專利名稱：毛蚶中抗腫瘤活性多肽組分的制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了·一種從海洋生物毛蚶中經(jīng)過一系列提取、分離、層析純化等步驟得到強抗腫瘤活性組分的制備分離方法及該組分對一些腫瘤細胞株的藥理活性的測試。本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
毛蚶屬于軟體動物門，瓣鰓綱，列齒目，蚶科。分布于中國、朝鮮和日本沿海，以中國渤海和東海近海較多。毛蚶資源豐富，營養(yǎng)價值高，富含維生素B12，其殼及肉已具有很久的入藥歷史，如其貝殼作為中藥瓦楞子入藥。經(jīng)文獻檢索發(fā)現(xiàn)，人們對毛蚶的研究主要集中在多糖成分的分離及其抗氧化或免疫活性方面的研究，以及對所含糖蛋白其抗菌活性的研究。雖對其所含蛋白多肽抗腫瘤方面的也有零星報道，如:中國專利申請?zhí)?8110478.9公開了 “一種能抗癌的海洋生物提取物”技術(shù)，所用的方法過于簡單，得到的物質(zhì)復(fù)雜而且無法進行定量，因其本身的局限性不利于藥物的開發(fā)與利用；而中國專利申請?zhí)?005100043797.4公開了一種“一種毛蚶抗癌肽類提取物及其制備方法”和200610043222.7公開了一種“從毛蚶中提取小分子活性多肽的方法”，這兩個專利主要僅對于毛蚶中分子量3千以下的小分子多肽進行了提取及活性研究，還有中國專利申請?zhí)?00510043846.4公開了 “一種毛蚶糖肽類提取物及其制備方法”，其是針對毛蚶中分子量IOOOODa以下的糖肽類混合物。但上述專利對毛蚶活性物質(zhì)的研究范圍過窄，及未見對其體外抗腫瘤細胞活性方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的不足及缺點，致力于發(fā)明一種簡單有效的提取分離并同時伴隨活性測試的方法，從海洋生物毛蚶中制備得到一種具有活性組分純度高、有效成分較明確的高效抗腫瘤活性的多肽組分，其樣品具有溶解性好、穩(wěn)定性好、毒副作用小等優(yōu)點。本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有很多技術(shù)進步:1、本發(fā)明通過使用緩沖液混合后的勻漿技術(shù)和采用超聲等方法從毛蚶中提取活性物質(zhì)，能夠使有效成分充分溶解于提取液中，同時也縮短了提取時間。2、本發(fā)明先經(jīng)過硫酸銨沉淀法對提取物進行了初步的分離，此分離方法使用范圍廣，價格低廉，可一步除去大量無活性的雜質(zhì)，起到了很好的分離除雜作用。3、本發(fā)明采用離子交換層析與其它專利中使用的凝膠柱的分離方法相比較，離子交換方法具有處理樣品量大、方法簡單、重復(fù)性好的優(yōu)點。4、本發(fā)明在多肽蛋白的每個分離環(huán)節(jié)都使用MTT法對活性進行跟蹤，具有效率高且能夠準確的確定最佳活性部分的優(yōu)點。5、本發(fā)明使用電泳等一些生物技術(shù)方法對其最終組分做了進一步的鑒定，明確了其主要含有的成分及一些相關(guān)的性質(zhì)。
本發(fā)明的制備步驟如下:將新鮮毛蚶剝殼、取出內(nèi)容物、清洗、加入緩沖液、勻漿、提取、離心、取上清液、硫酸銨分級沉淀、透析、干燥、采用柱層析分離、分別收集活性峰、冷凍干燥濃縮、透析脫鹽、冷凍干燥，得到一組分子量范圍在10.0 27.0kDa的抗腫瘤活性高的多肽組分。本發(fā)明制備的活性組分是通過天然提取的方法得到的物質(zhì)，制備過程中一直都在水溶液中進行，未摻雜有機毒害物質(zhì)及其它污染物，整個制備過程環(huán)保、衛(wèi)生，并通過采用MTT法對腫瘤細胞株進行篩選，發(fā)現(xiàn)其對多種腫瘤細胞株的增殖生長都具有較強的抑制作用，在體外最高抑制率達到90%以上，能夠適用于醫(yī)療用途。


:圖1為實例I中通過鹽析后中間活性組分I的電泳圖譜，M表示所使用的蛋白標準品，其分子量分布為 14.4kDa、20kDa、26kDa、35kDa、45kDa、66.2kDa 和 94kDa。圖2為實例I中通過經(jīng)離子交換柱層析后的目的組分II的電泳圖譜，M表示所使用的蛋白標準品，其分子量分布為 14.4kDa、20kDa、26kDa、35kDa、45kDa、66.2kDa 和 94kDa。具體實施實例:下面結(jié)合實施例對發(fā)明作進一步的描述。實例1:取毛蚶剝殼、取其內(nèi)容物，用低溫蒸餾水清洗三次，控干后稱取150g，以固液比I: 3加入提取緩沖液(pH = 8.0,0.03M，磷酸鈉緩沖液)，采用高速組織搗碎機，以8000rpm間隔勻漿3min至細膩無塊狀，將勻漿液置于低頻超聲儀中超聲提取40min，使用低溫高速離心機，10000rpm， 4°C，離心30min去渣，取上清液分步鹽析沉淀，將量體積后的上清液置于冰浴的環(huán)境下加入70%飽和度的硫酸銨后，繼續(xù)攪拌一段時間后，高速離心除去沉淀取上清液，再按照上清液的體積加到100%飽和度的硫酸銨進行鹽析，再繼續(xù)攪拌一段時間后，IOOOOrpm, 4°C，離心30min，收集沉淀。將沉淀用少量提取液溶解后置于3000Da透析袋中透析24h，每間隔6h更換外圍蒸餾水。將透析脫鹽后的中間活性組分I使用離子交換層析方法進一步分離純化，陰離子交換劑為DEAE-Sepharose Fast Flow,用pH為8.0的0.030M的Tris-HCl緩沖液作為初始緩沖液，通過增加氯化鈉的濃度進行階段洗脫，在A28tl收集收集活性峰，透析脫鹽、冷凍干燥得到多肽物質(zhì)II，即是目的高抗腫瘤活性的多肽組分。取組分I和組分II通過使用SDS-PAGE凝膠電泳觀測其在各個分離步驟中得到組分的蛋白分布情況，從電泳圖譜中看到組分I有多條明顯的條帶，分子量分布廣，而經(jīng)離子交換柱層析后的目的組分II只含有一條明顯條帶，說明它含一種主要成分及幾個微量成分，其分子量范圍為10.0 27.0kDa0實例2:在整個實驗中采用MTT法對提取過程中的組分進行活性跟蹤檢測。將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞(貼壁細胞需用胰酶消化)，用完全培養(yǎng)基吹打成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為4X IO3個/ml。將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔100μ 1，在37°C、5% C02、100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。之后將板內(nèi)的培養(yǎng)液吸出，將以培養(yǎng)液稀釋成不同濃度的樣品加入96孔板中，設(shè)置四個樣品濃度組，每個濃度設(shè)3個平行孔，以不加樣品的培養(yǎng)液孔為陰性對照組，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。吸去液體后于每孔加入20 μ I MTT, 5h后將其倒出并于每孔加入終止液DMS0100 μ 1，室溫放置30min。在酶標儀上以570nm處測OD值。以順鉬為陽性對照。使用藥理學(xué)方法計算出IC50值。通過鹽析中間組分I其活性結(jié)果如表1:表1.組分I活性結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種毛蚶中抗腫瘤活性多肽組分的制備方法和用途，其特征是將新鮮毛蚶剝殼、取出內(nèi)容物、清洗、加入緩沖液、勻漿、提取、離心、取上清液、硫酸銨分級沉淀、透析、干燥、采用離子交換層析、分別收集活性峰、冷凍干燥濃縮、透析脫鹽、冷凍干燥，得到分子量范圍為10. O 27. OkDa的抗腫瘤活性高的多肽組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種毛蚶中抗腫瘤活性多肽組分的制備分離方法，其特征在于加入的緩沖液為O. 01 O. 05M，pH為6. O 9. O的磷酸鈉、磷酸鉀或Tris堿緩沖液，其固液比為I : I I : 4。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種毛蚶中抗腫瘤活性多肽組分的制備分離方法，其特征在于提取的方法為超聲、攪拌器攪拌提取。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種毛蚶中抗腫瘤活性多肽組分的制備分離方法，其特征在于采用硫酸銨分級沉淀，其沉淀方式為高中低三級或兩級沉淀，其高級沉淀硫酸銨濃度范圍為60 100%。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種毛蚶中抗腫瘤活性多肽組分的制備方法，其特征在于所述的柱層析分離，為陰離子型層析柱，其填料為DEAE-Sephorose，DEAE-纖維素等，其洗脫初始緩沖液為pH為6. O 9. O的O. 020 O. 050M的Tris-HCl、磷酸鈉鹽緩沖液，通過增加氯化鈉的濃度進行洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種毛蚶中抗腫瘤活性多肽組分的制備分離方法，其特征在于所用的脫鹽方法為使用IOOODa 3000Da范圍內(nèi)的透析袋脫鹽，通過使用冷凍干燥的方式 或透析的方式濃縮并通過冷凍干燥的方法來干燥樣品。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種毛蚶中抗腫瘤活性多肽組分的制備分離方法，其特征在于活性多肽組分的分子量范圍為10. O 27. OkDa，其主要包括一種主要成分及幾個微量成分。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的毛蚶中抗腫瘤多肽組分在制備抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種毛蚶中抗腫瘤活性的多肽組分的制備方法和用途。所述制備方法包括將毛蚶剝殼、內(nèi)容物清洗、加入緩沖液后勻漿、提取，離心除渣，取上清液，硫酸銨分級沉淀，經(jīng)透析脫鹽后得到活性組分，再經(jīng)離子交換劑層析分離、透析脫鹽，冷凍干燥后，得到一組具有高抗癌活性的多肽組分。本發(fā)明通過一系列的提取分離過程同時采用活性追蹤的方法，得到分子量在10.0～27.0kDa，對多種腫瘤細胞具有很強抑制作用的糖肽組分。該方法具有提取工藝簡單、組分純度高、抗腫瘤活性好、毒副作用小的優(yōu)點，適用于抗腫瘤新藥的開發(fā)和應(yīng)用。
文檔編號A61K38/17GK103254303SQ20131011114
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月1日
發(fā)明者于榮敏, 石效健, 宋麗艷 申請人:于榮敏