專利名稱：仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑及其制備工藝。
背景技術(shù)：
仔豬大腸桿菌腹瀉發(fā)病急、病死率高達(dá)90%。仔豬一旦發(fā)病，就來不及治療就大批死亡。青霉素發(fā)現(xiàn)80多年以來，陸續(xù)研發(fā)出了大量的抗生素和人工合成化學(xué)藥品。這些藥品的發(fā)明和應(yīng)用，使臨床常見的細(xì)菌性感染和病死率大幅下降，也包括仔豬大腸桿菌腹瀉病。但是隨著這些藥物的頻繁使用和長期大劑量地使用，細(xì)菌獲得了耐藥性，存在于細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子中的耐藥基因就可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合和轉(zhuǎn)座等方式，將抗性能基因傳播到其它敏感菌，使之成為抗藥菌株，給人類進(jìn)一步預(yù)防控制傳染病帶來了嚴(yán)重的威脅。 我國畜牧業(yè)空前發(fā)展，畜產(chǎn)品總量多年來一直居于全球之首。其中，豬的年飼養(yǎng)量達(dá)10億多頭。由此刺激了獸藥市場達(dá)到了前所未有的空前發(fā)展。獸藥的主要用途是防治畜禽感染性疾病，約占60%以上，據(jù)估測年應(yīng)用抗感染藥物在I萬噸以上。隨著我國人口的不斷增長，畜產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)入國際市場，進(jìn)一步加大了畜禽生產(chǎn)規(guī)模，賦予了獸藥的進(jìn)一步興旺發(fā)展。可是，長期、大劑量地使用抗生素和人工合成化學(xué)藥品致使動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生了對(duì)藥物有對(duì)抗作用的致病菌，進(jìn)而污染了畜產(chǎn)品；同時(shí)這些獸藥殘留在畜禽產(chǎn)品中，通過食物鏈傳給人，造成人類疾病。這些事實(shí)引起了人們的極度恐惶和高度重視。全球各國政府制定了一系列的在畜禽生產(chǎn)中禁用和限用抗生素和抗菌、抗病毒化學(xué)藥品的政令，拒絕進(jìn)口含藥殘和病原的畜產(chǎn)品，直接抑制了獸藥市場的發(fā)展。目前應(yīng)用于抗仔豬大腸桿菌腹瀉的藥品有各種大腸桿菌疫苗、抗生素、化學(xué)合成藥品、中藥及其制劑和免疫球蛋白及血清免疫球蛋白制劑以及其他抗感染的生物因子制劑。(一)大腸桿菌疫苗目前，主要有仔豬大腸桿菌病三價(jià)滅活疫苗、大腸桿菌K88、K99、987P三價(jià)基因疫苗、K88-ST1-LTB三價(jià)滅活疫苗、K88ac-ST1-LTB三價(jià)基因工程菌苗等。這些疫苗主要用于預(yù)防仔豬大腸埃希氏菌腹瀉(仔豬黃痢和白痢)，用于妊娠母豬免疫，使新生仔豬通過母乳獲得被動(dòng)免疫。但是，在許多情況下由于母豬體質(zhì)和仔豬體弱等原因，導(dǎo)致被動(dòng)免疫失敗，而致仔豬大腸桿菌腹瀉爆發(fā)。(二)抗生素這類抗感染藥物主要是由細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物所產(chǎn)生的代謝物，以及人工仿制合成或半合成的抗生物質(zhì)。它們對(duì)病原微生物的抑制或殺滅作用強(qiáng)，抗菌譜廣，療效好，廣泛地應(yīng)用于人類和動(dòng)物疾病防治。但是，它們毒副作用大，如天然青霉素(青霉素G)、半合成青霉素(氨芐青霉素、阿莫西林)、頭孢菌素等極易發(fā)生過敏反應(yīng)，鏈霉素、丁胺卡那霉素、慶大霉素、小諾霉素、卡那霉素等極易引起腎臟和第八對(duì)腦神經(jīng)損害以及對(duì)胎兒和嬰幼兒的致殘作用，土霉素、四環(huán)素、金霉素、多粘菌素E、桿菌肽等造成肝、腎損害，林可霉素、氯霉素等對(duì)造血機(jī)能也有不良影響(詳見中國藥典)。
(三)化學(xué)合成藥品這類抗感染藥物主要包括磺胺類、喹諾酮類、呋喃類等。它們抗菌譜廣，性質(zhì)穩(wěn)定，療效確切，使用簡便。但是，具有毒副作用大，易殘留于體內(nèi)，造成肝、腎等組織不可逆的損害(詳見中國藥典)。以上兩類藥物除了上述缺點(diǎn)外，它們共同的弊端還有干擾機(jī)體正常菌群，破壞機(jī)體微生態(tài)平衡，導(dǎo)致微生物菌群失調(diào)移位，造成二重感染和其它病變；再者，大劑量反復(fù)使用都可以導(dǎo)致耐藥性，降低治療效果，使其抗感染的敏感率下降至10-15%，并誘生出高致病性菌株。所以，世界各國紛紛制定了一系列政策，禁止在動(dòng)物生產(chǎn)中使用這兩類藥物，延長它們對(duì)人類疾病的醫(yī)療壽命，但這只是個(gè)揚(yáng)湯止沸的辦法。(四)中藥及其制劑中藥屬天然藥物，具有無害優(yōu)勢(shì)的特點(diǎn)，扶正祛邪、整體調(diào)整和無耐藥性，是抗菌 素和化學(xué)合成藥品無法比擬的，從而引起了西方發(fā)達(dá)國家的廣泛重視。目前，市場上也有許多抗感染的中藥制劑如板蘭根沖劑、雙黃連口服液、穿心蓮注射液等。雖然這些藥物抗菌譜廣，但由于藥效慢、作用弱、用量大、質(zhì)量難以穩(wěn)定以至使用不方便等因素，因此在臨床應(yīng)用上受到了極大的限制。(五)免疫球蛋白和血清免疫球蛋白制劑這類抗感染藥物來自特制的動(dòng)物血清和血清免疫球蛋白。它們作用速度快，療效準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)，但抗菌面狹窄，對(duì)混合感染和繼發(fā)感染無效，有時(shí)不得不用上述三類藥物輔助治療；再者，它們屬活性蛋白質(zhì)，必須低溫保存，在貯運(yùn)和使用過程中很容易變性失活，失去醫(yī)療價(jià)值。因此，這些抗感染制劑在藥品市場上難以操作而失去了商品意義，進(jìn)而影響到了臨床應(yīng)用。(六)其他抗感染的生物因子制劑比如干擾素、細(xì)胞因子等，由于價(jià)格昂貴，很難被臨床廣泛接受，至于在動(dòng)物傳染病中使用更難推行。21世紀(jì)將是一個(gè)“綠色”的世紀(jì)。綠色產(chǎn)品的開發(fā)是我國政府針對(duì)健康、環(huán)境、資源等問題而采取的“組織行為”，是對(duì)全球經(jīng)濟(jì)和社會(huì)持續(xù)發(fā)展作出的貢獻(xiàn)。綠色產(chǎn)品將成為消費(fèi)的主導(dǎo)潮流。隨著全球環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，人們價(jià)值觀念的轉(zhuǎn)變，崇尚自然、注重安全、追求健康的思想將首先影響人們的消費(fèi)行為。消費(fèi)觀念和消費(fèi)行為的轉(zhuǎn)變又直接影響國際貿(mào)易政策，使“綠色壁壘”成為新的主要貿(mào)易壁壘。各國政府，尤其是歐、美、日等發(fā)達(dá)國家對(duì)食品中的農(nóng)藥、獸藥殘留量以及其它有毒、有害物質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定到了近乎苛求的地步。從1992年起，日本對(duì)進(jìn)口畜禽實(shí)施新的“食品衛(wèi)生檢查制度”，其衛(wèi)生檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)大部分高于世界一般標(biāo)準(zhǔn)，并要求完全杜絕抗生素、磺胺等抗菌劑和農(nóng)藥的殘留。德國、英國、法國、澳大利亞等國家也制定了各自的各類獸藥在不同食品中的殘留標(biāo)準(zhǔn)。所以，市場在強(qiáng)烈呼喚一種純天然、無藥殘、無公害、無耐藥性、無毒副作用的環(huán)保型綠色抗感染藥物的誕生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服已有技術(shù)的缺點(diǎn)，提出一種仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑，該制劑具有更高的穩(wěn)定性，對(duì)大腸桿菌的抑殺作用更加持久充分，抗感染效果更加顯著，而且是一種純天然、無藥殘、無公害、無耐藥性、無毒副作用的環(huán)保型綠色抗感染藥物。本發(fā)明還提供所述制劑的制備方法。本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)提供一種仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑，它由以下重量份的組分組成糖萜素5. (Γ55. 0，莨菪堿O. 005^0. 01，血清免疫球蛋白55. (Γ95. O。本發(fā)明優(yōu)選的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白 制劑由以下重量份的組分組成糖萜素10. 0 35· 0，莨菪堿O. 005 O. 01，血清免疫球蛋白60. 0 90· O。本發(fā)明最優(yōu)選的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑由以下重量份的組分組成糖萜素12.0，莨菪堿O. 008，血清免疫球蛋白88.0。所述的糖萜素中，按重量百分比計(jì)，糖類含量彡30%，三萜皂甙含量彡30%;所述的糖萜素可以是各種從植物中提取的糖類和三萜皂甙組成的純天然植物提取物；本發(fā)明優(yōu)選的糖萜素中，糖類和三萜皂甙都是從以下重量份的中藥材中提取的白術(shù)3(Γ50，蒼術(shù)20 40，木香15 20，澤瀉10 15。所述的糖類提取方法可以是現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法，也可以是本發(fā)明所優(yōu)選的以下提取方法a、按重量份比例取白術(shù)30 50、蒼術(shù)20 40、木香15 20和澤瀉10 15后切碎、洗凈，用冷水浸泡2小時(shí)至藥心充分浸透，再加入中藥總重量12倍的水，加熱至沸騰后在90°C的情況下，在熱回流濃縮工藝下煎煮180分鐘同時(shí)濃縮得到濃縮藥液I ;b、將步驟a制備的濃縮藥液，經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄去沉淀物，獲得上清液并經(jīng)負(fù)壓濃縮，使其形成干物質(zhì)為25%的濃縮藥液II ；C、將步驟b得到的濃縮藥液II加4-8倍(體積)的95%的乙醇，靜置過夜，棄去上清液，沉淀物除去乙醇后加水溶解并通過100KD濾膜過濾，除去雜蛋白、內(nèi)毒素等大分子雜質(zhì)，收集濾過液再通過IKD納濾膜過濾，除去有機(jī)小分子和無機(jī)分子及離子等雜質(zhì)，被截留的物質(zhì)稀釋后逆向水流透析24小時(shí)，然后取出濃縮至相對(duì)密度為1. 0Γ1. 18克/毫升，再加5倍(體積)量99%乙醇沉淀，攪拌，靜置過夜，3000-5000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；沉淀物除去乙醇并經(jīng)過噴霧干燥，即可制得。所述的三萜皂甙提取方法可以是現(xiàn)有技術(shù)中的多種方法，也可以是本發(fā)明所優(yōu)選的以下提取方法1.按重量份比例取白術(shù)30 50、蒼術(shù)20 40、木香15 20和澤瀉10 15后切碎、洗凈，用乙醇或甲醇提取，回收溶劑，取殘?jiān)炗盟芙饣蚧鞈抑瞥伤芤?；i1、往步驟i制成的水溶液中加入石油醚或乙醚，將水溶液中的親脂物質(zhì)色素和油質(zhì)回收，把三萜皂甙留在水溶液中；ii1、往ii步制得的水溶液中加入親水性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑丁醇，溶液中親水性較強(qiáng)的物質(zhì)繼續(xù)留在水溶液中，三萜皂甙轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑萃取液中，收集有機(jī)溶劑萃取液，減壓干燥，制得粗制的三萜皂甙；iv、將iii步制得的粗制三萜皂甙溶于乙醇或甲醇中，再逐漸滴加乙醚、丙酮或乙醚-丙酮(體積1:1)的混合液，至三萜皂甙從溶液中析出為止，將析出的三萜皂甙干燥即可制得。本發(fā)明制劑組分中，莨菪堿可以是現(xiàn)有的各種以莨菪堿為主要成分的產(chǎn)品；本發(fā)明優(yōu)選從洋金花中提取的莨菪堿。本發(fā)明優(yōu)選的莨菪堿可以通過多種方法從洋金花中提取，優(yōu)選的提取方法如下按重量份計(jì)，取洋金花I份，用30份pH2 3的乙醇滲濾，取滲濾液回收蒸干溶劑，把醇浸膏加水熱溶，調(diào)整PH值至2 3，濾過，取酸溶液，加入石油醚脫脂，再次獲取酸水溶液，氨水調(diào)PH值至10，用氯仿萃取，將氯仿萃取液取出，回收氯仿，取萃取余液加于陽離子交換樹脂柱上，先以水洗脫除雜，再用O. 59Γ15%酸液洗脫，收集洗脫液，加堿中和，經(jīng)脫鹽處理，即得莨菪喊。本發(fā)明制劑中的血清免疫球蛋白可以是現(xiàn)有技術(shù)中經(jīng)過仔豬大腸埃希氏菌病三價(jià)滅活疫苗(ETEC Κ88 Κ99 987Ρ)(中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)K二 00—年版3第40頁)多次強(qiáng)化免疫健康育肥豬后的高免豬血清中提純制備的。本發(fā)明的血清免疫球蛋 白優(yōu)選按照以下方法制得1.按照常規(guī)方法制備仔豬大腸埃希氏菌高免豬血清1.1無特定病原體健康育肥豬在潔凈養(yǎng)殖場隔離飼養(yǎng)；1. 2對(duì)步驟1.1飼養(yǎng)的健康育肥豬進(jìn)行3次免疫，每次給每頭豬注射仔豬大腸埃希氏菌病三價(jià)滅活疫苗(ETEC Κ88 Κ99 987Ρ)，注射量分別為5 8頭份、5頭份和10頭份，每次免疫間隔一周時(shí)間；1. 3第三次免疫后21天，收集豬血清，對(duì)血清中的血清免疫球蛋白進(jìn)行免疫學(xué)檢測，ETEC Κ88 Κ99 987Ρ的血清免疫球蛋白的微量凝集效價(jià)為1:64 1:128以上后，此豬血清即為仔豬大腸埃希氏菌高免豬血清，收集貯存在16°C條件下備用，如果檢測不合格，按照第三次免疫劑量重新免疫，直至檢測合格；2.按照常規(guī)方法采集豬血、分離血清并提純血清免疫球蛋白。所述的分離和提純的具體方法可以參考中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院等主編的《獸醫(yī)微生物學(xué)》，中國農(nóng)業(yè)出版社，1998年12月第I版，第656頁。本發(fā)明提供的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑，是在現(xiàn)代分子免疫學(xué)、現(xiàn)代內(nèi)分泌神經(jīng)學(xué)和中醫(yī)學(xué)相結(jié)合的基礎(chǔ)上，利用分子間氫鍵結(jié)構(gòu)理論和受體學(xué)說，把糖萜素、莨菪堿、血清免疫球蛋白三者混合以后經(jīng)過低溫干燥而得。本發(fā)明配方中，糖萜素是主要成分之一，是富含羥基的一種物質(zhì)，相互間可以構(gòu)建多維網(wǎng)絡(luò)空間氫鍵結(jié)構(gòu)，在血清免疫球蛋白表面形成假性水化膜。氫鍵假性水化膜的存在直接影響了血清免疫球蛋白分子的外表結(jié)構(gòu)、構(gòu)象、性質(zhì)與功能等。通過這種多維網(wǎng)絡(luò)空間氫鍵假性水化膜實(shí)現(xiàn)糖萜素對(duì)血清免疫球蛋白的保護(hù)作用，主要體現(xiàn)在提高了血清免疫球蛋白抵抗高溫、紫外線等誘導(dǎo)變性的性能；糖萜素在動(dòng)物體內(nèi)還通過特有的方式增強(qiáng)免疫原的免疫效果，起到免疫增強(qiáng)劑的作用。研究證明，糖萜素在本發(fā)明的制劑配方中的用量應(yīng)在5.(Γ55.0。本發(fā)明采用的中藥配方提取的制備的糖萜素，由于采用了傳統(tǒng)中醫(yī)藥“辯證施治”的理論，將健脾君藥的白術(shù)、燥濕臣藥的蒼術(shù)、祛濕輔藥的澤瀉和理氣使藥的木香配伍組成藥方制得，因而在具備蛋白保護(hù)劑作用的基礎(chǔ)上，更有增強(qiáng)本制劑治療大腸桿菌病引起的腹瀉作用。血清免疫球蛋白是本發(fā)明配方中的第二個(gè)主要成分之一。它是本發(fā)明配方中的特效成分，直接針對(duì)病原微生物起到抑殺作用。研究證明，血清免疫球蛋白在仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑配方中的用量應(yīng)在55. (Γ95. O。莨菪堿是本發(fā)明配方中的第三個(gè)主要成分，它是本發(fā)明配方中的特效成分，是一種植物次生代謝物，它在仔豬腸道內(nèi)可以與腸壁的乙酰膽堿受體相結(jié)合，適度降低腸道蠕動(dòng)頻率，使糖萜素和血清免疫球蛋白充分與腸道中的大腸桿菌相互作用，實(shí)現(xiàn)有效抑殺大腸桿菌達(dá)到防治仔豬大腸桿菌腹瀉的目的。研究證明，莨菪堿在本發(fā)明的制劑配方中的用量應(yīng)在O. 005 O. 01。本發(fā)明還提供所述的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑的制備方法，包括以下步驟按照重量份比例計(jì)，將糖萜素5. (Γ55. O、血清免疫球蛋白55. (Γ95. O和莨菪堿O. 005、. 01混合，加無菌去離子水稀釋，經(jīng)勻漿、乳化、過濾后，采用冷凍干燥，即制成。所述的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑的制備方法，優(yōu)選包括以下步驟按照重量份比例計(jì)，將糖萜素5. (Γ55. O、血清免疫球蛋白55. (Γ95. O和莨菪堿 O. 005 O. 01混合，加無菌去離子水稀釋，使每毫升溶液中ETEC K88 K99 987P的血清免疫球蛋白的微量凝集效價(jià)達(dá)到> 1:512以上，然后置于真空冷凍干燥機(jī)中，在_40°C下冷凍干燥21小時(shí)，而后每小時(shí)升溫3°C左右，經(jīng)12 18小時(shí)的真空干燥至25°C完成干燥，密封，在25°C環(huán)境中保持3飛小時(shí)，即為成品。本發(fā)明所述的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下物理性狀本品為棕色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。無菌檢驗(yàn)按中華人民共和國獸藥典要求進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。安全檢驗(yàn)取凍干的瓶裝本制劑，用生理鹽水還原稀釋至每毫升I頭份，選體重18^22克小白鼠5只，各內(nèi)服本制劑稀釋液O. 2毫升，體重1. 5^2. O公斤家兔2只，各內(nèi)服本制劑稀釋液10毫升，體重35(Γ400克豚鼠2只，各內(nèi)服本制劑稀釋液5毫升，觀測10日，均應(yīng)健活。效力檢驗(yàn)用體重2 4公斤同來源無豬大腸桿菌Κ88Κ99 987Ρ血清免疫球蛋白的豬7頭，分2組第一組4頭，按每頭I頭份口服本制劑稀釋液(同安全檢驗(yàn)項(xiàng))，同時(shí)口服仔豬大腸埃希氏菌I毫升，2 3億個(gè)菌I毫升。第二組3頭，僅口服仔豬大腸埃希氏菌I毫升，2 3億個(gè)菌I暈升作為對(duì)照。對(duì)照豬應(yīng)于口服仔豬大腸埃希氏菌后21小時(shí)內(nèi)體溫上升，隨之呈現(xiàn)典型的仔豬大腸桿菌性腹瀉癥狀，并于廣3日內(nèi)至少有2頭死于急性仔豬大腸桿菌性腹瀉病。第一組的4頭豬，觀測5 10日，至少健活3頭為合格。效價(jià)測定供試樣品血清免疫球蛋白的制備精密量取制劑稀釋液(同安全檢驗(yàn)項(xiàng))1毫升，放入離心管中，再加氯仿4ml，充分混勻，靜置I小時(shí)后，5000轉(zhuǎn)/分、離心30分鐘，取上清液即得。用微量凝集法(MAT法)檢驗(yàn)ETEC K88、K99、987P的血清免疫球蛋白效價(jià)應(yīng)^ 1:128。MAT法ETEC K88、K99、987P標(biāo)準(zhǔn)凝集抗原制備應(yīng)用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)Κ88、Κ99、987Ρ標(biāo)準(zhǔn)菌株，收獲菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)后滅活，用滅菌生理鹽水反復(fù)洗滌3次(3000rpm離心5分鐘)，最后一次離心獲得的菌體沉淀，按照菌體計(jì)數(shù)結(jié)果稀釋為20億菌體/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)凝集抗原進(jìn)行微量凝集實(shí)驗(yàn)。
供試樣品按下表稀釋并操作。
孔號(hào)試 12345 67_9_10
樣品稀釋倍數(shù)1:2 1:4 1:8 1:161:32 1:64 1:128 陽性血清明性血清
生理鹽水 pL501 501 50 50 I 50 I 501 5015050
樣品溶液 pL50 ~^0 才0^50 棄 50
標(biāo)準(zhǔn)抗原 μ sJO 50 50 5050 50 50 5050振蕩微量知集板，使待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)抗原均勻混合，然后將微量凝集板置于37°C 作用4-6小時(shí)后觀察結(jié)果。結(jié)果判定，以50%菌體凝集的血清免疫球蛋白最高稀釋倍數(shù)為該菌毛血清免疫球蛋白的效價(jià)。作用和用途用于預(yù)防和治療仔豬黃白痢。用法和用量1、預(yù)防用量初生仔豬I小時(shí)內(nèi)口服本制劑稀釋液(同安全檢驗(yàn)項(xiàng))Γ2頭份。2、治療劑量每頭I頭份，首次用量可加倍，I日2 3次，3日I個(gè)療程。貯藏室溫，陰涼，干燥，通風(fēng)，有效期36月。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑具有以下幾方面有益效果一、穩(wěn)定性顯著提高，更便于制劑的加工、儲(chǔ)存和運(yùn)輸本發(fā)明制劑是糖萜素和血清免疫球蛋白通過分子間力(主要是范德華力及氫鍵等)有機(jī)結(jié)合的產(chǎn)物，是將血清免疫球蛋白的特異免疫性和糖萜素的非特異免疫性以及它們對(duì)機(jī)體自身抗病能力的調(diào)理作用完美地結(jié)合起來的產(chǎn)物。血清免疫球蛋白和糖萜素兩者結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)、功能互補(bǔ)，相得益彰。本發(fā)明制劑中，所述糖萜素是富含羥基的一種物質(zhì)，它們相互間可以構(gòu)建多維網(wǎng)絡(luò)空間氫鍵結(jié)構(gòu)，在血清免疫球蛋白表面形成假性水化膜。氫鍵假性水化膜的存在直接影響了血清免疫球蛋白分子的外表結(jié)構(gòu)、構(gòu)象、性質(zhì)與功能等。通過這種多維網(wǎng)絡(luò)空間氫鍵結(jié)構(gòu)假性水化膜實(shí)現(xiàn)糖萜素對(duì)血清免疫球蛋白的保護(hù)作用，主要體現(xiàn)在提高了血清免疫球蛋白抵抗高溫、誘導(dǎo)變性的性能。糖職素以氫鍵(hydrogen bonding)粘結(jié)在一起形成多維網(wǎng)絡(luò)空間，為血清免疫球蛋白搭建了大廈居所，血清免疫球蛋白以氫鍵安置在多維網(wǎng)絡(luò)空間內(nèi)，這樣形成了穩(wěn)定、堅(jiān)固的多維網(wǎng)絡(luò)空間氫鍵假性水化膜，很好地保護(hù)血清免疫球蛋白免受外界環(huán)境(高溫或紫外線)的破壞。當(dāng)血清免疫球蛋白在加工制作、干燥和貯運(yùn)時(shí)，糖萜素形成的多維網(wǎng)絡(luò)空間首先接受外界熱能等因子的作用而無序地運(yùn)動(dòng)起來，但是由于多維網(wǎng)絡(luò)空間的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，致使糖萜素分子上的羥基在失水時(shí)能即刻與血清免疫球蛋白表面的氨基和羥基等直接形成氫鍵，導(dǎo)致了整個(gè)分子運(yùn)動(dòng)趨于零，減輕了血清免疫球蛋白分子內(nèi)部次生鍵的振動(dòng)和肽鏈的延伸，保持了血清免疫球蛋白的三位構(gòu)象和生物活性。所以，糖萜素具有蛋白保護(hù)劑的特征，在制劑的加工過程中維護(hù)了血清免疫球蛋白的四級(jí)立體結(jié)構(gòu)形態(tài)，克服血清免疫球蛋白必須在低溫環(huán)境中保存、運(yùn)輸和使用的缺點(diǎn)，因此最有效地拓展了血清免疫球蛋白在臨床實(shí)際中的應(yīng)用范圍，極大地增強(qiáng)了抗體制劑的市場潛在能力。本發(fā)明制劑中糖萜素對(duì)血清免疫球蛋白穩(wěn)定性的改善效果有以下實(shí)驗(yàn)為證糖萜素保護(hù)血清免疫球蛋白熱變性實(shí)驗(yàn)(一)方法I檢驗(yàn)方法微量凝集實(shí)驗(yàn)(MAT)法血清免疫球蛋白溶液制備將高免豬血清消毒，破殼，分離血清，精密量取血清lg，放入離心管中，加滅菌生理鹽水1ml，混勻；再加氯仿4ml，充分震蕩混勻，靜置I小時(shí)后，5000轉(zhuǎn)/分、離心30分鐘，取上清液即得血清免疫球蛋白溶液。ETEC K88、K99、987P標(biāo)準(zhǔn)凝集抗原制備應(yīng)用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)Κ88、Κ99、987Ρ標(biāo)準(zhǔn)菌株，收獲菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)后滅活，用滅菌生理鹽水反復(fù)洗滌3次(3000rpm離心5分鐘)，最后一次離心獲得的菌體沉淀，按照菌體計(jì)數(shù)結(jié)果稀釋為30億菌體/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)凝集抗原 進(jìn)行微量凝集實(shí)驗(yàn)。供試樣品血清免疫球蛋白溶液按表I稀釋并操作。表I供試樣品血清免疫球蛋白溶液的稀釋操作表
權(quán)利要求
1.一種仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑，它由以下重量份的組分組成糖萜素5. 0 55. 0，莨菪堿O. 005 O. 01，血清免疫球蛋白55. 0 95. O。
2.權(quán)利要求1所述的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑，其特征在于，它由以下重量份的組分組成糖萜素10. (Γ35. 0，莨菪堿O. 005、. 01，血清免疫球蛋白60. (Γ90. O。
3.權(quán)利要求1或2所述的任意一種仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑，其特征在于，所述的糖萜素中，按重量百分比計(jì)，糖類含量≥30%，三萜皂甙含量≥30%;所述的糖類和三萜皂甙都是從以下重量份的中藥材中提取的白術(shù)3(Γ50，蒼術(shù)2(Γ40，木香15 20， 澤瀉10 15。
4.權(quán)利要求3所述的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑，其特征在于，所述的糖類按照以下提取方法得到a、按重量份比例取白術(shù)30 50、蒼術(shù)20 40、木香15 20和澤瀉1(Γ 5后切碎、洗凈，用冷水浸泡2小時(shí)至藥心充分浸透，再加入中藥總重量12倍的水，加熱至沸騰后在90°C的情況下，在熱回流濃縮工藝下煎煮180分鐘同時(shí)濃縮得到濃縮藥液I ;b、將步驟a制備的濃縮藥液，經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄去沉淀物，獲得上清液并經(jīng)負(fù)壓濃縮，使其形成干物質(zhì)為25%的濃縮藥液II ；C、將步驟b得到的濃縮藥液II加4-8倍體積的95%的乙醇，靜置過夜，棄去上清液，沉淀物除去乙醇后加水溶解并通過100KD濾膜過濾，除去雜蛋白、內(nèi)毒素等大分子雜質(zhì)，收集濾過液再通過IKD納濾膜過濾，除去有機(jī)小分子和無機(jī)分子及離子等雜質(zhì)，被截留的物質(zhì)稀釋后逆向水流透析24小時(shí)，然后取出濃縮至相對(duì)密度為1. 0Γ1. 18克/毫升，再加5倍體積的99%乙醇沉淀，攪拌，靜置過夜，3000-5000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；沉淀物除去乙醇并經(jīng)過噴霧干燥，即可制得。
5.權(quán)利要求3所述的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑，其特征在于，所述的三萜皂甙按照以下提取方法得到1、按重量份比例取白術(shù)30 50、蒼術(shù)20 40、木香15 20和澤瀉1(Γ 5后切碎、洗凈，用乙醇或甲醇提取，回收溶劑，取殘?jiān)炗盟芙饣蚧鞈抑瞥伤芤?；i1、往步驟i制成的水溶液中加入石油醚或乙醚，將水溶液中的親脂物質(zhì)色素和油質(zhì)回收，把三萜皂甙留在水溶液中；ii1、往ii步制得的水溶液中加入親水性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑丁醇，溶液中親水性較強(qiáng)的物質(zhì)繼續(xù)留在水溶液中，三萜皂甙轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑萃取液中，收集有機(jī)溶劑萃取液，減壓干燥，制得粗制的三萜皂甙；iv、將iii步制得的粗制三萜皂甙溶于乙醇或甲醇中，再逐漸滴加乙醚、丙酮或乙醚-丙酮等體積比的混合液，至三萜皂甙從溶液中析出為止，將析出的三萜皂甙干燥即可制得。
6.權(quán)利要求1所述的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑，其特征在于，所述的莨菪堿是從洋金花中提取的莨菪堿。
7.權(quán)利要求6所述的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑，其特征在于，所述的從洋金花中提取莨菪堿的方法如下按重量份計(jì)，取洋金花I份，用30份pH2 3的乙醇滲濾，取滲濾液回收蒸干溶劑，把醇浸膏加水熱溶，調(diào)整PH值至2 3，濾過，取酸溶液，加入石油醚脫脂，再次獲取酸水溶液，氨水調(diào)PH值至10，用氯仿萃取，將氯仿萃取液取出，回收氯仿，取萃取余液加于陽離子交換樹脂柱上，先以水洗脫除雜，再用O. 59Γ15%酸液洗脫，收集洗脫液，加堿中和，經(jīng)脫鹽處理，即得莨菪堿。
8.權(quán)利要求1所述的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑，其特征在于，所述的血清免疫球蛋白是按照以下方法制得的O按照常規(guī)方法制備仔豬大腸埃希氏菌高免豬血清1.1)無特定病原體健康育肥豬在潔凈養(yǎng)殖場隔離飼養(yǎng)；1. 2)對(duì)步驟1.1)飼養(yǎng)的健康育肥豬進(jìn)行3次免疫，每次給每頭豬注射仔豬大腸埃希氏菌病三價(jià)滅活疫苗(ETEC Κ88 Κ99 987Ρ)，注射量分別為5 8頭份、5頭份和10頭份，每次免疫間隔一周時(shí)間；1.3)第三次免疫后21天，收集豬血清，對(duì)血清中的血清免疫球蛋白進(jìn)行免疫學(xué)檢測， ETEC Κ88 Κ99 987Ρ的血清免疫球蛋白的微量凝集效價(jià)為1:64 1:128以上后，此豬血清即為仔豬大腸埃希氏菌高免豬血清，收集貯存在16°C條件下備用，如果檢測不合格，按照第三次免疫劑量重新免疫，直至檢測合格；2 )按照常規(guī)方法采集豬血、分離血清并提純血清免疫球蛋白。
9.權(quán)利要求1所述的仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑的制備方法，包括以下步驟按照重量份比例計(jì)，將糖萜素5. (Γ55. O、血清免疫球蛋白55. (Γ95. O和莨菪堿O.005、. 01混合，加無菌去離子水稀釋，經(jīng)勻漿、乳化、過濾后，采用冷凍干燥，即制成。
10.權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟按照重量份比例計(jì)，將糖萜素5. (Γ55. O、血清免疫球蛋白55. (Γ95. O和莨菪堿O. 005^0. 01混合，加無菌去離子水稀釋，使每毫升溶液中ETEC K88 K99 987P的血清免疫球蛋白的微量凝集效價(jià)達(dá)到> 1:512 以上，然后置于真空冷凍干燥機(jī)中，在-400C下冷凍干燥2 8小時(shí)，而后每小時(shí)升溫30C左右，經(jīng)12 18小時(shí)的真空干燥至25°C完成干燥，密封，在25°C環(huán)境中保持3飛小時(shí)，即為成品O
全文摘要
本發(fā)明提供一種仔豬大腸桿菌病凍干血清免疫球蛋白制劑，它由以下重量份的組分組成糖萜素5.0~55.0，莨菪堿0.005~0.01，血清免疫球蛋白55.0~95.0。本發(fā)明的制劑具有更高的穩(wěn)定性，對(duì)大腸桿菌的抑殺作用更加持久充分，抗感染效果更加顯著，因此更能夠達(dá)到防治仔豬大腸桿菌腹瀉的目的。同時(shí)本發(fā)明的制劑是一種純天然、無藥殘、無公害、無耐藥性、無毒副作用的環(huán)保型綠色抗感染藥物，又是現(xiàn)有各種不良抗生藥物的優(yōu)秀替代藥品。
文檔編號(hào)A61K9/19GK103007280SQ20131001965
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者李尚波, 苗玉和, 張勇飛, 舒秀偉 申請(qǐng)人:遼寧益康生物股份有限公司