專利名稱：防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及卵黃免疫球蛋白的制備方法，具體地說是一種防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白制備方法。
背景技術(shù)：
仔豬腹瀉是規(guī)模化養(yǎng)殖場新生仔豬和斷奶仔豬的常見病，其發(fā)病急、傳播快、死亡率高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，40%的臨床腹瀉病例是由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染引起。目前生產(chǎn)上多采用產(chǎn)腸毒素大腸桿菌多價(jià)苗免疫母豬，通過提高初乳的抗體水平達(dá)到預(yù)防仔豬腹瀉的目的。然而母源抗體持續(xù)時(shí)間短，斷奶后短期內(nèi)將消失，無法保護(hù)仔豬的整個(gè)生長階段。通過口服大腸桿菌高免血清也能夠預(yù)防仔豬腹瀉，但因其成本較高很難在實(shí)際生產(chǎn)中大規(guī)模推廣應(yīng)用。獸醫(yī)臨床上，卵黃免疫球蛋白已廣泛用于雞(傳染性法氏囊、新城疫、雞白痢等)、鴨(肝炎)、鵝(小鵝瘟)、犢牛(腹瀉)、羔羊(輪狀病毒腹瀉)等疫病的緊急治療和預(yù)防。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白制備方法，由該方法獲得的卵黃免疫球蛋白對(duì) 防治仔豬大腸桿菌性腹瀉具有較好的療效。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用發(fā)明采用以下方案防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白制備方法，其特征在于包括以下步驟
I)、采集未經(jīng)藥物治療的腹瀉仔豬所攜帶的大腸桿菌；
2)、將獲得的純大腸桿菌接種于試管麥康凱瓊脂斜面培養(yǎng)基上，菌種在3-5°C下保
存；
3)、將菌種接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37°C下振蕩培養(yǎng)24h后，制成菌懸液，加入O. 5%濃度的甲醛滅活；
4)、按體積比將7號(hào)白油與Span-80以93-95:5_7混合，然后加入占二者總體積1. 5-2. 5%的硬脂酸鋁溶解混勻后，110-1201高溫滅菌25-35 min獲得油相，按體積比將滅活的菌懸液和Tween-80以94_98:3_5混合獲得水相，將水相與油相按體積比以1:1混合，充分乳化后即為大腸桿菌油苗，分裝，3-5°C下保存；
5)、用制備好的大腸桿菌油苗接種10只3周齡健康小鼠，每只肌肉注射O.5mL，觀察10天均健康成活；
6)、選擇健康成年產(chǎn)蛋雞50只，分別在第1、7、15天胸肌注射大腸桿菌油苗，注射量分別為第一天O. 5mL/只、第7天1. Oml/只、第15天1. Oml/只；
7)、收集注射過大腸桿菌油苗的雞所產(chǎn)蛋中的卵黃，用濃度為O.8-1. 0%的生理鹽水稀釋4. 5-5. 5倍，然后按重量比加入3-4%的PEG 6000混勻后過濾取上清，可得卵黃免疫球蛋白粗提物。
上述方案的步驟4)中，Span-80以94:6混合，硬脂酸鋁占二者總體積的2%，菌懸液和Tween-80以96:4混合。上述方案的步驟7)中，卵黃用濃度為O. 9%的生理鹽水稀釋5倍，然后按重量比加入3. 5%的PEG 6000混勻后過濾取上清。卵黃免疫球蛋白能像初乳中的抗體一樣通過小腸上皮進(jìn)入機(jī)體，同時(shí)卵黃免疫球蛋白和抗原的親和力遠(yuǎn)比哺乳動(dòng)物抗體和同種抗原的親和力強(qiáng)，因此，卵黃免疫球蛋白可以通過多種途徑在仔豬被動(dòng)免疫時(shí)發(fā)揮抗腹瀉的作用。首先，它可與特異性菌毛抗原結(jié)合減少或阻斷特異性菌毛與宿主腸上皮的結(jié)合，使產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌不能在小腸定植，從而防止腹瀉的發(fā)生。其次，抗特定病原菌的卵黃免疫球蛋白還可直接粘附于病原菌的細(xì)胞壁上，改變病原菌細(xì)胞的完整性，直接抑制病原菌的生長；第三，一部分抗特異病原的卵黃免疫球蛋白在腸道內(nèi)被消化酶降解為結(jié)合片段，這些片段含有抗體的末端高度可變的小肽。這些小肽很容易被腸道吸收發(fā)揮防治腹瀉的作用。本發(fā)明提供的卵黃免疫球蛋白制備方法工藝簡單，生產(chǎn)成本低；所獲得的卵黃免疫球蛋白性質(zhì)均一、易提取，可有效避免非特異性免疫反應(yīng)發(fā)生，且使用后無藥物殘留和耐藥性。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合一實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。本實(shí)施例提供的防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白制備方法具有以下步驟1.病料收集用消毒棉簽采集未經(jīng)藥物治療的腹瀉仔豬糞便、小腸內(nèi)容物、黏膜刮取物和病死豬肝臟、心臟、血液等病料`。2.大腸桿菌分離培養(yǎng)和鑒定確診為純大腸桿菌后，再接種于試管麥康凱瓊脂斜面培養(yǎng)基上，菌種4°C保存?zhèn)溆谩?.增菌培養(yǎng)將大腸桿菌接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)24h后，制成菌懸液，加入O. 5%濃度的甲醒滅活?；A(chǔ)培養(yǎng)基為常規(guī)的用于大腸桿菌的培養(yǎng)基。4.油苗的制備按體積比例將7號(hào)白油與Span-80按94:6比例混合，再加入總量2%的硬脂酸鋁溶解混勻后，116°C高溫滅菌30 min即為油相。按體積比將滅活的菌懸液和Tween-80以96:4的比例混合作為水相，將水相與油相按體積比以1:1混合，充分乳化后即為油乳劑滅活苗，分裝，4°C保存?zhèn)溆谩?.疫苗的安全性檢驗(yàn)用制備好的滅活苗接種10只3周齡健康小鼠，每只肌肉注射O. 5mL,觀察10天均健康成活。6.免疫程序選擇健康成年產(chǎn)蛋雞50只，分別在第1、7、15天胸肌注射大腸桿菌油苗，注射量分別為第一天O. 5mL/只、第7天1. Oml/只、第15天1. Oml/只。7.免疫球蛋白提取收集卵黃用O. 9%生理鹽水稀釋5倍，加入3. 5%的PEG 6000混勻后過濾取上清，可得卵黃免疫球蛋白粗提物。本發(fā)明提供的卵黃免疫球蛋的使用方法為1、防治仔豬腹瀉，預(yù)防量口服，5 -1Oml/頭/次，I次/日，連服3天。2、治療仔豬腹瀉，口服15 20mL/頭/次，I次/日，連服3天。
以下結(jié)合療效證據(jù)進(jìn)一步說明本發(fā)明的使用效果。臨床治療試驗(yàn)在2010年3月至2012年8月期間，選擇規(guī)模化豬場自然感染大腸桿菌典型病豬，隨機(jī)分成2組，一組肌注治療劑量氟苯尼考(20mg/kg BW)，1次/日，連續(xù)3天，另一組口服卵黃免疫球蛋白溶液，口服15 20mL/頭/次，I次/日，連服3天。以上兩組治療效果如下表
腹瀉仔豬治療試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白制備方法，其特征在于包括以下步驟I)、采集未經(jīng)藥物治療的腹瀉仔豬所攜帶的大腸桿菌；2)、將獲得的純大腸桿菌接種于試管麥康凱瓊脂斜面培養(yǎng)基上，菌種在3-5°C下保存；3)、將菌種接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37°C下振蕩培養(yǎng)24h后，制成菌懸液，加入O. 5%濃度的甲醛滅活；4 )、按體積比將7號(hào)白油與Span-80以93-95:5_7混合，然后加入占二者總體積1.5-2. 5%的硬脂酸鋁溶解混勻后，110-120°C高溫滅菌25-35 min獲得油相，按體積比將滅活的菌懸液和Tween-80以94_98:3_5混合獲得水相，將水相與油相按體積比以1:1混合，充分乳化后即為大腸桿菌油苗，分裝，3-5°C下保存；5)、用制備好的大腸桿菌油苗接種10只3周齡健康小鼠，每只肌肉注射O.5mL，觀察10天均健康成活；6)、選擇健康成年產(chǎn)蛋雞50只，分別在第1、7、15天胸肌注射大腸桿菌油苗，注射量分別為第一天O. 5mL/只、第7天1. Oml/只、第15天1. Oml/只；7)、收集注射過大腸桿菌油苗的雞所產(chǎn)蛋中的卵黃，用濃度為O.8-1. 0%的生理鹽水稀釋4. 5-5. 5倍，然后按重量比加入3-4%的PEG 6000混勻后過濾取上清，可得卵黃免疫球蛋白粗提物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白制備方法，其特征在于步驟4)中，Span-80以94:6混合，硬脂酸鋁占二者總體積的2%，菌懸液和Tween-80 以 96:4 混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白制備方法，其特征在于步驟7)中，卵黃用濃度為O. 9%的生理鹽水稀釋5倍，然后按重量比加入3. 5%的PEG 6000混勻后過濾取上清。
全文摘要
防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白制備方法，包括以下步驟采集腹瀉仔豬所攜帶的大腸桿菌；將純大腸桿菌接種于試管麥康凱瓊脂斜面培養(yǎng)基上；將菌種接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，制成菌懸液，加入甲醛滅活；將7號(hào)白油與Span-8O混合，然后加入硬脂酸鋁溶解混勻后，高溫滅菌獲得油相，將菌懸液和Tween-80混合獲得水相，將水相與油相混合，充分乳化后即為大腸桿菌油苗；用大腸桿菌油苗接種健康小鼠，觀察10天均健康成活；選擇健康成年產(chǎn)蛋雞，在第1、7、15天注射大腸桿菌油苗；收集注射過大腸桿菌油苗的雞所產(chǎn)蛋中的卵黃，用生理鹽水稀釋，加入PEG6000混勻后過濾取上清，可得卵黃免疫球蛋白粗提物。用本卵黃免疫球蛋白治療仔豬腹瀉與現(xiàn)有的治療藥物相比，治愈率較高、費(fèi)用降低。
文檔編號(hào)C07K16/12GK103030694SQ20121059063
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者周玉剛, 唐紅, 許百年, 其他發(fā)明人請(qǐng)求不公開姓名 申請(qǐng)人:蚌埠市畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣站