖11)。抗-RSP02抗體130Μ23和130Μ24阻斷可溶性RSP02與LGR5的結(jié)合(實(shí)施例13、圖12)?？?RSP02抗體130Μ23對(duì)人RSP02的結(jié)合親和性為0.14ηΜ，對(duì)小鼠RSP02的結(jié)合親和性為0.35ηΜ(實(shí)施例15)。產(chǎn)生了 130Μ23的人源化版本hl30M23_HlL2和hl30M23-HlL6 (實(shí)施例19)。抗-RSP02抗體hl30M23_HlL2對(duì)人RSP02的結(jié)合親和性為0.13nM, hl30M23-HlL6對(duì)人RSP02的結(jié)合親和性為0.15nM(實(shí)施例20)。抗-RSP02抗體130M23顯示在胰腺瘤異種移植物模型中作為單獨(dú)試劑和與另外的化學(xué)治療劑組合在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(實(shí)施例17和18、圖15和16)。
[0064]1.定義
[0065]為了便于理解本發(fā)明，將許多術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)如下定義。
[0066]本文所用的術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”和“拮抗的”是指任何部分或完全阻斷、抑制、減少或中和靶標(biāo)和/或信號(hào)傳導(dǎo)途徑(例如，β_連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo))的分子。本文使用術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”來(lái)包括任何部分或完全阻斷、抑制、減少或中和蛋白質(zhì)的活性(例如，RSPO蛋白)的分子。合適的拮抗劑分子具體包括但不限于拮抗性抗體或抗體片段。
[0067]本文使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”和“調(diào)整”是指生物活性的改變或變化。調(diào)節(jié)包括但不限于刺激或抑制活性。調(diào)節(jié)可以是活性的增加或降低(例如RSPO信號(hào)傳導(dǎo)的降低、β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的降低)、結(jié)合特性的改變、或者與蛋白活性、途徑或其他所關(guān)注生物點(diǎn)有關(guān)的生物、功能或免疫性質(zhì)上的任何其他改變。
[0068]本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指免疫球蛋白分子，其通過(guò)免疫球蛋白分子的可變區(qū)內(nèi)的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別和特異性結(jié)合靶標(biāo)，例如蛋白質(zhì)、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)或者前述的組合。如本文所述，該術(shù)語(yǔ)涵蓋了完整的多克隆抗體、完整的單克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab’、F (ab') 2和Fv片段)、單鏈Fv(scFv)抗體、多特異性抗體(例如由至少兩個(gè)完整抗體產(chǎn)生的雙特異性抗體)、單特異性抗體、單價(jià)抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、包含抗體的抗原決定部分的融合蛋白和包含抗原識(shí)別位點(diǎn)的任何其他經(jīng)修飾免疫球蛋白分子，只要該抗體展現(xiàn)所需的生物活性即可?；诜謩e稱(chēng)為α、δ、ε、Y和μ的抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，抗體可以是免疫球蛋白的五個(gè)主要類(lèi)別中的任一個(gè):IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM，或者其亞類(lèi)(同種型)(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)。不同類(lèi)別的免疫球蛋 白具有不同且公知的亞基結(jié)構(gòu)以及三維構(gòu)型?？贵w可以是裸露的，或綴合至其他分子，包括但不限于毒素和放射性同位素。
[0069]術(shù)語(yǔ)“抗體片段”是指完整抗體的一部分，并且是指完整抗體的抗原決定可變區(qū)。抗體片段的實(shí)例包括但不限于Fab、Fab’、F (ab’)2和Fv片段、線性抗體、單鏈抗體以及由抗體片段形成的多特異性抗體。本文使用的“抗體片段”包括抗原結(jié)合位點(diǎn)或表位結(jié)合位點(diǎn)。
[0070]術(shù)語(yǔ)抗體的“可變區(qū)”是指抗體輕鏈的可變區(qū)和/或抗體重鏈的可變區(qū)。重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自由通過(guò)三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(也稱(chēng)為“超變區(qū)”)連接的四個(gè)框架區(qū)(FR)組成。各鏈中的CDR通過(guò)框架區(qū)而保持得相互靠近，并與來(lái)自其他鏈的CDR —起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成。確定CDR的技術(shù)至少有兩種技術(shù):(I)基于交叉物種序列可變性的方法(即，Kabat 等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5 版，National Institutes of Health, Bethesda MD)和(2)基于抗原-抗體復(fù)合物的晶體研究的方法(Al-Lazikani等，1997，J.Mol.Biol.，273:927-948)。此外，本領(lǐng)域有時(shí)使用這兩種方法的組合來(lái)確定CDR。
[0071]本文使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指參與高特異性識(shí)別和結(jié)合單一抗原決定簇或表位的均勻抗體群體。這與多克隆抗體相反，多克隆抗體通常包括針對(duì)不同抗原決定簇的不同抗體的混合物。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”涵蓋了完整和全長(zhǎng)單克隆抗體以及抗體片段(例如，F(xiàn)ab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(scFv)抗體、包含抗體部分的融合蛋白和包含抗原識(shí)別位點(diǎn)(抗原結(jié)合位點(diǎn))的任何其他經(jīng)修飾免疫球蛋白分子。此外，“單克隆抗體”是指通過(guò)任意數(shù)量的技術(shù)制造的此類(lèi)抗體，所述技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)、噬菌體選擇、重組表達(dá)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
[0072]本文使用的術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指非人(例如鼠類(lèi))抗體的形式，其是特異性的免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其含有最小非人序列的片段。通常，人源化抗體是其中CDR殘基被具有所需特異性、親和性和/或結(jié)合能力的非人物種(例如小鼠、大鼠、兔或倉(cāng)鼠)的⑶R殘基替換的 人免疫球蛋白(Jones等，1986，Nature, 321:522-525; Riechmann等，1988，Nature, 332:323-327; Verhoeyen 等，1988，Science, 239:1534-1536)。在某些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)殘基被來(lái)自具有所需特異性、親和性和/或結(jié)合能力的非人物種的抗體中的相應(yīng)殘基替換。人源化抗體可以通過(guò)Fv框架區(qū)中和/或所替換的非人殘基中的另外殘基的取代而被進(jìn)一步修飾，從而改善和優(yōu)化抗體特異性、親和性和/或結(jié)合能力。通常，人源化抗體會(huì)包含至少一個(gè)、通常2個(gè)或3個(gè)含有所有或基本上所有對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR的可變結(jié)構(gòu)域，但所有或基本上所有的框架區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的框架區(qū)。人源化抗體還可以包括免疫球蛋白恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(Fe)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(Fe)的至少一部分。用于生成人源化抗體的方法的實(shí)例描述于例如美國(guó)專(zhuān)利5，225，539。
[0073]本文使用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”是指由人產(chǎn)生的抗體，或者具有對(duì)應(yīng)于使用任何本領(lǐng)域已知的技術(shù)制造的由人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列的抗體。人抗體的該定義特別排除了包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。
[0074]本文使用的術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自?xún)煞N以上物種的抗體。通常，輕鏈和重鏈的可變區(qū)對(duì)應(yīng)于源自一個(gè)具有所需特異性、親和性和/或結(jié)合能力的哺乳動(dòng)物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)，而恒定區(qū)與源自另一物種(通常為人)的抗體中的序列是同源的，以避免引起該物種中的免疫響應(yīng)。
[0075]文使用的短語(yǔ)“親和性成熟抗體”是指在其一個(gè)或多個(gè)CDR中具有一個(gè)或多個(gè)改變的抗體，所述改變導(dǎo)致與不擁有這些改變的親本抗體相比，該抗體與抗原的親和性得到改善。優(yōu)選的親和性成熟抗體會(huì)對(duì)靶抗原具有納摩爾甚至皮摩爾的親和性。親和性成熟抗體通過(guò)本領(lǐng)域已知的步驟產(chǎn)生。例如，Marks等，1992，Bio/TechnologylO:779-783中描述了通過(guò)VH和VL結(jié)構(gòu)域重排產(chǎn)生的親和性成熟。Barbas等，1994，PNAS, 91:3809-3813;Schier 等,1995, Gene, 169:147-155;Yelton 等，1995，J.1mmunol.155:1994-2004;Jackson 等，1995，J.1mmunol.，154:3310-9 ;和 Hawkins等，1992，J.Mol.Biol., 226:889-896中描述了 CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變。
[0076]術(shù)語(yǔ)“表位”和“抗原決定簇”在本文可以相互替換地使用，并且是指抗原的能夠被特定抗體識(shí)別和特異性結(jié)合的部分。當(dāng)抗原是多肽時(shí)，表位可以由相鄰的氨基酸以及通過(guò)蛋白質(zhì)的三維折疊而并排的非相鄰氨基酸形成。由相鄰氨基酸形成的表位(也稱(chēng)為線性表位)通常在蛋白質(zhì)變性時(shí)保留，而由三維折疊形成的表位(也稱(chēng)為構(gòu)象表位)通常在蛋白質(zhì)變性時(shí)丟失。表位通常在獨(dú)特的空間構(gòu)象中包括至少3個(gè)、更經(jīng)常至少5個(gè)或8~10個(gè)氨基酸。
[0077]術(shù)語(yǔ)“選擇性結(jié)合”或“特異性結(jié)合”是指與替代物質(zhì)(包括不相關(guān)蛋白)相比，抗體與表位、蛋白質(zhì)或靶分子反應(yīng)或結(jié)合得更頻繁、更迅速、更持久、更具親和性或以上情況的一些組合。在一些實(shí)施方式中，“特異性結(jié)合”例如是指抗體與蛋白結(jié)合的Kd為約0.1mM以下，更通常小于約ΙμΜ。在一些實(shí)施方式中，“特異性結(jié)合”有時(shí)是指抗體與靶標(biāo)結(jié)合的Kd為至少約0.1 μ M以下，其他情況下是指為至少約0.01 μ M以下，另外的情況下為至少約InM以下。由于不同物種的同源蛋白之間的序列同一性，特異性結(jié)合可以包括在超過(guò)一個(gè)物種(例如人RSPOl和小鼠RSP01)中識(shí)別蛋白質(zhì)的抗體。類(lèi)似地，由于不同蛋白質(zhì)的多肽序列的特定區(qū)域內(nèi)的同源性，特異性結(jié)合可以包括識(shí)別超過(guò)一種蛋白質(zhì)(例如人RSPOl和人RSP02)的抗體(或其他多肽或結(jié)合劑)。應(yīng)該理解的是，在一些實(shí)施方式中，抗體或特異性結(jié)合第一靶標(biāo)的結(jié) 合部分可以或不可以特異性結(jié)合第二靶標(biāo)。因此，“特異性結(jié)合”不必然要求(但其包括)專(zhuān)一性結(jié)合(即與單一靶標(biāo)結(jié)合)。所以，在一些實(shí)施方式中，抗體可以特異性結(jié)合超過(guò)一種祀標(biāo)。在一些實(shí)施方式中，多種祀標(biāo)可以被抗體上的同一抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。例如，在一些情況下，抗體可以包括兩個(gè)相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合兩種以上蛋白質(zhì)(例如RSPOl和RSP02)上的相同表位。在一些替代實(shí)施方式中，抗體可以是雙特異性的或多特異性的，并且包含至少兩個(gè)具有不同特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。非限制性舉例而言，雙特異性抗體可以包括識(shí)別一種蛋白質(zhì)(例如人RSP01)上的表位的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，還包含第二個(gè)不同的識(shí)別第二蛋白質(zhì)上的不同表位的抗原結(jié)合位點(diǎn)。通常提到結(jié)合是指特異性結(jié)合，但并非必然如此。
[0078]術(shù)語(yǔ)“多肽”和“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可以相互替換地使用，并且是指任何長(zhǎng)度的氨基酸的聚合物。該聚合物可以是直鏈或支鏈的，其可以包含經(jīng)修飾氨基酸，并且其可以間插非氨基酸。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋了通過(guò)天然或干預(yù)而進(jìn)行修飾的聚合物，例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修飾，例如與標(biāo)記成分綴合。該定義中還涵蓋了例如含有氨基酸的一種或多種類(lèi)似物(包括例如非天然氨基酸)以及其他本領(lǐng)域已知的修飾的多肽。應(yīng)該理解的是，由于本發(fā)明的多肽可以基于抗體，在一些實(shí)施方式中，所述多肽可以作為單鏈或結(jié)合鏈出現(xiàn)。
[0079]術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”和“核酸”在本文可以相互替換地使用，是指任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核酸、核糖核酸、經(jīng)修飾核苷酸或堿基和/或他們的類(lèi)似物，或者可以通過(guò)DNA或RNA聚合酶引入聚合物中的任何物質(zhì)。
[0080]“高嚴(yán)謹(jǐn)條件”可以通過(guò)以下鑒定:(1)使用低離子強(qiáng)度和高溫以用于洗滌，例如500C的15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)雜交期間使用諸如甲酰胺等變性劑，例如42°C的具有0.1%胎牛血清白蛋白/0.l%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/pH6.5的50mM磷酸鈉緩沖液(帶750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉)的50%(v/v)甲酰胺；或(3)使用 420C 的 50% 甲酰胺、5 X SSC (0.75M NaCl, 75mM 檸檬酸鈉)、50mM 磷酸鈉(ρΗ6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5 X鄧哈特溶液(Denhardt’ s solution)、超聲處理的鮭魚(yú)精子DNA (50 μ g/ml)、0.1%SDS和10%右旋糖酐硫酸酯，在42°C的0.2 X SSC中洗滌，在55°C的50%甲酰胺中洗滌，然后在55 °C的由含有EDTA的0.1XSSC組成的高嚴(yán)謹(jǐn)洗滌液中洗滌。
[0081]在兩個(gè)以上核酸或多肽的背景下的術(shù)語(yǔ)“同一性”或百分比“同一性”，是指不考慮作為序列同一性的一部分的任何保守性氨基酸取代，當(dāng)就最大相應(yīng)性進(jìn)行比較和比對(duì)(必要時(shí)引入空位)時(shí)，兩個(gè)或更多個(gè)相同或的序列或亞序列、或所述序列或亞序列的特定百分比的核苷酸或氨基酸殘基是相同的?？梢允褂眯蛄斜容^軟件或算法或通過(guò)目視檢查測(cè)定百分比同一性?？捎糜讷@得氨基酸或核苷酸序列的比對(duì)的各種算法和軟件是本領(lǐng)域已知的。這些包括但不限于 LAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package 及其各種變體。如使用序列比較算法或通過(guò)目視檢查所測(cè)定的，當(dāng)就最大相應(yīng)性進(jìn)行比較和比對(duì)時(shí)，本發(fā)明的兩種核酸或多肽基本上具有同一性，這意味著他們具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、且在一些實(shí)施方式中至少95%、96%、97%、98%、99%核苷酸或氨基酸殘基同一性。在一些實(shí)施方式中，在長(zhǎng)度為至少約10個(gè)、至少約20個(gè)、至少約40-60個(gè)、至少約60-80個(gè)殘基或其間的任意整數(shù)值的序列區(qū)域上存在同一性。在一些實(shí)施方式中，在大于60-80個(gè)殘基的更長(zhǎng)區(qū)域(例如至少約80-100個(gè)殘基)上存在同一性，并且在一些實(shí)施方式中，序列在 所比較的序列(例如核苷酸序列的編碼序列)的全長(zhǎng)上基本上是相同的。
[0082]“保守性氨基酸取代”是其中一個(gè)氨基酸被具有相似側(cè)鏈的另一氨基酸替換的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已經(jīng)在本領(lǐng)域中定義，包括堿性側(cè)鏈(例如賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支鏈側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。優(yōu)選的是，本發(fā)明的多肽序列和抗體中的保守性取代不會(huì)消除含有上述氨基酸序列的多肽或抗體與抗原的結(jié)合，所述抗原即所述多肽或抗體所結(jié)合的一種或多種RSPO蛋白。鑒定不消除抗原結(jié)合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法是本領(lǐng)域公知的。
[0083]本文使用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指構(gòu)建體，其能夠遞送并且通常在宿主細(xì)胞中表達(dá)一種或多種目的基因或序列。載體的實(shí)例包括但不限于病毒載體、裸DNA或RNA表達(dá)載體、質(zhì)粒、粘粒或噬菌體載體、與陽(yáng)離子縮合劑連接的DNA或RNA表達(dá)載體和包封在脂質(zhì)體中的DNA或RNA表達(dá)載體。
[0084]“分離的”多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物是處于未見(jiàn)于自然界中的形式的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物。分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物包括已經(jīng)被純化至他們不再處于其見(jiàn)于自然界中的形式的程度的那些。在一些實(shí)施方式中，分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物是基本上純的。
[0085]本文使用的術(shù)語(yǔ)“基本上純”是指至少為50%純(純即無(wú)污染物)、至少為90%純、至少為95%純、至少為98%純或至少為99%純的材料。
[0086]本文使用的術(shù)語(yǔ)“癌”和“癌性的”是指或描述其中細(xì)胞群的特征在于不受控的細(xì)胞生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物中的生理?xiàng)l件。癌的實(shí)例包括但不限于上皮癌、母細(xì)胞瘤、肉瘤和血液癌(例如淋巴瘤和白血病)。
[0087]本文使用的術(shù)語(yǔ)“腫瘤”和“贅生物”是指由過(guò)度細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖(良性(非癌性)或惡性(癌性)，包括前癌損傷)引起的任何組織團(tuán)塊。
[0088]本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移”是指癌從起始位點(diǎn)擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移至身體的其他區(qū)域并在新位置發(fā)育有類(lèi)似的癌損傷的過(guò)程。“轉(zhuǎn)移”或“轉(zhuǎn)移性”細(xì)胞是喪失與鄰近細(xì)胞的粘附接觸、通過(guò)血流或淋巴從疾病的原發(fā)位點(diǎn)移動(dòng)從而入侵鄰近的身體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。
[0089]術(shù)語(yǔ)“癌干細(xì)胞”和“CSC”和“腫瘤干細(xì)胞”和“腫瘤起始細(xì)胞”在本文可以相互替換地使用，并且是指來(lái)自癌或腫瘤的如下細(xì)胞:(1)具有全面的增殖能力；2)能夠進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)細(xì)胞分裂以產(chǎn)生一種或多種分化細(xì)胞后裔，其中分化細(xì)胞具有減少的增殖或發(fā)育潛能；和(3)能夠進(jìn)行對(duì)稱(chēng)細(xì)胞 分裂以自我更新或自我維持。與不能形成腫瘤的大多數(shù)腫瘤細(xì)胞相比，這些性質(zhì)賦予癌干細(xì)胞在連續(xù)移植到免疫妥協(xié)的宿主(例如小鼠)時(shí)形成或建立腫瘤或癌的能力。癌干細(xì)胞以無(wú)序方式進(jìn)行自我更新和分化，從而形成具有異常細(xì)胞類(lèi)型的腫瘤，由于發(fā)生突變，所述異常細(xì)胞類(lèi)型能夠隨時(shí)間發(fā)生改變。
[0090]術(shù)語(yǔ)“癌細(xì)胞”和“腫瘤細(xì)胞”是指源自癌或腫瘤或前癌損傷的總細(xì)胞群體，其包括非致瘤性細(xì)胞(其包含大量癌細(xì)胞群)和致瘤性干細(xì)胞(癌干細(xì)胞)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“癌細(xì)胞”或“腫瘤細(xì)胞”當(dāng)僅指缺乏更新分化能力的那些細(xì)胞時(shí)會(huì)被術(shù)語(yǔ)“非致瘤性的”修飾，從而將這些腫瘤細(xì)胞與癌干細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。
[0091]本文使用的術(shù)語(yǔ)“致瘤性的”是指癌干細(xì)胞的功能特征，包括自我更新性質(zhì)(產(chǎn)生另外的致瘤性癌干細(xì)胞)和增殖以產(chǎn)生所有其他腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)(產(chǎn)生分化的非致瘤性腫瘤細(xì)胞)。
[0092]本文使用的術(shù)語(yǔ)“致瘤性”是指來(lái)自腫瘤的隨機(jī)細(xì)胞樣品在連續(xù)移植至免疫妥協(xié)的宿主(例如，小鼠)時(shí)形成可察覺(jué)的腫瘤的能力。
[0093]術(shù)語(yǔ)“受試對(duì)象”是指任何動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物)，包括但不限于人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物等，其是特定治療的接受者。通常而言，本文術(shù)語(yǔ)“受試對(duì)象”或“患者”在指人類(lèi)受試對(duì)象時(shí)可相互替換地使用。
[0094]術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或能夠批準(zhǔn)或在美國(guó)藥典或用于包括人類(lèi)在內(nèi)的動(dòng)物的其它公認(rèn)的藥典中列出。
[0095]術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的賦形劑、載劑或佐劑”或“可接受的藥物載劑”是指可以與至少一種本發(fā)明的結(jié)合劑(例如抗體)施用至受試對(duì)象的賦形劑、載劑或佐劑，當(dāng)以足以遞送治療效果的劑量施用時(shí)其不破壞至少一種本發(fā)明的結(jié)合劑的藥物活性，并且是非毒性的。
[0096]術(shù)語(yǔ)“有效量”或“治療有效量”或“治療效果”是指對(duì)于“治療”受試對(duì)象或哺乳動(dòng)物中的疾病或病癥有效的結(jié)合劑、抗體、多肽、多核苷酸、有機(jī)小分子或其他藥物的量。在癌的情況下，藥物的治療有效量具有治療效果，因此能夠減少癌細(xì)胞的數(shù)量；降低致瘤性、致瘤頻率或致瘤能力；減小癌干細(xì)胞的數(shù)量和頻率；減小腫瘤尺寸；減少癌細(xì)胞群；抑制或停止癌細(xì)胞浸潤(rùn)到周?chē)鞴?，包括例如癌擴(kuò)散至軟組織和骨中；抑制和停止腫瘤或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移；抑制和停止腫瘤或癌細(xì)胞生長(zhǎng)；某種程度上減緩與癌有關(guān)的一種或多種癥狀；減少發(fā)病率和致死率；改善生活品質(zhì)；或所述效果的組合。如果試劑，例如抗體防止現(xiàn)有癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞，則可以將其稱(chēng)為細(xì)胞抑制劑和/或細(xì)胞毒素。
[0097]術(shù)語(yǔ)“治療中”或“治療”或“待治療”或“緩解”或“待緩解”等術(shù)語(yǔ)是指I)治愈、減慢、減輕所診斷病理疾病或病癥的癥狀和/或暫停其發(fā)展的治療性措施，以及2)預(yù)防和/或減慢目的病理疾病或病癥的發(fā)展的預(yù)防性或防止性措施。因此需要治療的對(duì)象包括已經(jīng)罹患疾病的對(duì)象、傾向于罹患疾病的對(duì)象和其中待要預(yù)防疾病的對(duì)象。在一些實(shí)施方式中，如果患者顯示以下情況中的一種或多種，則根據(jù)本發(fā)明的方法成功地“治療”了受試對(duì)象:癌細(xì)胞的數(shù)量減少或完全不存在；腫瘤尺寸的減??；浸潤(rùn)到周?chē)鞴俚陌┘?xì)胞(包括例如癌至軟組織和骨的擴(kuò)散)受抑制或不存在；腫瘤或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移受抑制或不存在；癌生長(zhǎng)受抑制或不存在；與特定癌相關(guān)的一種或多種癥狀的緩解；發(fā)病率和致死率減少；生活品質(zhì)提高；或上述效果的某些組合。
[0098]如本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求所用，單數(shù)形式的“一種”、“一個(gè)”和“所述”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確地指出例外。
[0099]應(yīng)該理解的是，在本文無(wú)論何處以語(yǔ)言“包含”描述了實(shí)施方式，也就提供了以術(shù)語(yǔ)“由……組成”和/或“基本上由……組成”描述的另外的類(lèi)似實(shí)施方式。
[0100]本文諸如“A和/或B”等短語(yǔ)中使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”旨在包括A和B、A或B、(單獨(dú)的)A和(單獨(dú)的)B。類(lèi)似地，諸如“A、B和/或C”等短語(yǔ)中使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”旨在涵蓋了以下實(shí)施方式 中的每一種:A、B和C ;A、B或C ;A或C ;A或B ;B或C ;A和C ;A和B ;B和C ;(單獨(dú)的)A(單獨(dú))；(單獨(dú)的)B (單獨(dú))；和(單獨(dú)的)C。
[0101]I1.RSPO-結(jié)合劑
[0102]本發(fā)明提供結(jié)合人RSPO蛋白的試劑。本文將這些試劑稱(chēng)為“RSP0-結(jié)合劑”。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是多肽。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSPOl。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSP02。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑結(jié)合RSP03。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO試劑特異性結(jié)合至少一種其他人RSP0。在一些實(shí)施方式中，由RSPOl-結(jié)合劑結(jié)合的所述至少一種其他人RSPO選自由RSP02、RSP03和RSP04組成的組。在一些實(shí)施方式中，由RSP02-結(jié)合劑結(jié)合的所述至少一種其他人RSPO選自由RSP01、RSP03和RSP04組成的組。在一些實(shí)施方式中，由RSP03-結(jié)合劑結(jié)合的所述至少一種其他人RSPO選自由RSPOl、RSP02和RSP04組成的組。人RSP01、RSP02、RSP03和RSP04的全長(zhǎng)氨基酸(aa)序列是本領(lǐng)域已知的，并且在本文作為 SEQ ID NO:1 (RSPOl)、SEQ ID NO: 2 (RSP02)、SEQ ID NO: 3 (RSP03)和 SEQID N0:4(RSP04)提供。
[0103]在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPO-結(jié)合劑(例如抗體)的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠結(jié)合(或結(jié)合)一種、兩種、三種或四種RSP0。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPOl-結(jié)合劑(例如抗體)的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠結(jié)合(或結(jié)合)RSPOl以及一種、兩種或三種其他RSPO0例如，在一些實(shí)施方式中，RSPOl-結(jié)合劑的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠特異性結(jié)合RSPOl以及至少一種選自由RSP02、RSP03和RSP04組成的組中的其他RSP0。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPOl和RSP02。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPOl和RSP03。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPOl和RSP04。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSP01、RSP02和RSP03。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPOl、RSP02和RSP04。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSPOl、RSP03和RSP04。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑特異性結(jié)合人RSP01。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPOl-結(jié)合劑(例如抗體)特異性結(jié)合人RSPOl和小鼠RSPOl。
[0104]在一些實(shí)施方式中，所述試劑(結(jié)合劑)是在人RSPOl的21~263位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述試劑(結(jié)合劑)是在人RSPOl的31~263位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSPOl的34~135位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSPOl的91~135位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑在SEQ ID NO: 5內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑在SEQ IDN0:9內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑或抗體結(jié)合RSPOl的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述試劑或抗體結(jié)合在RSPOl的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑或抗體在序列SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑或抗體在序列SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 7內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑結(jié)合RSPOl的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑或抗體結(jié)合RSPOl的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述RSPOl-結(jié)合劑或抗體在SEQ ID NO:8內(nèi)結(jié)合。
[0105]在一些實(shí)施 方式中，本文描述的RSP02-結(jié)合劑(例如抗體)的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠結(jié)合(或結(jié)合)RSP02以及一種、兩種或三種其他RSP0。例如，在一些實(shí)施方式中，RSP02-結(jié)合劑的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠特異性結(jié)合RSP02以及至少一種選自由RSP01、RSP03和RSP04組成的組中的其他RSP0。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSP02和RSPOl。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSP02和RSP03。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSP02和RSP04。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSP02、RSP03和RSP04。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSP02、RSPOl和RSP03。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSP02、RSPOl和RSP04。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑特異性結(jié)合人RSP02。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑(例如抗體)特異性結(jié)合人RSP02和小鼠RSP02。
[0106]在一些實(shí)施方式中，所述試劑(結(jié)合劑)是在人RSP02的22~243位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述試劑(結(jié)合劑)是在人RSP02的22~205位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原-結(jié)合劑是在人RSP02的31~146位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSP02的31~89位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSP02的90~134位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSP02的90~146位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑在SEQID NO:43內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑在SEQ ID NO:44內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑或抗體結(jié)合RSP02的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述試劑或抗體結(jié)合在RSP02的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑或抗體在序列SEQ ID NO:45或SEQID NO:46內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑或抗體在序列SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑結(jié)合RSP02的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑或抗體結(jié)合RSP02的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑或抗體在SEQ ID NO:47內(nèi)結(jié)合。
[0107]在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSP03-結(jié)合劑(例如抗體)的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠結(jié)合(或結(jié)合)RSP03以及一種、兩種或三種其他RSP0。例如，在一些實(shí)施方式中，RSP03-結(jié)合劑的抗原結(jié)合位點(diǎn)能夠特異性結(jié)合RSP03以及至少一種選自由RSP01、RSP02和RSP04組成的組中的其他RSP0。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSP03和RSPOl。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSP03和RSP02。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSP03和RSP04。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSP03、RSPOl和RSP02。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSP03、RSPOl和RSP04。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑特異性結(jié)合RSP03、RSP02和RSP04。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑特異性結(jié)合人RSP03。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑(例如抗體)特異性結(jié)合人RSP03和小鼠RSP03。
[0108]在一些實(shí)施方式中，所述試劑(結(jié)合劑)是在人RSP03的22~272位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述試劑(結(jié)合劑)是在人RSP03的22~207位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSP03的35~135位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原結(jié)合劑是在人RSP03的35~86位氨基酸內(nèi)特異 性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗原-結(jié)合劑是在人RSP03的92~135位氨基酸內(nèi)特異性結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑在SEQ IDNO:48內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑或抗體結(jié)合RSP03的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述試劑或抗體結(jié)合在RSP03的弗林蛋白酶樣富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑或抗體在序列SEQ ID NO: 49或SEQ ID NO: 50內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑或抗體在序列SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50內(nèi)結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑結(jié)合RSP03的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑或抗體結(jié)合RSP03的血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述RSP03-結(jié)合劑或抗體在SEQ ID NO:51內(nèi)結(jié)合。
[0109]在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑或抗體以約ΙμΜ以下、約IOOnM以下、約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合至少一種RSPO蛋白。在一些實(shí)施方式中，RSPOl-結(jié)合劑或抗體以約ΙμΜ以下、約IOOnM以下、約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合RSPOl。在一些實(shí)施方式中，RSPOl-結(jié)合劑或抗體以約InM以下的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合RSPOl。在一些實(shí)施方式中，RSPOl-結(jié)合劑或抗體以約0.1nM以下的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合RSP01。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSPOl-結(jié)合劑或抗體結(jié)合至少一種其他RSP0。在一些實(shí)施方式中，本文描述的結(jié)合至少一種其他RSPO的RSPOl-結(jié)合劑或抗體與至少一種其他RSPO結(jié)合的Kd為約IOOnM以下、約20nM以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下。例如，在一些實(shí)施方式中，RSPOl-結(jié)合劑或抗體還以約IOnM以下的Kd結(jié)合RSP02、RSP03和/或RSP04。在一些實(shí)施方式中，RSPOl-結(jié)合劑(例如抗體)以約0.1nM以下的Kd結(jié)合人RSPOl。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑以約IOnM以下的Kd結(jié)合人RSPO和小鼠RSP0。在一些實(shí)施方式中，RSPOl-結(jié)合劑以約InM以下的Kd結(jié)合人RSPOl和小鼠RSPOl。在一些實(shí)施方式中，RSPOl-結(jié)合劑以約0.1nM以下的Kd結(jié)合人RSPOl和小鼠RSPOl。在一些實(shí)施方式中，RSP02-結(jié)合劑或抗體以約ΙμΜ以下、約IOOnM以下、約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合RSP02。在一些實(shí)施方式中，RSP02-結(jié)合劑或抗體以約IOnM以下的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合RSP02。在一些實(shí)施方式中，RSP02-結(jié)合劑或抗體以約InM以下的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合RSP02。在一些實(shí)施方式中，本文描述的RSP02-結(jié)合劑或抗體結(jié)合至少一種其他RSP0。在一些實(shí)施方式中，本文描述的結(jié)合至少一種其他RSPO的RSP02-結(jié)合劑或抗體與至少一種其他RSPO結(jié)合的Kd為約IOOnM以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下。例如，在一些實(shí)施方式中，RSP02-結(jié)合劑或抗體還以約IOnM以下的Kd結(jié)合RSP01、RSP03和/或RSP04。在一些實(shí)施方式中，RSP02-結(jié)合劑(例如抗體)以約InM以下的Kd結(jié)合人RSP02。在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑以約IOnM以下的Kd結(jié)合人RSPO和小鼠RSP0。在一些實(shí)施方式中，所述RSP02-結(jié)合劑以約InM以下的Kd結(jié)合人RSPOl和小鼠RSPOl。在一些實(shí)施方式中，RSP02-結(jié)合劑以約0.1nM以下的Kd結(jié)合人RSP02和小鼠RSP02。在一些實(shí)施方式中，所述結(jié)合劑(例如抗體)與RSPO蛋白的解離常數(shù)是使用固定在Biacore芯片上的包含至少一部分所述RSPO蛋白的RSPO融合蛋白確定的解離常數(shù)。
[0110]在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑(例如抗體)以約ΙμΜ以下、約IOOnM以下、約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的半最大效應(yīng)濃度(EC5tl)結(jié)合至 少一種人RSPO蛋白。在一些實(shí)施方式中，RSPOl-結(jié)合劑(例如抗體)以約I μ M以下、約IOOnM以下、約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的半最大效應(yīng)濃度(EC5tl)結(jié)合人RSP01。在一些實(shí)施方式中，RSPOl-結(jié)合劑(例如抗體)還以約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的EC5tl結(jié)合人RSP02、RSP03和/或RSP04。在一些實(shí)施方式中，RSP02-結(jié)合劑(例如抗體)以約I μ M以下、約IOOnM以下、約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的半最大效應(yīng)濃度(EC5tl)結(jié)合人RSP02。在一些實(shí)施方式中，RSP02-結(jié)合劑(例如抗體)還以約40ηΜ以下、約20ηΜ以下、約IOnM以下、約InM以下或約0.1nM以下的EC5tl結(jié)合人RSPOl、RSP03 和 / 或 RSP04。
[0111]在一些實(shí)施方式中，所述RSPO-結(jié)合劑是抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是重組抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是嵌合抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是人源化抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是人抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是IgGl抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是IgG2抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是單價(jià)抗體、單特異性抗體、雙價(jià)抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。在一些實(shí)施方式中，所述抗體綴合至細(xì)胞毒素部分。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是分離的。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是基本上純的。[0112]本發(fā)明的RSPO-結(jié)合劑(例如抗體)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行特異性結(jié)合檢驗(yàn)?？梢允褂玫拿庖邫z驗(yàn)包括但不限于使用諸如以下技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性檢驗(yàn)系統(tǒng)=Biacore分析、FACS分析、免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡、放射性免疫檢驗(yàn)、ELISA、“夾心”免疫檢驗(yàn)、免疫沉淀檢驗(yàn)、沉淀反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散檢驗(yàn)、凝集檢驗(yàn)、補(bǔ)體固定檢驗(yàn)、免疫放射檢驗(yàn)、熒光免疫檢驗(yàn)和蛋白A免疫檢驗(yàn)。此類(lèi)檢驗(yàn)是常規(guī)的，并且是本領(lǐng)域公知的(例如參見(jiàn)，Ausubel等編，1994-present, Current Protocolsin Molecular Biology, John ffiley&Sons, Inc., New York, NY)。
[0113]例如，抗體與人RSPOl的特異性結(jié)合可以使用ELISA確定。ELISA檢驗(yàn)包括:制備抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，向所述孔添加綴合至諸如酶促底物(例如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶)等可檢測(cè)化合物的所述RSP01-結(jié)合抗體或其他RSP01-結(jié)合劑，溫育一段時(shí)間，和檢測(cè)與所述抗原結(jié)合的抗體的存在。在一些實(shí)施方式中，所述述RSP01-結(jié)合抗體或試劑不綴合至可檢測(cè)化合物，而是向所述孔添加識(shí)別所述RSP01-結(jié)合抗體或試劑的第二綴合抗體。在一些實(shí)施方式中，作為用所述抗原包被所述孔的替代方案，將所述RSPO-結(jié)合抗體或試劑包被孔，將所述抗原添加至經(jīng)包被孔，之后可以添加綴合至可檢測(cè)化合物的第二抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉對(duì)于參數(shù)可以對(duì)其進(jìn)行修改以增加所檢測(cè)信號(hào)以及本領(lǐng)域已知的ELISA的其他變化。
[0114]在一個(gè)實(shí)例中，抗體與人RSP01的特異性結(jié)合可以使用FACS確定。FACS篩選檢驗(yàn)可以包括:產(chǎn)生表達(dá)作為融合蛋白(例如，RSPOl-Fc或RSP01-⑶4TM)的抗原的cDNA構(gòu)建體，將所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，在所述細(xì)胞的表面上表達(dá)所述抗原，將所述RSP01-結(jié)合抗體或其他RSP01-結(jié)合劑與所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞混合，和溫育一段時(shí)間。被RSP01-結(jié)合抗體或其他RSP01-結(jié)合劑結(jié)合的細(xì)胞可以通過(guò)使用綴合有可檢測(cè)化合物的第二抗體(例如，綴合有PE-的抗-Fe抗體) 和流式細(xì)胞儀來(lái)鑒定。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉對(duì)于參數(shù)可以對(duì)其進(jìn)行修改以增加所檢測(cè)信號(hào)以及可以增強(qiáng)篩選的FACS的其他變化(例如，就阻斷抗體進(jìn)行篩選)。
[0115]抗體或其他結(jié)合劑與抗原(例如RSPO蛋白)的結(jié)合親和性和抗體-抗原相互作用的解離速率(off-rate)可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)來(lái)確定。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢驗(yàn)的一個(gè)實(shí)例是放射性免疫檢驗(yàn)，其包括使經(jīng)標(biāo)記抗原(例如3H或125I)或其片段或變體與目的抗體在遞增量的未標(biāo)記抗原的存在下進(jìn)行溫育，然后檢測(cè)與所述經(jīng)標(biāo)記抗原結(jié)合的抗體。抗體對(duì)抗原(例如RSPO蛋白)的親和性和結(jié)合解離速率可以通過(guò)Scatchard作圖分析確定。在一些實(shí)施方式中，使用Biacore動(dòng)力學(xué)分析來(lái)確定結(jié)合抗原(例如RSPO蛋白)的抗體或試劑的結(jié)合和解離速率。Biacore動(dòng)力學(xué)分析包括從表面上具有經(jīng)固定抗原(例如RSPO蛋白)的芯片上分析抗體的結(jié)合和解離。
[0116]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合人RSP01的RSP01-結(jié)合劑(例如，抗體)，其中所述RSP01-結(jié)合劑(例如，抗體)包含抗體89M5的CDR中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)和/或六個(gè)(見(jiàn)表1)。在一些實(shí)施方式中，所述RSP01-結(jié)合劑包含89M5的⑶R中的一個(gè)以上、89M5的⑶R中的兩個(gè)以上、89M5的⑶R中的三個(gè)以上、89M5的⑶R中的四個(gè)以上、89M5的⑶R中的五個(gè)以上或89M5的⑶R中的所有六個(gè)。
[0117]表1
【權(quán)利要求】
1.一種特異性結(jié)合人R-反應(yīng)蛋白I(RSPOl)的分離的抗體，所述分離的抗體包含:
(a)包含TGYTMH(SEQ ID NO: 12)的重鏈 CDR1、包含 GINPNNGGTTYNQNFKG(SEQ ID NO: 13)的重鏈 CDR2 和包含 KEFSDGYYFFAY(SEQ ID NO: 14)的重鏈 CDR3 ;和 / 或
(b)包含KASQDVIFAVA(SEQ ID NO: 15)的輕鏈 CDRl，包含 WASTRHT (SEQ ID NO: 16)的輕鏈 CDR2 和包含 QQHYSTPW(SEQ ID NO: 17)的輕鏈 CDR3。
2.一種特異性結(jié)合人RSPOl的分離的抗體，所述分離的抗體包含: (a)與SEQID NO: 10具有至少90%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或 (b)與SEQID NO: 11具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
3.如權(quán)利要求2所述的抗體，所述抗體包含: (a)與SEQID NO: 10具有至少95%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或 (b)與SEQID NO: 11具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
4.如權(quán)利要求2所述的抗體，所述抗體包含: (a)包含SEQID NO: 10的重鏈可變區(qū)；和/或 (b)包含SEQID NO: 11的輕鏈可變區(qū)。
5.如權(quán)利要求2所述的抗體，所述抗體包含: (a)基本上由SEQID NO: 10組成的重鏈可變區(qū)；和 (b)基本上由SEQID NO: 11組成的輕鏈可變區(qū)。
6.一種特異性結(jié)合人RSPOl的分離的抗體，所述分離的抗體包含: (a)與SEQID NO: 55具有至少90%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或 (b)與SEQID NO:59具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
7.如權(quán)利要求6所述的抗體，所述抗體包含: (a)與SEQID NO: 55具有至少95%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或 (b)與SEQID NO:59具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
8.如權(quán)利要求6所述的抗體，所述抗體包含: (a)包含SEQID NO:55的重鏈可變區(qū)；和/或 (b)包含SEQID NO:59的輕鏈可變區(qū)。
9.如權(quán)利要求6所述的抗體，所述抗體包含: (a)基本上由SEQID NO:55組成的重鏈可變區(qū)；和 (b)基本上由SEQID NO:59組成的輕鏈可變區(qū)。
10.一種分離的抗體，所述分離的抗體與權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSPOl的特異性結(jié)合。
11.一種分離的抗體，所述分離的抗體與權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的抗體所結(jié)合的RSPOl上的表位相同。
12.—種分離的抗體，所述分離的抗體所結(jié)合的RSPOl上的表位與權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的抗體所結(jié)合的RSPOl上的表位重疊。
13.如權(quán)利要求1~12中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體是重組抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或雙特異性抗體。
14.如權(quán)利要求1~13中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體是人源化抗體。
15.如權(quán)利要求1~13中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體是人抗體。
16.如權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體是IgGl抗體或IgG2抗體。
17.如權(quán)利要求1~14中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體是包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。
18.—種單克隆抗體，所述單克隆抗體由ATCC保藏號(hào)為PTA-11970的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)。
19.權(quán)利要求18所述的抗體的人源化形式。
20.如權(quán)利要求1~19中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體抑制RSPOl與至少一種富含亮氨酸重復(fù)的G蛋白偶聯(lián)受體(LGR)的結(jié)合。
21.如權(quán)利要求20所述的抗體，其中，所述LGR選自由LGR4、LGR5和LGR6組成的組。
22.如權(quán)利要求21所述的抗體，其中，所述LGR是LGR5。
23.如權(quán)利要求1~22中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體抑制RSPOl信號(hào)傳導(dǎo)。
24.如權(quán)利要求1~23中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體抑制β-連環(huán)素的激活。
25.如權(quán)利要求1~24中任一項(xiàng)所述的抗體,所述抗體抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。
26.如權(quán)利要求1~25中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。
27.如權(quán)利要求1~26中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體誘導(dǎo)腫瘤中分化標(biāo)記物的表達(dá)。
28.如權(quán)利要求1~27中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體誘導(dǎo)腫瘤中的細(xì)胞進(jìn)行分化。
29.如權(quán)利要求1~28中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體減小腫瘤中的癌干細(xì)胞的頻率。
30.一種多肽，所述多肽包含選自由以下序列組成的組中的序列:SEQ ID NO: 10,SEQ IDNO:1USEQ ID NO:21,SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO: 55,SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO:68 和 SEQ ID NO:69。
31.如權(quán)利要求30所述的多肽，所述多肽是抗體。
32.—種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含或產(chǎn)生權(quán)利要求1~31中任一項(xiàng)所述的抗體或多肽。
33.一種雜交瘤細(xì)胞系，所述細(xì)胞系具有ATCC保藏號(hào)PTA-11970。
34.—種分離的多核苷酸分子,所述多核苷酸分子包含編碼權(quán)利要求1~31中任一項(xiàng)所述的抗體或多肽的多核苷酸。
35.一種分離的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含選自由以下序列組成的組中的多核苷酸序歹Ij:SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 52、SEQID NO: 54、SEQ ID NO: 56 和 SEQ ID NO: 58。
36.一種載體,所述載體包含權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所述的多核苷酸。
37.一種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所述的多核苷酸或者權(quán)利要求36所述的載體。
38.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1~31中任一項(xiàng)所述的抗體或多肽和藥學(xué)上可接受的載劑。
39.一種抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，其中，所述方法包括使所述腫瘤與有效量的權(quán)利要求1~29中任一項(xiàng)所述的抗體接觸。
40.一種抑制受試對(duì)象中腫瘤生長(zhǎng)的方法，其中，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的權(quán)利要求1~29中任一項(xiàng)所述的抗體。
41.一種誘導(dǎo)受試對(duì)象中腫瘤細(xì)胞的分化的方法，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的權(quán)利要求1~29中任一項(xiàng)所述的抗體。
42.一種減小受試對(duì)象的腫瘤中的癌干細(xì)胞的頻率的方法，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的權(quán)利要求1~29中任一項(xiàng)所述的抗體。
43.一種抑制細(xì)胞中β連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1~29中任一項(xiàng)所述的抗體接觸。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
45.如權(quán)利要求39~42或44中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述腫瘤選自由以下腫瘤組成的組:結(jié)直腸瘤、卵巢瘤、胰腺瘤、肺瘤、肝瘤、乳腺瘤、腎瘤、前列腺瘤、胃腸瘤、黑素瘤、子宮頸瘤、膀胱瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及頭頸瘤。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中，所述腫瘤是胰腺瘤。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其中，所述腫瘤是卵巢瘤。
48.一種治療受試對(duì)象中的癌的方法，其中，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的權(quán)利要求1~29中任一項(xiàng)所述的抗體。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述癌選自由以下癌組成的組:結(jié)直腸癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及頭頸癌。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述癌是結(jié)直腸癌或胰腺癌。
51.如權(quán)利要求50所 述的方法，其中，所述結(jié)直腸癌包含腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)基因中的失活突變。
52.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述結(jié)直腸癌不包含APC基因中的失活突變。
53.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述結(jié)直腸癌包含野生型APC基因。
54.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述結(jié)直腸癌不包含β連環(huán)素基因中的失活突變。
55.如權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述癌是卵巢癌。
56.如權(quán)利要求39~42或44~55中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述腫瘤或所述癌表達(dá)的RSPOl水平比正常組織中的RSPOl水平高。
57.如權(quán)利要求40~42或45~56中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受試對(duì)象的腫瘤或癌已被去除。
58.如權(quán)利要求39~42或44~57中任一項(xiàng)所述的方法,所述方法還包括確定所述腫瘤或癌中RSPOl的表達(dá)水平的步驟。
59.如權(quán)利要求39~42或44~58中任一項(xiàng)所述的方法,所述方法還包括確定所述腫瘤或癌是否具有所述APC基因中的失活突變的步驟。
60.如權(quán)利要求39~42或44~59中任一項(xiàng)所述的方法,所述方法還包括確定所述腫瘤或癌是否具有β連環(huán)素基因的激活突變的步驟。
61.如權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述確定RSPOl的表達(dá)水平的步驟在用所述抗體進(jìn)行治療或與所述抗體接觸之前完成。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中，如果所述腫瘤或癌具有升高的RSPOl表達(dá)水平，則將所述抗體: (a)施用至所述受試對(duì)象；或 (b)與所述腫瘤或腫瘤細(xì)胞接觸。
63.一種治療受試對(duì)象中的疾病的方法，其中，所述疾病與β連環(huán)素的激活相關(guān)，所述方法包括施用治療有效量的權(quán)利要求1~29中任一項(xiàng)所述的抗體。
64.如權(quán)利要求39~63中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括施用至少一種另外的治療劑。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中，所述另外的治療劑是化學(xué)治療劑。
66.如權(quán)利要求64所述的方法，其中，所述另外的治療劑是血管生成抑制劑。
67.如權(quán)利要求39~42或45~66中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受試對(duì)象是人。
68.—種選擇人受試對(duì)象以用結(jié)合RSPOl的抗體進(jìn)行治療的方法，所述方法包括:確定所述受試對(duì)象是否具有RSPOl表達(dá)水平升高的腫瘤，其中，如果所述腫瘤具有升高的RSPOl表達(dá)水平，則選擇所述受試對(duì)象以用特異性結(jié)合RSPOl的抗體進(jìn)行治療。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其中，所述腫瘤是卵巢瘤。
70.如權(quán)利要求58、68或69中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)基于PCR的檢驗(yàn)、微陣列分析或核苷酸測(cè)序來(lái)確定樣品中RSPOl的表達(dá)水平。
71.一種選擇人受試對(duì)象以用結(jié)合RSPOl的抗體進(jìn)行治療的方法，所述方法包括:確定所述受試對(duì)象是否具有包含APC基因中的失活突變的腫瘤，其中，如果所述腫瘤具有所述APC基因中的失活突變，則選擇所述受試對(duì)象以用特異性結(jié)合RSPOl的抗體進(jìn)行治療。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其中，所述腫瘤是結(jié)直腸瘤。
73.如權(quán)利要求59、71或72中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)基于PCR的檢驗(yàn)、雜交檢驗(yàn)、微陣列分析或核苷酸測(cè)序來(lái)確定樣品中APC基因的失活突變。
74.如權(quán)利要求70或73中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述樣品是新鮮的腫瘤樣品、冷凍的腫瘤樣品或福爾馬林固定的石蠟包埋樣品。
75.如權(quán)利要求68~74中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗體是權(quán)利要求1~29中任一項(xiàng)所述的抗體。
76.一種分離的抗體，所述分離的抗體特異性結(jié)合人R-反應(yīng)蛋白2(RSP02)，并且包含:
(a)包含SSYAMS(SEQ ID NO:29)的重鏈 CDR1、包含 SISSGGSTYYPDSVKG(SEQ ID NO:30)的重鏈 CDR2 和包含 RGGDPGVYNGDYEDAMDY(SEQ ID NO: 31)的重鏈 CDR3 ;和 / 或
(b)包含KASQDVSSAVA (SEQ ID NO: 32)的輕鏈 CDRl、包含 WASTRHT (SEQ ID NO: 33)的輕鏈 CDR2 和包含 QQHYSTP (SEQ ID NO: 34)的輕鏈 CDR3。
77.一種分離的抗體，所述分離的抗體特異性結(jié)合人RSP02，并且包含: (a)與SEQID NO: 27具有至少90%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或 (b)與SEQID NO: 28具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
78.如權(quán)利要求77所述的抗體，所述抗體包含: (a)與SEQID NO: 27具有至少95%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或 (b)與SEQID NO:28具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
79.如權(quán)利要求77所述的抗體，所述抗體包含: (a)包含SEQID NO:27的重鏈可變區(qū)；和/或 (b)包含SEQID NO:28的輕鏈可變區(qū)。
80.如權(quán)利要求77所述的抗體，所述抗體包含:(a)基本上由SEQID NO:27組成的重鏈可變區(qū)；和 (b)基本上由SEQID NO:28組成的輕鏈可變區(qū)。
81.一種分離的抗體，所述分離的抗體特異性結(jié)合人RSP02，并且包含: (a)與SEQID NO:63具有至少90%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或 (b)與SEQID NO:67或SEQ ID NO: 76具有至少90%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
82.如權(quán)利要求81所述的抗體，所述抗體包含: (a)與SEQID NO:63具有至少95%序列同一性的重鏈可變區(qū)；和/或 (b)與SEQID NO:67或SEQ ID NO:76具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
83.如權(quán)利要求81所述的抗體，所述抗體包含: (a)包含SEQID NO:63的重鏈可變區(qū)；和/或 (b)包含SEQID NO:67或SEQ ID NO:76的輕鏈可變區(qū)。
84.如權(quán)利要求81所述的抗體，所述抗體包含: (a)基本上由SEQ ID NO:63組成的重鏈可變區(qū)；和 (b)基本上由SEQID NO:67組成的輕鏈可變區(qū)。
85.如權(quán)利要求81所述的抗體，所述抗體包含: (a)基本上由SEQID NO:63組成的重鏈可變區(qū)；和 (b)基本上由SEQID NO:76組成的輕鏈可變區(qū)。
86.一種分離的抗體，所述分離的抗體與權(quán)利要求76~85中任一項(xiàng)所述的抗體競(jìng)爭(zhēng)與RSP02的特異性結(jié)合。
87.一種分離的抗體，所述分離的抗體與權(quán)利要求76~86中任一項(xiàng)所述的抗體所結(jié)合的RSP02上的表位相同。
88.一種分離的抗體，所述分離的抗體所結(jié)合的RSP02上的表位與權(quán)利要求76~86中任一項(xiàng)所述的抗體所結(jié)合的RSP02上的表位重疊。
89.如權(quán)利要求76~88中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體是重組抗體、單克隆抗體、嵌合抗體或雙特異性抗體。
90.如權(quán)利要求76~89中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體是人源化抗體。
91.如權(quán)利要求76~89中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體是人抗體。
92.如權(quán)利要求76~91中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體是IgGl抗體或IgG2抗體。
93.如權(quán)利要求76~92中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體是包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。
94.一種單克隆抗體，所述單克隆抗體由ATCC保藏號(hào)為PTA-12021的雜交瘤細(xì)胞系生產(chǎn)。
95.權(quán)利要求94所述的抗體的人源化形式。
96.如權(quán)利要求76-95中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體抑制RSP02與至少一種富含亮氨酸重復(fù)的G蛋白偶聯(lián)受體(LGR)的結(jié)合。
97.如權(quán)利要求96所述的抗體，其中，所述LGR選自由LGR4、LGR5和LGR6組成的組。
98.如權(quán)利要求97所述的抗體，其中，所述LGR是LGR5。
99.如權(quán)利要求76~98中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體抑制RSP02信號(hào)傳導(dǎo)。
100.如權(quán)利要求76~99中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體抑制β-連環(huán)素的激活。
101.如權(quán)利要求76~100中任一項(xiàng)所述的抗體,所述抗體抑制β-連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)。
102.如權(quán)利要求76~101中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。
103.如權(quán)利要求76~102中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體誘導(dǎo)腫瘤中分化標(biāo)記物的表達(dá)。
104.如權(quán)利要求76~103中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體誘導(dǎo)腫瘤中的細(xì)胞進(jìn)行分化。
105.如權(quán)利要求76~104中任一項(xiàng)所述的抗體，所述抗體減小腫瘤中的癌干細(xì)胞的頻率。
106.—種多肽，所述多肽包含選自由以下序列組成的組中的序列:SEQ ID NO:27、SEQID NO:28, SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38, SEQ IDN0:41、SEQ IDNO:42、SEQ IDNO:61、SEQ IDNO:63,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:70,SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:74和 SEQ ID NO:76。
107.如權(quán)利要求106所述的多肽，所述多肽是抗體。
108.—種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含或產(chǎn)生權(quán)利要求76~107中任一項(xiàng)所述的抗體或多肽。
109.—種雜交瘤細(xì)胞系，所述細(xì)胞系具有ATCC保藏號(hào)PTA-12021。
110.一種分離的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含編碼權(quán)利要求76~107中任一項(xiàng)所述的抗體或多肽的多核苷酸。
111.一種分離的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子包含選自由以下序列組成的組中的多核苷酸序列:SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 60、SEQID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO: 72 和 SEQ ID NO: 75。
112.—種載體，所述載體包含權(quán)利要求110或權(quán)利要求111所述的多核苷酸。
113.—種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求110或權(quán)利要求111所述的多核苷酸或者權(quán)利要求112所述的載體。
114.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含:權(quán)利要求76~107中任一項(xiàng)所述的抗體或多肽；和藥學(xué)上可接受的載劑。
115.一種抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，其中，所述方法包括使所述腫瘤與有效量的權(quán)利要求76~105中任一項(xiàng)所述的抗體接觸。
116.—種抑制受試對(duì)象中腫瘤生長(zhǎng)的方法，其中，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的權(quán)利要求76~105中任一項(xiàng)所述的抗體。
117.一種誘導(dǎo)受試對(duì)象中腫瘤細(xì)胞的分化的方法，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的權(quán)利要求76~105中任一項(xiàng)所述的抗體。
118.—種減小受試對(duì)象的腫瘤中的癌干細(xì)胞的頻率的方法，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的權(quán)利要求76~105中任一項(xiàng)所述的抗體。
119.一種抑制細(xì)胞中β連環(huán)素信號(hào)傳導(dǎo)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求76~105中任一項(xiàng)所述的抗體接觸。
120.如權(quán)利要求119所述的方法，其中，所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
121.如權(quán)利要求115~118或120中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述腫瘤選自由以下腫瘤組成的組:結(jié)直腸瘤、卵巢瘤、胰腺瘤、肺瘤、肝瘤、乳腺瘤、腎瘤、前列腺瘤、胃腸瘤、黑素瘤、子宮頸瘤、膀胱瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及頭頸瘤。
122.如權(quán)利要求121所述的方法，其中，所述腫瘤是胰腺瘤。
123.如權(quán)利要求121所述的方法，其中，所述腫瘤是卵巢瘤。
124.—種治療受試對(duì)象中的癌的方法，其中，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的權(quán)利要求76~105中任一項(xiàng)所述的抗體。
125.如權(quán)利要求124所述的方法，其中，所述癌選自由以下癌組成的組:結(jié)直腸癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及頭頸癌。
126.如權(quán)利要求125所述的方法，其中，所述癌是結(jié)直腸癌。
127.如權(quán)利要求126所述的方法，其中，所述結(jié)直腸癌包含腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)基因的失活突變。
128.如權(quán)利要求126所述的方法，其中，所述結(jié)直腸癌不包含APC基因中的失活突變。
129.如權(quán)利要求126所述的方法，其中，所述結(jié)直腸癌包含野生型APC基因。
130.如權(quán)利要求126所述的方法，其中，所述結(jié)直腸癌不包含β連環(huán)素基因中的激活突變。
131.如權(quán)利要求125所述的方法，其中，所述癌是胰腺癌。
132.如權(quán)利要求115~118或120~131中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述腫瘤或所述癌表達(dá)的RSP02水平比正常組織中的RSP02水平高。
133.如權(quán)利要求116~118或121~132中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受試對(duì)象的腫瘤或癌已經(jīng)被去除。
134.如權(quán)利要求115~118或120~133中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括確定所述腫瘤或癌中RSP02的表達(dá)水平的步驟。
135.如權(quán)利要求115~118或120~134中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括確定所述腫瘤或癌是否具有所述APC基因中的失活突變的步驟。
136.如權(quán)利要求115~118或120~135中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括確定所述腫瘤或癌是否具有β連環(huán)素基因的激活突變的步驟。
137.如權(quán)利要求134所述的方法，其中，所述確定RSP02的表達(dá)水平的步驟在用所述抗體進(jìn)行治療或與所述抗體接觸之前完成。
138.如權(quán)利要求137所述的方法，其中，如果所述腫瘤或癌具有升高的RSP02表達(dá)水平，則將所述抗體: (a)施用至所述受試對(duì)象；或 (b)與所述腫瘤或腫瘤細(xì)胞接觸。
139.—種治療受試對(duì)象中的疾病的方法，其中，所述疾病與β連環(huán)素的激活相關(guān)，所述方法包括施用治療有效量的權(quán)利要求76~105中任一項(xiàng)所述的抗體。
140.如權(quán)利要求115~139中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括施用至少一種另外的治療劑。
141.如權(quán)利要求140所述的方法，其中，所述另外的治療劑是化學(xué)治療劑。
142.如權(quán)利要求140所述的方法，其中，所述另外的治療劑是Wnt途徑抑制劑。
143.如權(quán)利要求116~118或121~142中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受試對(duì)象是人。
144.一種選擇人受試對(duì)象以用結(jié)合RSP02的抗體進(jìn)行治療的方法，所述方法包括:確定所述受試對(duì)象是否具有RSP02表達(dá)水平升高的腫瘤，其中，如果所述腫瘤具有升高的RSP02表達(dá)水平，則選擇所述受試對(duì)象以用特異性結(jié)合RSP02的抗體進(jìn)行治療。
145.如權(quán)利要求144所述的方法，其中，所述腫瘤是胰腺瘤。
146.如權(quán)利要求144所述的方法，其中，所述腫瘤是乳腺瘤。
147.如權(quán)利要求144所述的方法，其中，所述腫瘤是肺瘤。
148.如權(quán)利要求144所述的方法，其中，所述腫瘤是黑素瘤。
149.如權(quán)利要求144所述的方法，其中，所述腫瘤是結(jié)直腸瘤。
150.如權(quán)利要求134或144~149中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)基于PCR的檢驗(yàn)、微陣列分析或核苷酸測(cè)序來(lái)確定樣品中RSP02的表達(dá)水平。
151.—種選擇人受試對(duì)象以用結(jié)合RSP02的抗體進(jìn)行治療的方法，所述方法包括:確定所述受試對(duì)象是否具有包含APC基因中的失活突變的腫瘤，其中，如果所述腫瘤具有所述APC基因中的失活突變，則選擇所述受試對(duì)象以用特異性結(jié)合RSP02的抗體進(jìn)行治療。
152.如權(quán)利要求151所述的方法，其中，所述腫瘤是結(jié)直腸瘤。
153.如權(quán)利要求135、151或152中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)基于PCR的檢驗(yàn)、雜交檢驗(yàn)、微陣列分析或 核苷酸測(cè)序來(lái)確定樣品中APC基因的失活突變。
154.如權(quán)利要求150或權(quán)利要求153所述的方法，其中，所述樣品是新鮮的腫瘤樣品、冷凍的腫瘤樣品或福爾馬林固定的石蠟包埋樣品。
155.如權(quán)利要求144~154中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述抗體是權(quán)利要求76~105中任一項(xiàng)所述的抗體。
156.一種抗體，所述抗體包含SEQ ID NO:25的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:26的輕鏈氨基酸序列。
157.一種抗體，所述抗體包含SEQ ID NO:41的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:42的輕鏈氨基酸序列。
158.一種抗體，所述抗體包含SEQ ID NO:68的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:69的輕鏈氨基酸序列。
159.一種抗體，所述抗體包含SEQ ID NO:70的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:71的輕鏈氨基酸序列。
160.一種抗體，所述抗體包含SEQ ID NO:70的重鏈氨基酸序列和SEQ ID NO:74的輕鏈氨基酸序列。
161.一種選擇人受試對(duì)象以用結(jié)合RSP03的抗體進(jìn)行治療的方法，所述方法包括:確定所述受試對(duì)象是否具有RSP03表達(dá)水平升高的腫瘤，其中，如果所述腫瘤具有升高的RSP03表達(dá)水平，則選擇所述受試對(duì)象以用特異性結(jié)合RSP03的抗體進(jìn)行治療。
162.如權(quán)利要求161所述的方法，其中，所述腫瘤是肺瘤。
163.如權(quán)利要求161所述的方法，其中，所述腫瘤是乳腺瘤。
164.如權(quán)利要求161所述的方法，其中，所述腫瘤是卵巢瘤。
165.如權(quán)利要求161所述的方法，其中，所述腫瘤是結(jié)直腸瘤。
166.如權(quán)利要求161~165中任一項(xiàng)所述的方法,其中,通過(guò)基于PCR的檢驗(yàn)、微陣列分析或核苷酸測(cè)序來(lái)確定樣品中RSP03的表達(dá)水平。
167.如權(quán)利要求166所述的方法，其中，所述樣品是新鮮的腫瘤樣品、冷凍的腫瘤樣品或福爾馬林固定的石蠟包埋樣品。
168.—種選擇人受試對(duì)象以用結(jié)合RSP04的抗體進(jìn)行治療的方法，所述方法包括:確定所述受試對(duì)象是否具有RSP04表達(dá)水平升高的腫瘤，其中，如果所述腫瘤具有升高的RSP04表達(dá)水平，則選擇所述受試對(duì)象以用特異性結(jié)合RSP04的抗體進(jìn)行治療。
169.如權(quán)利要求168所述的方法，其中，所述腫瘤是肺瘤。
170.如權(quán)利要求168所述的方法，其中，所述腫瘤是乳腺瘤。
171.如權(quán)利要求168所述的方法，其中，所述腫瘤是卵巢瘤。
172.如權(quán)利要求168~171中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)基于PCR的檢驗(yàn)、微陣列分析或核苷酸測(cè)序來(lái)確定樣品中RSP03的表達(dá)水平。
173.如權(quán)利要求172所述的方法，其中，所述樣品是新鮮的腫瘤樣品、冷凍的腫瘤樣品或福爾馬林固定的石 蠟包埋樣品。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK104023746SQ201280045135
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2012年7月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月15日
【發(fā)明者】奧斯丁·L·格尼, 富米考·塔卡達(dá)·阿克塞爾羅德, 蒂莫西·查爾斯·霍伊, C·沙爾捷-庫(kù)爾托 申請(qǐng)人:昂考梅德藥品有限公司