專利名稱：纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物組織工程技術(shù)，具體是ー種纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架及其構(gòu)建方法
背景技術(shù)：
生物組織工程方法主要包括支架材料、種子細(xì)胞和信號(hào)因子三要素，其中，支架材料是組織工程構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。理想的組織工程椎間盤支架材料除了具備良好的生物相容性，良好的孔隙結(jié)構(gòu)，以及適當(dāng)?shù)慕到庑阅艿裙残砸酝猓€應(yīng)該在成分、形狀、結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能上與人椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)相似。椎間盤結(jié)構(gòu)復(fù)雜并有很高程度的異質(zhì)性，含有髓核與纖維環(huán)兩個(gè)發(fā)育上和形態(tài)上不同的區(qū)域，由不同的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成。目前對(duì)于組織工程椎間盤支架材料的研究 多停留在分別構(gòu)建組織工程纖維環(huán)支架(AF)和組織工程髓核支架(NP)上，早期用于椎間盤組織工程的支架材料有藻酸鹽、瓊脂糖、透明質(zhì)酸、以及聚乳酸聚羥基こ酸共聚物(PLGA)等，后來則傾向于應(yīng)用類似椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的含有膠原和蛋白聚糖成分的材料，如I型膠原/透明質(zhì)酸復(fù)合支架、II型膠原/透明質(zhì)酸凝膠復(fù)合支架、II型膠原/透明質(zhì)酸/6-硫酸軟骨素、脫細(xì)胞小腸粘膜下層(SIS)等，尚缺乏對(duì)一體化AF-NP支架材料的研究。美國Mizuno課題小組創(chuàng)新性用聚こ醇酸_聚乳酸材料(PGA /PLLA)制成橢圓形的纖維環(huán)外形支架，并種植羊纖維環(huán)細(xì)胞，其中心部注入以藻酸鹽凝膠復(fù)合的髓核細(xì)胞，從而制成一椎間盤樣組織工程化復(fù)合物井植入裸鼠背部皮下培養(yǎng)。結(jié)果表明培養(yǎng)組織的大體形態(tài)與正常椎間盤相似；組織學(xué)結(jié)果表明培養(yǎng)組織外周的類纖維環(huán)組織多含有I型膠原而中央的類髓核組織中多含有II型膠原，這和正常椎間盤組織中的分布特點(diǎn)類似；生化成分檢測結(jié)果表明DNA、GAG以及膠原的含量在16周超過正常組織的50% ;生物力學(xué)檢測結(jié)果表明生成的椎間盤樣組織弾性模量增加了 4倍，仍低于正常的椎間盤組織；該研究培養(yǎng)的椎間盤組織，無論形態(tài)大小還是力學(xué)性能，距離能夠真正臨床應(yīng)用的椎間盤組織相差甚遠(yuǎn)(Mercuri JJj Gill SSj Simionescu DT. Novel tissue-derived biomimetic scaffoldfor regenerating the human nucleus pulposus. J Biomed Mater Res A， 2011， 96(2):422-435.)，但以上研究表明構(gòu)建工程化纖維環(huán)與髓核復(fù)合組織是構(gòu)建一體化椎間盤的可行方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中僅有単一組織工程纖維環(huán)支架或組織工程髓核支架的不足，提供ー種同時(shí)適合纖維環(huán)細(xì)胞和髓核細(xì)胞生長要求的生物組織工程纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架及其制備方法。本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的?！N纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架，包括纖維環(huán)和髓核，該雙相支架的外周是松質(zhì)骨制備的脫細(xì)胞脫鈣骨基質(zhì)明膠，中央是髓核組織制備的脫細(xì)胞髓核基質(zhì)。
所述纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架，所述的松質(zhì)骨是豬股骨頭松質(zhì)骨。所述纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架，所述的髓核組織是豬尾髓核。一種纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架的構(gòu)建方法，其是以下步驟構(gòu)建的
a、制備脫細(xì)胞脫鈣骨基質(zhì)明膠纖維環(huán)
取豬股骨頭松質(zhì)骨，修整成纖維環(huán)形狀后，依次在室溫條件下進(jìn)行脫細(xì)胞脫鈣處理
(1)、用體積比為1:1的氯仿 甲醇混合液與松質(zhì)骨按lg/30ml的比例浸泡24h；
(2)、用0. 6mol/L 的 HCl 浸泡 48h ；
(3),2mmol/L CaCl2 浸泡 Ih ；
(4),0.5 mmol/L こニ胺四こ酸(EDTA)浸泡 Ih ；
(5)、8mmol/L 的 LiCl 浸泡 Ih ；
(6),5%Triton X-100 浸泡 24h ；
(7)、去離子水反復(fù)沖洗，即得；
b、制備脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲懸液
(1)、將豬尾椎間盤髓核組織放入含0.6%TritonX-100和1. 0%脫氧膽酸的Tris — HCL緩沖液中，超聲頻率42 kHz±6%，處理10分鐘，過濾去除骨屑雜質(zhì)；
(2)、放入含0.6%TritonX-100和1. 0%脫氧膽酸的Tris — HCL緩沖液中，室溫持續(xù)震蕩72h，150r/min,每隔24h換液一次、超聲10分鐘，去離子水沖洗干凈；
(3)、將髓核組織用含720mU/mLDNase I和720mU/mL RNase A的PBS消化液37°C消化48小時(shí)，去離子水沖洗干凈；
(4)、粉碎、梯度離心，取直徑為IOOnm 5iim左右的髓核基質(zhì)微絲，蒸餾水反復(fù)沖洗，按重量百分比與雙蒸水配成0. 5% 5%的白色乳懸液；
c、支架構(gòu)建和交聯(lián)
將脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲懸液注入到脫細(xì)胞脫鈣骨基質(zhì)明膠纖維骨環(huán)中央，滲透深度
0.5 2mm，-2(TC _80°C，I 48小時(shí)冷凍凍干后，構(gòu)成脫細(xì)胞髓核基質(zhì)，先行紫外線照射交聯(lián)，紫外線波長258nm,距離光源5 IOcm,交聯(lián)時(shí)間12 48h ;然后化學(xué)試劑交聯(lián),濃度為0. 001 IM的碳化ニ亞胺(EDAC) 14mM與濃度為0. 001 IM的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 5. 5 mM混合的水溶液中交聯(lián)Ih 48h，再次凍干，消毒即得。所述纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架的構(gòu)建方法，其化學(xué)試劑交聯(lián)是由濃度為
0.01 0. 3M的碳化ニ亞胺(EDAC) 14mM與濃度為0. 005 0. 2M的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)5. 5 mM混合的水溶液。這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明主要優(yōu)點(diǎn)如下
①所采用的材料豬股骨頭松質(zhì)骨及豬尾椎間盤髓核均屬于天然生物材料，具有良好的生物相容性和可降解性,且材料來源廣泛,可供批量生產(chǎn)。②通過脫細(xì)胞系列處理去處抗原成分，避免發(fā)生免疫排斥反應(yīng)、傳播疾病。③通過調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞外基質(zhì)微絲懸液的濃度及冷凍凍干時(shí)冷凍溫度、降溫速率等因素，控制多孔支架的微結(jié)構(gòu)，制備出具有適宜孔徑和孔隙率的三維多孔支架。④通過控制交聯(lián)時(shí)間或交聯(lián)劑濃度，調(diào)節(jié)多孔支架的生物力學(xué)特性和降解速率，使組成結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能與椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)相似。⑤可塑性好，制備エ藝簡單，可利用CAD設(shè)計(jì)和制造技術(shù)制備與退變椎間盤的形狀、大小相同的雙相支架材料，可用于構(gòu)建組織工程椎間盤修復(fù)椎間盤退變，具有良好的臨床應(yīng)用前景，個(gè)體化應(yīng)用于病人。


圖1是本發(fā)明的立體結(jié)構(gòu)示意 圖2是本發(fā)明的平面結(jié)構(gòu)示意 圖3是本發(fā)明纖維環(huán)相支架HE染色無細(xì)胞及細(xì)胞碎片殘留 圖4是本發(fā)明髓核相支架HE染色無細(xì)胞及細(xì)胞碎片殘留 圖5是光鏡下纖維環(huán)相支架呈三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 圖6是掃描電鏡下纖維環(huán)相支架呈三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 圖7是光鏡下脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲相互連接成網(wǎng)結(jié)構(gòu) 圖8是掃描電鏡下脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲相互連接成網(wǎng)結(jié)構(gòu) 圖9是光鏡下一體化支架結(jié)合部連接緊密30倍 圖10是掃描電鏡一體化支架結(jié)合部連接緊密100倍 圖11是MTT檢測不同濃度浸提液培養(yǎng)下脂肪干細(xì)胞的增殖 圖12是Live/Dead染色脂肪干細(xì)胞在纖維環(huán)相支架上分布 圖13是Live/Dead染色脂肪干細(xì)胞在髓核相支架上分布圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。 1、制備脫細(xì)胞脫鈣骨基質(zhì)明膠環(huán)
以新鮮豬股骨頭松質(zhì)骨為原料，修整制成外徑10_、內(nèi)徑5_、厚3_的中空骨環(huán),在室溫條件下進(jìn)行脫細(xì)胞脫鈣處理，流程如下①用體積比為1:1的氯仿甲醇混合液1500ml加入松質(zhì)骨 50g，浸泡 24h 0. 6mol/L 的 HCl 浸泡 48h 2 mmol/L CaCl2 處理 Ih 0. 5mmol/Lこニ胺四こ酸(EDTA)進(jìn)行浸泡處理Ih !⑤8 mmol/L的氯化鋰(LiCl)處理Ih !⑥用5% Triton-100浸泡處理24h ;⑦去離子水反復(fù)沖洗,備用。2、制備脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲懸液
收集豬尾巴中的髓核組織，參考Mercuri的方法對(duì)髓核組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理(參見Mercuri JJ, Gill SS, Simionescu DT. Novel tissue-derived biomimetic scaffoldfor regenerating the human nucleus pulposus. J Biomed Mater Res A, 2011, 96(2):422-35.)。操作方法如下①將新鮮豬尾椎間盤髓核組織放入含0. 6%TritonX-100去垢劑和1. 0%脫氧膽酸的Tris — HCL緩沖液中，超聲10分鐘(42 kHz±6%)，過濾去除骨屑等雜質(zhì)?、趯⑺韬私M織放入含0. 6%TritonX-100和1. 0%脫氧膽酸的Tris — HCL緩沖液中，室溫持續(xù)震蕩72h (150r/min)，每隔24h換液一次、超聲10分鐘(42 kHz ±6%)去除細(xì)胞成分，去離子水沖洗干凈；③將髓核組織用含720mU/mL DNase I和720mU/mL RNase A的PBS消化液37°C消化48小時(shí)，去離子水沖洗干凈；@粉碎、梯度離心，取直徑為IOOnm 5iim左右的髓核基質(zhì)微絲，蒸餾水反復(fù)沖洗，按重量比配成3%的白色乳懸液，即得。本發(fā)明采用性質(zhì)比較溫和的去垢劑Triton X — 100對(duì)天然骨進(jìn)行脫細(xì)胞處理，去除了天然骨的細(xì)胞成分但沒有改變骨組織的天然結(jié)構(gòu)。
3、纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架的構(gòu)建和交聯(lián)
將脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲懸液充分混勻后注入到脫細(xì)胞脫鈣骨基質(zhì)明膠環(huán)中央(見圖1)，控制脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲懸液滲入深度保持在0. 5 2mm，一 20°C冷凍，使其完全凝固，構(gòu)成脫細(xì)胞髓核基質(zhì)，然后將樣品放入冷凍凍干機(jī)內(nèi)，冷凍干燥24小時(shí)以上；再用258nm紫外線，距離光源5cm照射24h，然后浸入濃度為14mM的碳化ニ亞胺(EDAC)及濃度為5. 5mMN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的水溶液交聯(lián)24h，PBS沖洗3遍后將支架冷凍凍干，消毒，得雙相支架(見圖2)。4、雙相支架的組織學(xué)及電鏡觀察
圖3是本發(fā)明纖維環(huán)相支架HE染色放大100倍無細(xì)胞及細(xì)胞碎片殘留圖，圖4是本發(fā)明髓核相支架染色放大200倍無細(xì)胞及細(xì)胞碎片殘留圖，
HE染色可見支架均質(zhì)紅染，外層的脫細(xì)胞脫鈣骨基質(zhì)明膠和中央的脫細(xì)胞髓核基質(zhì)均 無細(xì)胞殘留。圖5是光鏡下纖維環(huán)相支架呈三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)30倍放大圖，圖6是掃描電鏡下纖維環(huán)相支架呈三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)80倍放大圖，光鏡及掃描電鏡可見脫細(xì)胞脫鈣骨基質(zhì)明膠呈三維立體多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙相互貫通。圖7是光鏡下脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲相互連接成網(wǎng)結(jié)構(gòu)40被放大圖，圖8是掃描電鏡下脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲相互連接成網(wǎng)結(jié)構(gòu)100倍圖，脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。圖9是光鏡下一體化支架結(jié)合部連接緊密30倍圖，圖10是掃描電鏡一體化支架結(jié)合部連接緊密100倍圖，結(jié)合部連接緊密。5、支架的生物相容性
通過3-(4，5- ニ甲基噻唑-2)-2，5- ニ苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測支架浸提液對(duì)細(xì)胞的毒性將脂肪干細(xì)胞(ADSCs)分別用25%、50%、100%濃度的浸提液以及含10%胎牛血清FBS的培養(yǎng)(FBS)基培養(yǎng)，于第1、2、3、4、5、6天通過MTT檢測脂肪干細(xì)胞的生長情況。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)四組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明支架無毒性，圖11是MTT檢測不同濃度浸提液培養(yǎng)下脂肪干細(xì)胞的增殖圖。Live/Dead檢測細(xì)胞在支架上的生長情況將ADSCs接種到消毒后的一體化支架上，培養(yǎng)3天后加入Live/Dead染液，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞在支架上黏附與生長情況(綠色代表活細(xì)胞，紅色代表死細(xì)胞)?？梢娂?xì)胞均勻的分布在纖維環(huán)相支架和髓核相支架上，生長狀況良好，無死細(xì)胞。圖12是Live/Dead染色脂肪干細(xì)胞在纖維環(huán)相支架上分布100倍圖，圖13是Live/Dead染色脂肪干細(xì)胞在髓核相支架上分布100倍圖。
權(quán)利要求
1.一種纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架，其特征在于該雙相支架的外周是松質(zhì)骨制備的脫細(xì)胞脫鈣骨基質(zhì)明膠環(huán)，中央是髓核組織制備的脫細(xì)胞髓核基質(zhì)。
2.按照權(quán)利要求1所述纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架，其特征在于所述的松質(zhì)骨是豬股骨頭松質(zhì)骨。
3.按照權(quán)利要求1所述纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架，其特征在于所述的髓核組織是豬尾髓核。
4.如權(quán)利要求1所述一種纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架的構(gòu)建方法，其是以下步驟構(gòu)建的 a、制備脫細(xì)胞脫鈣骨基質(zhì)明膠環(huán) 取豬股骨頭的松質(zhì)骨，修整成纖維環(huán)形狀后，依次在室溫條件下進(jìn)行脫細(xì)胞脫鈣處理 (1)、用體積比為1:1的氯仿甲醇混合液與松質(zhì)骨按lg/30ml的比例浸泡24h；(2)、用O. 6mol/L 的 HCl 浸泡 48h ；(3),2mmol/L CaCl2 浸泡 Ih ；(4),0.5 mmol/L EDTA 浸泡 Ih ；(5)、8mmol/L 的 LiCl 浸泡 Ih ；(6),5%Triton X-100 浸泡 24h ； (7)、去離子水反復(fù)沖洗，即得； b、制備脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲懸液 (1)、將豬尾椎間盤髓核組織放入含O.6%TritonX-100和1. 0%脫氧膽酸的Tris — HCL緩沖液中，超聲頻率42 kHz±6%，處理10分鐘，過濾去除骨屑雜質(zhì)； (2)、放入含O.6%TritonX-100和1. 0%脫氧膽酸的Tris — HCL緩沖液中，室溫持續(xù)震蕩72h，150r/min,每隔24h換液一次、超聲10分鐘，去離子水沖洗干凈； (3)、將髓核組織用含720mU/mLDNase I和720mU/mL RNase A的PBS消化液37°C消化48小時(shí)，去離子水沖洗干凈； (4)、粉碎、梯度離心，取直徑為IOOnm 5μπι左右的髓核基質(zhì)微絲，蒸餾水反復(fù)沖洗，與雙蒸水按重量百分比配成O. 5% 5%的白色乳懸液； c、支架構(gòu)建和交聯(lián) 將脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲懸液注入到脫細(xì)胞脫鈣骨基質(zhì)明膠環(huán)中央，滲透深度O. 5 2mm，-20°C _80°C，I 48小時(shí)冷凍凍干后構(gòu)成脫細(xì)胞髓核基質(zhì)，先行紫外線照射交聯(lián)，紫外線波長258nm，距離光源5 10cm，交聯(lián)時(shí)間12 48h ;然后化學(xué)試劑交聯(lián)，濃度為O.001 IM的碳化二亞胺與濃度為O. 001 IM的N-羥基琥珀酰亞胺混合的水溶液中交聯(lián)Ih 48h，再次凍干，消毒即得。
5.按照權(quán)利要求4所述纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架的構(gòu)建方法，其特征在于化學(xué)試劑交聯(lián)是由濃度為O. 01 O. 3M的碳化二亞胺與濃度為O. 005 O. 2M的N-羥基琥珀酰亞胺混合的水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種纖維環(huán)與髓核一體化復(fù)合雙相支架及其構(gòu)建方法，屬于生物組織工程技術(shù)。本發(fā)明用豬松質(zhì)骨制備出外層為脫細(xì)胞脫鈣骨基質(zhì)明膠環(huán)，用豬尾椎間盤髓核組織制備中央為脫細(xì)胞髓核基質(zhì)，冷凍凍干后依次經(jīng)紫外線照射交聯(lián)和化學(xué)試劑EDAC及NHS交聯(lián)，將兩種材料復(fù)合而成。這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明，生物相容性好，避免發(fā)生免疫排斥反應(yīng)；組成結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能與人椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)相似；且材料來源廣泛，成本低，制備工藝簡單，可用于構(gòu)建組織工程椎間盤修復(fù)椎間盤退變，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61L27/22GK103007351SQ20131000072
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2013年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月5日
發(fā)明者楊強(qiáng), 徐寶山, 許海委, 馬信龍, 李秀蘭, 夏群, 張春秋 申請(qǐng)人:天津市天津醫(yī)院