Rspo3結(jié)合劑及其用圖
【專利說明】RSP03結(jié)合劑及其用途
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)案主張于2012年7月13日提出申請(qǐng)的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)案第61/671,421 號(hào)、2013年1月16日提出申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)案第61/753, 184號(hào)、2013年3月15日提出 申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)案第61/789, 156號(hào)及2013年5月23日提出申請(qǐng)的美國臨時(shí)申請(qǐng)案 第61/826, 747號(hào)的優(yōu)先權(quán),各案以參照方式整體納入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明的領(lǐng)域大抵關(guān)于與R-脊椎蛋白(RSP0)、特別是人R-脊椎蛋白R(shí)SP03結(jié)合 的抗體及其它試劑,以及使用該抗體或其它試劑以治療疾病諸如癌的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] R-脊椎蛋白(RSP0)家族的蛋白在脊椎動(dòng)物之間具保守性,包含四個(gè)成員RSP01、 RSP02、RSP03及RSP04。這些蛋白有許多不同的名稱,包括頂板特異性脊椎蛋白(roof plate-specific spondin)、hPWTSR(hRSP03)、THS2D(RSP03)、Cristin 1-4 及 Futrin 1-4〇 RSP0為小型分泌蛋白,所有RSP0共享大約40至60 %的序列同源性及結(jié)構(gòu)域組織。所有 RSP0蛋白包含在N端的兩個(gè)類似弗林蛋白酶(furin)的多半胱氨酸區(qū)、其后為血小板反應(yīng) 素結(jié)構(gòu)域及堿性帶電C端尾部(Kim等,2006, Cell Cycle, 5:23-26)。
[0005] 研宄顯示,RSP0蛋白在脊椎動(dòng)物發(fā)育期間(Kamata等,2004, Biochim. Biophys Acta, 1676:51-62)與爪蟾(Xenopus)的肌肉發(fā)育(Kazanskaya 等,2004, Dev. Cell,7:525-534)方面具有功能。研宄也顯示RSP01為胃腸上皮細(xì)胞的強(qiáng)效有絲分裂原 (Kim等,2005, Science, 309:1256-1259)。報(bào)告指出RSP03主要表達(dá)于爪蟾及小鼠的內(nèi)皮 細(xì)胞及內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞中或附近。另外,研宄指出RSP03可能在胚胎發(fā)生時(shí)作為血管生成因 子(Kazanskaya 等,2008, Development, 135:3655-3664)。已知 RSP0 蛋白活化類似 Wnt 信 號(hào)傳導(dǎo)的0 _連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo),然而RSP0蛋白與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)之間的關(guān)系仍在研宄當(dāng) 中。報(bào)告指出RSP0蛋白對(duì)Wnt配體具有陽性調(diào)節(jié)活性(Nam等,2006, JBC 281:13247-57)。 此研宄也指出RSP0蛋白可作為Frizzled8及LRP6受體配體及誘導(dǎo)|3 -連環(huán)蛋白信號(hào)傳 導(dǎo)(Nam等,2006, JBC 281:13247-57)。最近研宄已發(fā)現(xiàn)RSP0蛋白與LGR(富含亮氨酸重復(fù) 的G蛋白偶合受體)蛋白(如LGR5)之間有相互作用(美國專利公開號(hào)2009/0074782及 2009/0191205),這些資料提出活化0 -連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的替代途徑。
[0006] Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑已被認(rèn)為是有效的癌治療靶標(biāo)。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑是胚胎模式 形成、后胚胎組織維持及干細(xì)胞生物學(xué)的重要調(diào)節(jié)因子之一。更特別地,Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在細(xì) 胞極性的產(chǎn)生和細(xì)胞命運(yùn)決定包括干細(xì)胞族群自我更新中起重要作用。未受調(diào)節(jié)的Wnt途 徑活化與許多人癌癥有關(guān),一般相信該活化可改變細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn)。活化Wnt途徑可能使 腫瘤細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)和/或?qū)е虏皇芸刂频脑錾?。因此癌的發(fā)生可通過超越控制正 常發(fā)育及組織修復(fù)的恒定機(jī)制進(jìn)行(于Reya&Clevers, 2005, Nature, 434:843-50 ;Beachy 等,2004, Nature, 432:324-31 中綜述)。
[0007] Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑首先在果蠅發(fā)育突變無翅(wg)以及小鼠原致癌 基因 int_l (現(xiàn)稱 Wntl)中闡述(Nusse&Varmus, 1982,Cell, 31:99-109 ;Van Ooyen&Nusse, 1984, Cell, 39:233-40 ;Cabrera 等,1987, Cell, 50:659-63 ;Rijsewijk 等, 1987, Cell,50:649-57)。Wnt基因編碼分泌型脂肪修飾糖蛋白,其中19種已在哺乳動(dòng)物中 識(shí)別。這些分泌型配體活化由卷曲(FZD)受體家族成員及低密度脂蛋白(LDL)受體相關(guān)蛋 白5或6(LRP5/6)組成的受體復(fù)合體。該FZD受體為G蛋白偶合受體(GPCR)超家族的七 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白,且包含具有10個(gè)保守性半胱氨酸的大型胞外N端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,稱 為多半胱氨酸區(qū)(CRD)或Fri結(jié)構(gòu)域。有十種人FZD受體,F(xiàn)ZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、 FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10。不同的FZD CRD對(duì)特定Wnt蛋白有不同的結(jié)合親和性 (Wu&Nusse, 2002, J. Biol. Chem.,277:41762-9),F(xiàn)ZD 受體已被分成活化典型 0 -連環(huán)蛋白 途徑者及活化非典型途徑者(Miller等,1999, Oncogene, 18:7860-72)。
[0008] Wnt信號(hào)傳導(dǎo)于癌癥的角色,首先是因?yàn)樽R(shí)別Wntl (原名inti)為通過鄰近插入 小鼠病毒而轉(zhuǎn)化的乳腺腫瘤的致癌基因而被發(fā)現(xiàn)(Nusse&Varmus, 1982, Cell, 31:99-109)。 其它Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在乳腺癌角色的證據(jù)自此開始累積。舉例來說,轉(zhuǎn)基因連環(huán)蛋 白于乳腺中的過表達(dá)導(dǎo)致增生及腺癌(Imbert等,2001,J. Cell Biol.,153:555-68 ;Mi chaelson&Leder, 2001,Oncogene, 20:5093-9),然而喪失Wnt信號(hào)傳導(dǎo)擾亂正常乳腺發(fā) 育(Tepera 等,2003, J. Cell Sci.,116:1137-49 ;Hatsell 等,2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 8:145-58)。在人乳腺癌中,0-連環(huán)蛋白累積表示超過50 %的癌中 有經(jīng)活化的Wnt信號(hào)傳導(dǎo),雖然特定突變尚未被識(shí)別,但已觀察到卷曲受體表達(dá)上調(diào) (Brennan&Brown, 2004, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 9:119-31 ;Malovanovic 等, 2004, Int. J. Oncol.,25:1337-42)。
[0009] Wnt途徑的活化也和結(jié)直腸癌有關(guān)。大約5至10%的所有結(jié)直腸癌為遺傳性,其 中一種主要形式為家族性腺瘤息肉癥(FAP),這是一種常染色體顯性疾病,其中大約80% 的患者包含大腸腺瘤息肉(APC)基因的種系突變。另外也在其它Wnt途徑成分包括Axin 及連環(huán)蛋白發(fā)現(xiàn)突變。個(gè)別腺瘤為包含第二失活等位基因的上皮細(xì)胞的種系過度生 長,大量FAP腺瘤無可避免地導(dǎo)致腺癌經(jīng)由致癌基因和/或抑瘤基因的額外突變發(fā)生。另 外,Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化,包括APC的功能喪失突變及連環(huán)蛋白的穩(wěn)定突變,可誘導(dǎo) 小鼠模型中的增生發(fā)育及腫瘤生長(Oshima等,1997, Cancer Res. ,57:1644-9 ;Harada等, 1999, EMB0 J. , 18:5931-42)〇
[0010] 黑色素瘤和乳腺癌及結(jié)腸癌類似,通常具有Wnt途徑的組成性活化,如e-連環(huán)蛋 白的細(xì)胞核累積所示。一些黑色素瘤及細(xì)胞系中的Wnt/f3-連環(huán)蛋白途徑活化是因?yàn)橥緩?成分的修飾所致,如APC、ICAT、LEF1及|3 -連環(huán)蛋白(見例如Larue等,2006, Frontiers Biosci.,11:733-742)。然而,文獻(xiàn)中關(guān)于Wnt/0-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)在黑色素瘤中的確 切作用有所矛盾。舉例來說,一項(xiàng)研宄發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核連環(huán)蛋白濃度上升和黑色素瘤存 活改善有關(guān),而經(jīng)活化的Wnt/連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)卻與細(xì)胞增生減少有關(guān)(Chien等, 2009,PNAS,106:1193-1198)。
[0011] 癌藥物研宄的焦點(diǎn)現(xiàn)正轉(zhuǎn)移至以人癌癥相關(guān)性基因、蛋白及途徑為目標(biāo)的靶向治 療。需要能為癌患者提供治療益處的靶向信號(hào)傳導(dǎo)途徑的新藥劑及靶向多重途徑的新的藥 劑組合。因此,干擾連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的生物分子(例如抗RSP03抗體)是癌及其它 e-連環(huán)蛋白相關(guān)疾病的新治療藥劑的潛在來源。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0012] 本發(fā)明提供與RSP03蛋白結(jié)合的結(jié)合劑(諸如抗體)以及包含該結(jié)合劑的組合物 (諸如藥物組合物)。本發(fā)明也提供與RSP03及至少一種其它抗原或靶標(biāo)結(jié)合的結(jié)合劑以 及該結(jié)合劑的藥物組合物。在某些實(shí)施方式中,RSP03結(jié)合劑是新穎多肽,如抗體、抗體片 段及與該抗體相關(guān)的其它多肽。本發(fā)明另提供通過將該RSP03結(jié)合劑施用至患有腫瘤的受 試對(duì)象以抑制腫瘤生長的方法。本發(fā)明另提供通過將該RSP03結(jié)合劑施用至需要該結(jié)合劑 的受試對(duì)象以治療癌的方法。在一些實(shí)施方式中,治療癌或抑制腫瘤生長的方法包含利用 該RSP03結(jié)合劑以靶向癌干細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中,該方法包含擾亂0-連環(huán)蛋白信號(hào) 傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中,該方法包含調(diào)節(jié)(例如抑制)血管生成。在某些實(shí)施方式中,該 方法包含減少腫瘤中癌干細(xì)胞的頻率、減少腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量、減少腫瘤的致瘤性和/ 或通過減少腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量或頻率以減少腫瘤的致瘤性。
[0013] 在一方面,本發(fā)明提供與人RSP03特異性結(jié)合的結(jié)合劑,如抗體。人RSP03的序列 為該領(lǐng)域已知,其作為SEQ ID N0:3包含于本文中。在某些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑結(jié) 合至人RSP03的氨基酸22至272以內(nèi)。在某些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑結(jié)合至人RSP03 的氨基酸22至207以內(nèi)。在某些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑結(jié)合至人RSP03的氨基酸35 至135以內(nèi)。在某些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑結(jié)合至人RSP03的氨基酸35至86以內(nèi)。 在某些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑結(jié)合至人RSP03的氨基酸92至135以內(nèi)。在一些實(shí)施 方式中,該RSP03結(jié)合劑(如抗體)與選自RSP01、RSP02或RSP04的至少一種其它人RSP0 特異性結(jié)合。在一些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑或抗體調(diào)節(jié)連環(huán)蛋白活性、為連 環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑、抑制連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)和/或抑制連環(huán)蛋白活化。在 一些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑抑制RSP03信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合 劑抑制、干擾和/或擾亂RSP03與一種或多種LGR蛋白(如LGR4、LGR5和/或LGR6)的結(jié) 合。在一些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑抑制RSP03與LGR5的結(jié)合。
[0014] 在某些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑是與人RSP03結(jié)合的抗體。在一些實(shí)施方式 中,該抗體與人RSP03及小鼠RSP03結(jié)合。在某些實(shí)施方式中,該抗體包含重鏈⑶R1、重 鏈 CDR2 及重鏈 CDR3,該重鏈 CDR1 包含 KASGYTFTDYS (SEQ ID N0:9)、KASGYTFTSYTF (SEQ ID N0:34)或 DYSIH(SEQ ID N0:78),該重鏈 CDR2 包含 IYPSNGDS(SEQ ID N0:10)或 HYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID N0:79),且該重鏈 CDR3 包含 ATYFANYFDY(SEQ ID NO: 11)、 ATYFANNFDY(SEQ ID N0:35)或 TYFANNFD(SEQ ID N0:80)。在一些實(shí)施方式中,該抗體另 包含輕鏈〇)1?1、輕鏈〇^2及輕鏈0)1?3,該輕鏈0)1?1包含〇3¥0¥00^¥]\1(3£〇10勵(lì) :12)或 KASQSVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:81),該輕鏈 CDR2 包含 AAS(SEQ ID N0:13)或 AASNLES(SEQ 10勵(lì):82),且該輕鏈〇?3包含005冊(cè)0?1^(5£0 10勵(lì):14)或005冊(cè)0?1^^(5£0 10勵(lì):83)。 在一些實(shí)施方式中,該抗體包含:包含KASGYTFIDYS(SEQ ID N0:9)的重鏈CDR1、包含 IYPSNGDS(SEQ ID N0:10)的重鏈 CDR2 及包含 ATYFANNFDY(SEQ ID N0:35)的重鏈 CDR3,和 / 或包含 QSVDYD⑶SYM(SEQ ID N0:12)的輕鏈 CDR1、包含 AAS(SEQ ID N0:13)的輕鏈 CDR2 及包含QQSNEDPLT(SEQ ID N0:14)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中,該抗體包含:包含 DYSIH(SEQ ID N0:78)的重鏈CDR1、包含 HYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID N0:79)的重鏈CDR2 及 包含 TYFANNFD(SEQ ID N0:80)的重鏈 CDR3,和 / 或包含 KASQSVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:81) 的輕鏈CDR1、包含AASNLES(SEQ ID N0:82)的輕鏈CDR2 及包含 QQSNEDPLTF(SEQ ID N0:83) 的輕鏈⑶R3。在一些實(shí)施方式中,該抗體包含:包含DYSIH(SEQ ID N0:78)的重鏈⑶Rl、包 含 HYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID N0:79)的重鏈 CDR2 及包含 TYFANNFD(SEQ ID N0:80)的重 鏈 CDR3,和 / 或包含 KASQSVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:81)的輕鏈 CDR1、包含 AASNLES(SEQ ID N0:82)的輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID N0:14)的輕鏈CDR3。在一些實(shí)施方式中, 該抗體包含:包含 KASGYTFTDYS(SEQ ID N0:9)或 DYSIH(SEQ ID N0:78)的重鏈 CDR1、包含 IYPSNGDS(SEQ ID N0:10)的重鏈 CDR2 及包含 TYFANNFD(SEQ ID N0:80)的重鏈 CDR3,和 / 或包含 QSVDYD⑶SYM(SEQ ID N0:12)的輕鏈 CDR1、包含 AAS(SEQ ID N0:13)的輕鏈 CDR2 及 包含 QQSNEDPLT(SEQ ID N0:14)的輕鏈 CDR3。
[0015] 在某些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑是包含下列的抗體:(a)包含 包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變異體的重鏈⑶Rl ; (b)包含IYPSNGDS(SEQ ID N0:10)、 HYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID N0:79)或其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變異體的重鏈 CDR2;(c)包含ATYFANYFDY(SEQ ID N0:11)、ATYFANNFDY(SEQ ID N0:35)、TYFANNFD(SEQ ID N0:80)或其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變異體的重鏈CDR3 ;(d)包含QSVDYD⑶SYM(SEQ ID N0:12)、KASQSVDYD⑶SYMN(SEQ ID N0:81)或其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變異體 的輕鏈CDRl;(e)包含AAS(SEQ ID N0:13)、AASNLES(SEQ ID N0:82)或其包含 1、2、3或4個(gè) 氨基酸取代的變異體的輕鏈CDR2 ;及(f)包含QQSNEDPLT(SEQ ID N0:14)、QQSNEDPLTF(SEQ ID N0:83)或其包含1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變異體的輕鏈⑶R3。在一些實(shí)施方式中, 該氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些實(shí)施方式中,該取代被當(dāng)作種系人源化過程的 一部份。
[0016] 在某些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑是包含下列的抗體:(a)與SEQ ID N0:15、SEQ 10勵(lì):16、5£〇10勵(lì):36、5£〇10勵(lì):37、5£〇10勵(lì):44、5£〇10勵(lì):45或5£〇10勵(lì):62具 有至少80%序列一致性的重鏈可變區(qū),和/或(b)與SEQ ID NO: 17、SEQ ID N0:72或SEQ ID N0:86具有至少80%序列一致性的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑是 包含下列的抗體:(a)與 SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:36、SEQ ID N0:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:62具有至少90%序列一致性的重鏈可變區(qū),和/或 (b)與SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:72或SEQ ID N0:86具有至少90%序列一致性的輕鏈可 變區(qū)。
[0017] 在一些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑是單克隆抗體。在一些實(shí)施方式中,該單克隆 抗體是IgGl抗體。在一些實(shí)施方式中,該單克隆抗體系IgG2抗體。在一些實(shí)施方式中,該 RSP03結(jié)合劑是單克隆抗體131R002或單克隆抗體131R003。在一些實(shí)施方式中,該RSP03 結(jié)合劑是單克隆抗體131R002或單克隆抗體131R003的親和性成熟變異體。在一些實(shí)施方 式中,該RSP03結(jié)合劑為包含源自抗體131R002或抗體131R003的抗原結(jié)合位點(diǎn)的嵌合抗 體。在一些實(shí)施方式中,該RSP03結(jié)合劑是抗體131R002或抗體131R003的人源化形式。 在一些實(shí)施方式中,該 RSP03 結(jié)合劑是抗體 hl31R006A、hl31R006B、hl31R005/131R007、 hl31R008、hl31R010 或hl31R011。
[0018] 在另一方面,本發(fā)明提供與本發(fā)明的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSP03特異性結(jié)合的結(jié)合劑 (例如抗體)。在一些實(shí)施方式中,該結(jié)合劑(例如抗體)與包含重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū) 的抗體競(jìng)爭(zhēng)與人RSP03的特異性結(jié)合,該重鏈可變區(qū)包含SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45 或 SEQ ID NO: 62,該輕鏈可變區(qū)包 含SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:86。在一些實(shí)施方式中,與該RSP