抗體純化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗體純化。本發(fā)明提供用以從包含抗體和至少一種宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，所述方法包括離子交換步驟，其中將該混合物施加到第一離子交換材料，由此獲得HCP降低的抗體制品。
【專利說(shuō)明】抗體純化
[0001]本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)日為2007年4月4日的國(guó)際申請(qǐng)PCT/US2007/008359進(jìn)入中國(guó)、申請(qǐng)?zhí)枮?00780019220.7的題為“抗體純化”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]相關(guān)申請(qǐng)
[0003]本申請(qǐng)要求2006年4月5日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/789，725的優(yōu)先權(quán)和2006年4月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/790，414的優(yōu)先權(quán)，每個(gè)臨時(shí)申請(qǐng)的內(nèi)容通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。
[0004]【技術(shù)領(lǐng)域】和【背景技術(shù)】
[0005]大規(guī)模且經(jīng)濟(jì)地純化蛋白質(zhì)對(duì)于生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)來(lái)說(shuō)是一個(gè)日益重要的問(wèn)題。通常，蛋白質(zhì)是使用經(jīng)工程改造能產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系或細(xì)菌細(xì)胞系通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的，所述工程改造是將包含編碼該蛋白質(zhì)的基因的重組質(zhì)粒插入到該細(xì)胞系中。由于所用的細(xì)胞系是活的生物，必需給它們喂養(yǎng)包含糖類、氨基酸和生長(zhǎng)因子的復(fù)雜生長(zhǎng)培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基通常從動(dòng)物血清的制品(preparation)供應(yīng)。要將所需的蛋白質(zhì)與喂養(yǎng)細(xì)胞的化合物混合物和與細(xì)胞本身的副產(chǎn)物進(jìn)行分離，至足夠作為人類治療劑使用的純度，這是一個(gè)極大的難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]對(duì)于改進(jìn)的、用以獲得宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(包括組織蛋白酶L酶原(procathepsinL))含量降低的抗體制品的方法 ，人們是有需求的。本發(fā)明提供用以純化宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中所表達(dá)的抗體的方法，其中所得抗體制品包含的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(包括組織蛋白酶L酶原)的含量降低。本發(fā)明的改進(jìn)方法還包括準(zhǔn)確檢測(cè)宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的可再現(xiàn)方法的開(kāi)發(fā)，以及動(dòng)力學(xué)測(cè)定法。
[0007]本發(fā)明提供用以從包含抗體和至少一種宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，所述方法包括離子交換步驟，其中將該混合物施加到第一離子交換材料，由此獲得HCP降低的抗體制品。在一個(gè)實(shí)施方案中，該離子交換分離步驟包括使該混合物通過(guò)第一離子交換材料，由此獲得HCP水平降低的第一洗脫物(eluate)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的該方法還包括第二離子交換分離步驟，其中將第一洗脫物施加到第二離子交換材料，由此獲得HCP水平降低的第一流通物(flowthrough)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的該方法還包括疏水相互作用分離步驟，其中將第一流通物施加到第一疏水相互作用材料，由此獲得HCP水平降低的第二洗脫物。
[0008]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該離子交換分離步驟包括第一離子交換層析步驟，其中將該混合物荷載到包含第一離子交換材料的柱子上，由此獲得HCP水平降低的第一洗脫物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括第二離子交換層析步驟，該步驟包括將第一洗脫物荷載到包含第二離子交換材料的柱子上，由此獲得第一流通物。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括疏水相互作用分離步驟，該步驟包括將第一流通物荷載到包含第一疏水相互作用材料的柱子上，由此獲得第二洗脫物。在一個(gè)實(shí)施方案中，疏水相互作用分離步驟包括疏水相互作用層析。在一個(gè)實(shí)施方案中，疏水相互作用層析是苯基瓊脂糖凝膠層析。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，荷載到疏水相互作用材料上的抗體量為約20至約40克抗體/升疏水相互作用材料。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，荷載到疏水相互作用材料上的抗體量為約30至約36克抗體/升疏水相互作用材料。
[0010]在一個(gè)實(shí)施方案中，離子交換層析步驟是陽(yáng)離子交換層析。在另一個(gè)實(shí)施方案中，陽(yáng)離子交換層析是與磺酸基連接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物樹(shù)脂。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括以多個(gè)洗滌步驟洗滌該離子交換材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多個(gè)洗滌步驟包括電導(dǎo)率的增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，該離子交換材料用包含約40-50%洗脫緩沖液和約50-60%水(例如注射用水(WFI))的洗液進(jìn)行洗滌。在一個(gè)實(shí)施方案中，該洗脫緩沖液是20mM Na2PO4,150mM氯化鈉，pH7。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方案中，將第一洗脫物在進(jìn)行第一離子交換層析步驟前先進(jìn)行病毒滅活。在一個(gè)實(shí)施方案中，該病毒滅活是通過(guò)pH病毒滅活(例如降低第一洗脫物的pH，從而使病毒滅活)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0012]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第二離子交換層析步驟包括陰離子交換層析。在一個(gè)實(shí)施方案中，該陰離子交換層析是Q瓊脂糖凝膠層析。
[0013]本發(fā)明還提供用以從包含抗體和至少一種宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，其中該HCP水平降低如下來(lái)實(shí)現(xiàn):改變第一洗脫物的pH和電導(dǎo)率，使得第一洗脫物的PH和電導(dǎo)率與第二離子交換材料的pH和電導(dǎo)率基本上相似。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二離子交換材料的PH為約7.7至約8.3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將第一洗脫物的PH改變至約7.7至約8.3。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，將第一洗脫物的pH改變至約
8.0。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二離子交換材料的電導(dǎo)率為約3.5mS/cm至約5.2mS/cm，或者約3.5mS/cm至約4.9mS/cm。在一個(gè)實(shí)施方案中，將第一洗脫物的電導(dǎo)率改變至約3.5mS/cm 至約 5.2mS/cm 或者約 3.5mS/cm 至約 4.9mS/cm。
[0014]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，第一洗脫物包含的HCP比該混合物少約90至約100倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，第一流通物包含的HCP比第一洗脫物少約840至約850倍。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，第二洗脫物包含的HCP比第一流通物少約3至約5倍。
[0015]本發(fā)明提供用以從包含抗體和組織蛋白酶L酶原的混合物生產(chǎn)組織蛋白酶L酶原降低的抗體制品的方法，所述方法包括離子交換分離步驟，其中將該混合物施加到第一離子交換材料，由此獲得組織蛋白酶L酶原降低的抗體制品。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案中，該離子交換分離步驟包括使該混合物通過(guò)第一離子交換材料，由此獲得組織蛋白酶L酶原水平降低的第一洗脫物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該離子交換分離步驟包括第一離子交換層析步驟，其中將該混合物荷載到包含第一離子交換材料的柱子上，由此獲得組織蛋白酶L酶原水平降低的第一洗脫物。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括第二離子交換分離步驟，其中將第一洗脫物施加到第二離子交換材料，由此獲得組織蛋白酶L酶原水平降低的第一流通物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括第二離子交換層析步驟，該步驟包括將第一洗脫物荷載到包含第二離子交換材料的柱子上，由此獲得第一流通物。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括疏水相互作用分離步驟，該步驟包括將第一流通物荷載到包含第一疏水相互作用材料的柱子上，由此獲得組織蛋白酶L酶原水平降低的第二洗脫物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括疏水相互作用分離步驟，該步驟包括將第一流通物荷載到包含第一疏水相互作用材料的柱子上，由此獲得第二洗脫物。[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，離子交換層析步驟是陽(yáng)離子交換層析，包括但不限于與磺酸基連接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物樹(shù)脂。
[0020]在另一個(gè)實(shí)施方案中，離子交換層析步驟還包括以多個(gè)洗滌步驟洗滌該離子交換材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多個(gè)洗滌步驟包括電導(dǎo)率的增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，該離子交換材料用包含約40-50%洗脫緩沖液和約50-60%水(例如注射用水(WFI))的洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該洗脫緩沖液是20mM Na2PO4,150mM氯化鈉，pH7。
[0021]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將第一洗脫物在進(jìn)行離子交換層析步驟前先進(jìn)行病毒滅活。在一個(gè)實(shí)施方案中，該病毒滅活是通過(guò)pH病毒滅活(例如降低第一洗脫物的pH,從而使病毒滅活)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，該離子交換層析步驟包括陰離子交換層析。在一個(gè)實(shí)施方案中，該陰離子交換層析是Q瓊脂糖凝膠層析。
[0023]本發(fā)明還描述了這樣的方法，其中組織蛋白酶L酶原水平降低如下來(lái)實(shí)現(xiàn):改變第一洗脫物的PH和電導(dǎo)率，使得第一洗脫物的pH和電導(dǎo)率與第二離子交換材料的pH和電導(dǎo)率基本上相似。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二離子交換材料的pH為約7.7至約8.3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將第一洗脫物的PH改變至約7.7至約8.3。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，將第一洗脫物的PH改變至約8.0。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，第二離子交換材料的電導(dǎo)率為約
3.5mS/cm至約5.2mS/cm,或者約3.5mS/cm至約4.9mS/cm。在一個(gè)實(shí)施方案中，將第一洗脫物的電導(dǎo)率改變至約3.5mS/cm至約5.2mS/cm,或者約3.5mS/cm至約4.9mS/cm。
[0024]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該疏水相互作用分離步驟包括疏水相互作用層析。在一個(gè)實(shí)施方案中，疏水相互作用層析是苯基瓊脂糖凝膠層析。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，荷載到疏水相互作用材料上的抗體量為約20至約40克抗體/升疏水相互作用材料。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，荷載到疏水相互作用材料上的抗體量為約30至約36克抗體/升疏水相互作用材料。
[0025]在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)組織蛋白酶L動(dòng)力學(xué)測(cè)定法測(cè)定，第一洗脫物包含的組織蛋白酶L活性為約25至約60RFU/s/mg抗體。
[0026]在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)組織蛋白酶L動(dòng)力學(xué)測(cè)定法測(cè)定，第一流通物包含的組織蛋白酶L活性為約0.4至約4RFU/s/mg抗體。
[0027]在又另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)組織蛋白酶L動(dòng)力學(xué)測(cè)定法測(cè)定，第二洗脫物包含的組織蛋白酶L活性為約0.5至約1.5RFU/s/mg抗體
[0028]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組織蛋白酶L酶原的水平有重現(xiàn)性地低下(reproducibly 1ff)。
[0029]在一個(gè)特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供這樣的抗體純化方法，其中可將高含量的抗體-HCP混合物荷載到離子交換樹(shù)脂上，以實(shí)現(xiàn)混合物中HCP的降低。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是，它可用于這樣的抗體-HCP混合物，該混合物在被施加到離子交換樹(shù)脂前未曾被施以A蛋白捕捉。A蛋白捕捉通常被用作抗體純化程序中的初始純化步驟，作為除去HCP的手段，其中將抗體-HCP混合物施加到A蛋白柱，使得抗體與A蛋白結(jié)合，而HCP則流過(guò)。因此，本發(fā)明的方法可用來(lái)純化大載量的抗體-HCP混合物，而無(wú)需執(zhí)行A蛋白層析作為初始步驟。[0030]因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用以從包含抗體和至少一種宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，所述方法包括以下步驟:
[0031](a)將該混合物施加到在平衡緩沖液中的第一離子交換樹(shù)脂，其中施加量大于30克抗體/升樹(shù)脂；
[0032](b)以多個(gè)洗滌步驟從該樹(shù)脂洗滌HCP ;和
[0033](c)用該洗脫緩沖液從該樹(shù)脂洗脫該抗體形成第一洗脫物，
[0034]由此獲得該HCP降低的抗體制品。
[0035]在另一個(gè)實(shí)施方案中，施加量約為35-70克抗體/升樹(shù)脂。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，施加量約為70克抗體/升樹(shù)脂。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含抗體和至少一種HCP的該混合物，在被施加到第一離子交換樹(shù)脂前，沒(méi)有被施以A蛋白捕捉(例如沒(méi)有被施加到A蛋白柱)。
[0036]優(yōu)選地，該多個(gè)洗滌步驟包括至少第一次洗滌和第二次洗滌，其中從第一次洗滌到第二次洗滌電導(dǎo)率有增加。更優(yōu)選地，第一次洗滌是用平衡緩沖液進(jìn)行，第二次洗滌是用洗脫緩沖液和水(例如WFT)的混合物進(jìn)行。例如,洗脫緩沖液和水的混合物可包含約40-50%洗脫緩沖液和約50-60%水。更優(yōu)選地，洗脫緩沖液和水的混合物可包含約45%洗脫緩沖液和約55%水。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗脫緩沖液包含20mM磷酸鈉和150mM氯化鈉。在這個(gè)情況中，其中含45%洗脫緩沖液和約55%水的洗脫緩沖液和水混合物，是9mM磷酸鈉和68mM氯化鈉。在一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一次洗滌是用包含20mM磷酸鹽、25mM氯化鈉的平衡緩沖液進(jìn)行，第二次洗滌是用包含9mM磷酸鹽、68mM氯化鈉的緩沖液(45 %洗脫緩沖液、55%水)進(jìn)行，洗脫緩沖液包含20mM磷酸鹽、150mM氯化鈉。
[0037]在一個(gè)實(shí)施方案中，該使用第一離子交換樹(shù)脂的方法在pH7下進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該使用第一離子交換樹(shù)脂的方法在PH5下進(jìn)行。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，該使用第一離子交換樹(shù)脂的方法在約PH5至約pH7范圍內(nèi)或者pH5至pH7范圍內(nèi)的某pH下進(jìn)行。如使用PH7，優(yōu)選施加約35克抗體/升樹(shù)脂。如使用pH5，優(yōu)選施加約70克抗體/升樹(shù)脂。如使用在約PH5至約pH7范圍內(nèi)(例如pH5至pH7)的某pH，優(yōu)選施加的抗體量為約35至約70克抗體/升樹(shù)脂(例如35-70克抗體/升樹(shù)脂)。
[0038]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)將較多的抗體荷載到樹(shù)脂上(例如約70克抗體/升樹(shù)脂)，來(lái)實(shí)現(xiàn)(例如在PH5下)更好地從抗體-HCP混合物清除HCP，這比將較少的抗體荷載到樹(shù)脂上(例如約30克抗體/升樹(shù)脂)所實(shí)現(xiàn)的清除更好。據(jù)認(rèn)為這是由于當(dāng)使用這樣的條件時(shí)抗體將HCP從樹(shù)脂上置換下來(lái)的結(jié)果，在該條件下抗體對(duì)樹(shù)脂的結(jié)合親和力顯著大于HCP對(duì)樹(shù)脂的結(jié)合親和力。
[0039]優(yōu)選地，第一離子交換樹(shù)脂是陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。優(yōu)選地，將該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂形成柱子，將包含抗體和至少一種HCP的混合物施加到該柱子。優(yōu)選地，該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂包含與磺酸基連接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物樹(shù)脂(例如Fractogel S)?；蛘撸撽?yáng)離子交換樹(shù)脂可包含例如與磺酸基(如锍離子或磺乙基)連接的如下樹(shù)脂:基于甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯的合成聚合物、二氧化娃、帶葡聚糖表面延伸劑(dextran surfaceextender)的高度交聯(lián)瓊脂糖、烯丙基葡聚糖與N, N-亞甲基雙丙烯酸樹(shù)脂的交聯(lián)共聚物。
[0040]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，在進(jìn)行上述的使用第一離子交換樹(shù)脂的方法后，該方法還包括將第一洗脫物進(jìn)行病毒滅活步驟。例如，其中病毒滅活可通過(guò)PH病毒滅活來(lái)實(shí)現(xiàn)，以形成病毒滅活制品(例如，將第一洗脫物施以低PH條件，如pH約3.5，從而使病毒滅活)。優(yōu)選地，將病毒滅活制品施加到第二離子交換樹(shù)脂，其中在將病毒滅活制品施加到第二離子交換樹(shù)脂前，將病毒滅活制品的PH和電導(dǎo)率調(diào)整到與第二離子交換樹(shù)脂的pH和電導(dǎo)率基本相似。例如，第二離子交換樹(shù)脂的PH可在約pH7.7至約pH8.3的范圍，可將病毒滅活制品的pH調(diào)整到約pH7.7至約pH8.3的范圍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二離子交換樹(shù)脂的pH可在約PH7.8至約pH8.2的范圍，可將病毒滅活制品的pH調(diào)整到約pH7.8至約pH8.2的范圍。更優(yōu)選地，第二離子交換樹(shù)脂的PH為約pH8.0，將病毒滅活制品的pH調(diào)整到約pH8.0。此外，第二離子交換樹(shù)脂的電導(dǎo)率可在約3.5mS/cm至約5.2mS/cm的范圍，將病毒滅活制品的電導(dǎo)率調(diào)整到約3.5mS/cm至約5.2mS/cm的范圍。優(yōu)選地，第二離子交換樹(shù)脂的電導(dǎo)率為約5.0mS/cm，將病毒滅活制品的電導(dǎo)率調(diào)整到約5.0mS/cm。
[0041]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二離子交換樹(shù)脂是陰離子交換樹(shù)脂。例如，陰離子交換樹(shù)脂可以是Q瓊脂糖凝膠樹(shù)脂。優(yōu)選地，將第二離子交換樹(shù)脂形成柱子，將病毒滅活制品施加到該柱子上，由此獲得第一流通物。[0042]在本發(fā)明的另一個(gè)方面，從第二離子交換樹(shù)脂獲得第一流通物后，可將第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此獲得第二洗脫物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該疏水相互作用柱是苯基瓊脂糖凝膠柱。在一個(gè)實(shí)施方案中，施加到疏水相互作用柱的第一流通物包含約20至約40克抗體/升疏水相互作用柱材料。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施加到疏水相互作用柱的第一流通物包含約30至約36克抗體/升疏水相互作用柱材料。由于純化過(guò)程中的初始步驟的效率，已發(fā)現(xiàn)沒(méi)有必要將從疏水相互作用柱獲得的第二洗脫物進(jìn)行產(chǎn)物峰分級(jí)分離。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，沒(méi)有將第二洗脫物進(jìn)行產(chǎn)物峰分級(jí)分離。
[0043]在特別優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的用以從包含抗體和至少一種宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，包括以下步驟:
[0044](a)將該混合物施加到在平衡緩沖液中的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，其中該混合物在施加到該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂前未曾被施以A蛋白捕捉，且其中施加量大于30克抗體/升樹(shù)脂；
[0045](b)以多個(gè)洗滌步驟從該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂洗滌HCP ；
[0046](，c)用該洗脫緩沖液從該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂洗脫該抗體，以形成第一洗脫物；
[0047](d)將第一洗脫物進(jìn)行病毒滅活步驟；
[0048](e)將所得病毒滅活制品施加到陰離子交換樹(shù)脂，以獲得第一流通物；和
[0049](f)將第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此獲得第二洗脫物；
[0050]從而獲得HCP降低的抗體制品。
[0051]在一個(gè)實(shí)施方案中，該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為PH7，施加量約為35克抗體/升樹(shù)脂。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為PH5，施加量約為70克抗體/升樹(shù)脂。在還另一個(gè)實(shí)施方案中，pH在約pH5至約pH7(例如pH5to pH7)的范圍，施加的抗體量為約35至約70克抗體/升樹(shù)脂(例如35-70克抗體/升樹(shù)脂)。
[0052]優(yōu)選地，該多個(gè)洗滌步驟包括用采用平衡緩沖液的第一洗液和采用洗脫緩沖液和水混合物的第二洗液來(lái)洗滌該樹(shù)脂。例如，該洗脫緩沖液和水混合物可包含約40-50%洗脫緩沖液和約50-60%水(例如WFI)，更優(yōu)選約45%洗脫緩沖液和約55%水(例如WFI)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗脫緩沖液包含20mM磷酸鈉和150mM氯化鈉。在這個(gè)情況中，其中含45%洗脫緩沖液和約55%水的洗脫緩沖液和水混合物，是9mM磷酸鈉和68mM氯化鈉。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一次洗滌是用包含20mM磷酸鹽、25mM氯化鈉的平衡緩沖液進(jìn)行，第二次洗滌是用包含9mM磷酸鹽、68mM氯化鈉的緩沖液(45%洗脫緩沖液、55%水)進(jìn)行，洗脫緩沖液包含20mM磷酸鹽、150mM氯化鈉。
[0053]優(yōu)選地，在上述的包括步驟(a)到(f)的方法中，在將病毒滅活制品施加到該陰離子交換樹(shù)脂前(即在步驟(d)和(e)之間)，將病毒滅活制品的pH和電導(dǎo)率調(diào)整到與該陰離子交換樹(shù)脂的PH和電導(dǎo)率基本相似。例如，第二離子交換樹(shù)脂的pH可在約pH7.7至約PH8.3的范圍，將病毒滅活制品的pH調(diào)整到約pH7.7至約pH8.3的范圍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二離子交換樹(shù)脂的pH可在約pH7.8至約pH8.2的范圍，將病毒滅活制品的pH調(diào)整到約pH7.8至約pH8.2的范圍。更優(yōu)選地，第二離子交換樹(shù)脂的pH為約pH8.0，將病毒滅活制品的pH調(diào)整到約pH8.0。此外，第二離子交換樹(shù)脂的電導(dǎo)率可在約3.5mS/cm至約5.2mS/cm的范圍，將病毒滅活制品的電導(dǎo)率調(diào)整到約3.5mS/cm至約5.2mS/cm的范圍。優(yōu)選地，第二離子交換樹(shù)脂的電導(dǎo)率為約5.0mS/cm，將病毒滅活制品的電導(dǎo)率調(diào)整到約5.0mS/cm。
[0054]在上述的包括步驟(a)到(f)的方法中，優(yōu)選地該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂是與磺酸基連接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物樹(shù)脂(例如Fractogel)，該陰離子交換樹(shù)脂是Q瓊脂糖凝膠樹(shù)脂，該疏水相互作用柱是苯基瓊脂糖凝膠柱。
[0055]優(yōu)選地，經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，第一洗脫物包含的HCP比該混合物少約90至約100倍。優(yōu)選地，經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，第一流通物包含的HCP比第一洗脫物少約840至約850倍。優(yōu)選地，經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，第二洗脫物包含的HCP比第一流通物少約3至約5倍。
[0056]在特別優(yōu)選的一 個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的用以從包含抗體和至少一種宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，包括以下步驟:
[0057](a)將該混合物施加到在平衡緩沖液中的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，其中該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為PH7且施加量大于35克抗體/升樹(shù)脂，或者該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的pH在pH5至pH7的范圍且施加量約為35至約70克抗體/升樹(shù)脂，或者該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為pH5且施加量大于70克抗體/升樹(shù)脂；
[0058](b)以包括第一次洗滌和第二次洗滌的洗滌步驟從該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂洗滌HCP，該第一次洗滌采用平衡緩沖液，該第二次洗滌采用洗脫緩沖液和水的混合物；
[0059](c)用該洗脫緩沖液從該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂洗脫該抗體，以形成第一洗脫物；
[0060](d)將第一洗脫物進(jìn)行病毒滅活步驟，其中病毒滅活是通過(guò)pH病毒滅活來(lái)實(shí)現(xiàn)，以形成病毒滅活制品；
[0061](e)將所得病毒滅活制品施加到陰離子交換樹(shù)脂，其中在將該病毒滅活制品施加到陰離子交換樹(shù)脂前，將該病毒滅活制品的PH和電導(dǎo)率調(diào)整到與該陰離子交換樹(shù)脂的pH和電導(dǎo)率基本相似，由此獲得第一流通物；和
[0062](f)將第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此獲得第二洗脫物；
[0063]從而獲得HCP降低的抗體制品。
[0064]優(yōu)選地，該抗體混合物在被施加到該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂前未曾被施以A蛋白捕捉。優(yōu)選地，洗脫緩沖液和水的混合物包含約40-50%洗脫緩沖液和約50-60%水，更優(yōu)選約45%洗脫緩沖液和約55%水(例如WFI)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，洗脫緩沖液包含20mM磷酸鈉和150mM氯化鈉。在這個(gè)情況中，其中含45%洗脫緩沖液和約55%水的洗脫緩沖液和水混合物，是9mM磷酸鈉和68mM氯化鈉。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一次洗滌是用包含20mM磷酸鹽、25mM氯化鈉的平衡緩沖液進(jìn)行，第二次洗滌是用包含9mM磷酸鹽、68mM氯化鈉的緩沖液(，45%洗脫緩沖液、55%水)進(jìn)行，洗脫緩沖液包含20mM磷酸鹽、150mM氯化鈉。優(yōu)選地，經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，第一洗脫物包含的HCP比該混合物少約90至約100倍。優(yōu)選地，經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，第一流通物包含的HCP比第一洗脫物少約840至約850倍。優(yōu)選地，經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，第二洗脫物包含的HCP比第一流通物少約3至約5倍。
[0065]在任何上述純化方法的一個(gè)優(yōu)選方面，HCP包含組織蛋白酶L酶原，由此獲得組織蛋白酶L酶原降低的抗體制品。優(yōu)選地，經(jīng)組織蛋白酶L動(dòng)力學(xué)測(cè)定法測(cè)定，洗脫物包含的組織蛋白酶L活性為約25至約60RFU/s/mg抗體。優(yōu)選地，經(jīng)組織蛋白酶L動(dòng)力學(xué)測(cè)定法測(cè)定，第一流通物包含的組織蛋白酶L活性為約0.4至約4RFU/s/mg抗體。優(yōu)選地，經(jīng)組織蛋白酶L動(dòng)力學(xué)測(cè)定法測(cè)定，第二洗脫物包含的組織蛋白酶L活性為約0.5至約1.5RFU/s/mg抗體。優(yōu)選地，組織蛋白酶L酶原的水平有重現(xiàn)性地低下。
[0066]在還另一方面，本發(fā)明涉及用以從包含抗體和至少一種宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，所述方法包括以下步驟:
[0067](a)將該混合物施加到陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，以獲得第一洗脫物；
[0068](b)將第一洗脫物施加到陰離子交換樹(shù)脂，以獲得第一流通物；和
[0069](c)使第一流通物通過(guò)疏水相互作用柱，由此獲得第二洗脫物；
[0070]從而獲得HCP降低的抗體制品。
[0071]優(yōu)選地，包含抗體和 至少一種HCP的該混合物在被施加到第一離子交換樹(shù)脂前不被施以A蛋白捕捉。優(yōu)選地，該方法還包括在將第一洗脫物施加到該陰離子交換樹(shù)脂前，將第一洗脫物進(jìn)行病毒滅活步驟。例如，病毒滅活可通過(guò)PH病毒滅活來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0072]優(yōu)選地，該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂包含與磺酸基連接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物樹(shù)脂(例如該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂可以是Fractogel S柱)。例如，F(xiàn)ractogel S柱可用包含20mM磷酸鈉、25mM氯化鈉的平衡緩沖液平衡，可將該混合物施加到該柱，該柱可用平衡緩沖液至少洗滌一次，第一洗脫物可通過(guò)用包含20mM磷酸鈉、150mM氯化鈉的洗脫緩沖液洗脫來(lái)獲得。
[0073]優(yōu)選地，陰離子交換樹(shù)脂是Q瓊脂糖凝膠柱。例如，Q瓊脂糖凝膠柱可用包含25mM三乙醇胺、40mM氯化鈉(pH7.6)的平衡緩沖液平衡。
[0074]優(yōu)選地，該疏水相互作用柱是苯基瓊脂糖凝膠柱。例如，苯基瓊脂糖凝膠柱可用包含20mM磷酸鈉、1.1M(NH4)2S04(pH7)的平衡緩沖液平衡，可將第一流通物施加到該柱，該柱可用平衡緩沖液至少洗滌一次，第二洗脫物可通過(guò)進(jìn)行鹽不連續(xù)梯度至IlmM磷酸鈉、0.625M (NH4)2SO4 (pH7.0)來(lái)獲得。
[0075]優(yōu)選地，pH病毒滅活是通過(guò)將第一洗脫物維持在pH3.5大約I小時(shí)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0076]在還另一方面，本發(fā)明涉及用以從包含阿達(dá)木單抗和至少一種宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的阿達(dá)木單抗制品的方法，所述方法包括以下步驟:
[0077](a)將該混合物施加到陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，其中該混合物在被施加到第一離子交換樹(shù)脂前不被施以A蛋白捕捉，以獲得第一洗脫物；
[0078](b)將第一洗脫物施以pH病毒滅活，以獲得病毒滅活制品；
[0079](C)將該病毒滅活制品施加到陰離子交換樹(shù)脂，以獲得第一流通物；和
[0080](d)使第一流通物通過(guò)疏水相互作用柱，由此獲得第二洗脫物；[0081]從而獲得HCP降低的阿達(dá)木單抗制品。
[0082]優(yōu)選地，該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂是Fractogel S柱，該陰離子交換樹(shù)脂是Q瓊脂糖凝膠柱，該疏水相互作用柱是苯基瓊脂糖凝膠柱。例如,Fractogel S柱可用包含20mM磷酸鈉、25mM氯化鈉的平衡緩沖液平衡，可將該混合物施加到該柱，該柱可用平衡緩沖液至少洗滌一次，第一洗脫物可通過(guò)用包含20mM磷酸鈉、150mM氯化鈉的洗脫緩沖液洗脫來(lái)獲得。還例如，Q瓊脂糖凝膠柱可用包含25mM三乙醇胺、40mM氯化鈉(pH7.6)的平衡緩沖液平衡。還例如，苯基瓊脂糖凝膠柱可用包含20mM磷酸鈉、1.1M(NH4)2S04(pH7)的平衡緩沖液平衡，可將第一流通物施加到該柱，該柱可用平衡緩沖液至少洗滌一次，第二洗脫物可通過(guò)進(jìn)行鹽不連續(xù)梯度至11禮磷酸鈉、0.6251(順4)2304誠(chéng)7.0)來(lái)獲得。還例如，pH病毒滅活可通過(guò)將第一洗脫物維持在PH3.5大約I小時(shí)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0083]對(duì)于所有上述純化方法，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體是抗腫瘤壞死因子-a (TNFa)抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分是嵌合抗體、人源化抗體或多價(jià)抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分是英夫利昔單抗(infliximab)或golimumab。
[0084]在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNFa t抗體或其抗原結(jié)合部分是人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是這樣的分離人抗體，它以1 X10-8M或以下的^和1X 10-3S-1或以下的Ktjff速率常數(shù)(均用表面等離振子共振進(jìn)行測(cè)定)從人TNF a上解離下來(lái)，在標(biāo)準(zhǔn)的體外L929測(cè)定中以1X10_7M或以下的IC5tl中和人TNF a細(xì)胞毒性。
[0085]在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是具有以下特征的分離人抗體:
[0086]a)以IX 10?或以下的Ktjff速率常數(shù)從人TNFa上解離下來(lái)，該參數(shù)是由表面等離振子共振法測(cè)出；
[0087]b)具有包含SEQ ID NO:3氨基酸序列或者從SEQ ID NO:3修飾而成的氨基酸序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置1、4、5、7或8處的單一丙氨酸置換或者位置1、3、4、6、7、8和/或9處的一至五個(gè)保守氨基酸置換；
[0088]c)具有包含SEQ ID NO:4氨基酸序列或者從SEQ ID NO:4修飾而成的氨基酸序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置2、，3、4、5、6、8、9、10或11處的單一丙氨酸置換或者位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12處的一至五個(gè)保守氨基酸置換。
[0089]在又另一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是這樣的分離人抗體，它的輕鏈可變區(qū)(LCVR)包含SEQ IDNO:1氨基酸序列，重鏈可變區(qū)(HCVR)包含SEQ IDNO:2氨基酸序列。
[0090]在還另一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分是阿達(dá)木單抗。
[0091]本發(fā)明提供用本發(fā)明的任何方法生產(chǎn)的、經(jīng)HCP ELISA測(cè)定基本上不含HCP的抗體制品。本發(fā)明還提供包含用本發(fā)明的任何方法生產(chǎn)的HCP降低的抗體制品和藥物可接受載體的藥物組合物。
[0092]本發(fā)明包括包含HCP降低的抗體和藥物可接受載體的藥物組合物，其中經(jīng)HCPELISA測(cè)定，HCP的水平不超過(guò)約70ng HCP/mg抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，HCP的水平不超過(guò)約13ng HCP/mg抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，HCP的水平不超過(guò)約5ng HCP/mg抗體。[0093]本發(fā)明提供包含抗體的組合物，其中經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，所述組合物沒(méi)有可檢測(cè)水平的HCP。
[0094]本發(fā)明還提供用本文描述的任何方法生產(chǎn)的、基本上不合組織蛋白酶L酶原的抗體制品。本發(fā)明還包括包含用本文描述的任何方法生產(chǎn)的組織蛋白酶L酶原降低的抗體制品和藥物可接受載體的藥物組合物。
[0095]本發(fā)明提供包含組織蛋白酶L酶原降低的抗體和藥物可接受載體的藥物組合物，其中組織蛋白酶L酶原的水平不超過(guò)約3.0RFU/s/mR抗體的組織蛋白酶活性。
[0096]對(duì)于所有上述抗體制品和藥物組合物，優(yōu)選的該抗體是抗腫瘤壞死因子-a (TNFa)抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分選自人源化抗體、嵌合抗體或多價(jià)抗體的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分是英夫利昔單抗或golimumab。
[0097]在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是這樣的分離人抗體，它以！※川—^或以下的^和I X KT3iT1或以下的Ktjff速率常數(shù)(均用表面等離振子共振進(jìn)行測(cè)定)從人TNF a上解離下來(lái)，在標(biāo)準(zhǔn)的體外L929測(cè)定中以1X10_7M或以下的IC5tl中和人TNF a細(xì)胞毒性。
[0098]在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是具有以下特征的分離人抗體:
[0099]a)以IX 10?或以下的Ktjff速率常數(shù)從人TNFa上解離下來(lái)，這是由表面等離振子共振測(cè)出；
[0100]b)具有包含SEQ ID NO:3氨基酸序列或者從SEQ ID NO:3修飾而成的氨基酸序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置1、4、5、7或8處的單一丙氨酸置換或者位置1、3、4、6、7、8和/或9處的一至五個(gè)保守氨基酸置換；
[0101]c)具有包含SEQ ID NO:4氨基酸序列或者從SEQ ID NO:4修飾而成的氨基酸序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置2、3、4、5、6、8、9、10或11處的單一丙氨酸置換或者位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12處的一至五個(gè)保守氨基酸置換。
[0102]在又另一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是這樣的分離人抗體，它的輕鏈可變區(qū)(LCVR)包含SEQ ID NO:1氨基酸序列，重鏈可變區(qū)(HCVR)包含SEQ IDNO: 2氨基酸序列。
[0103]在還另一個(gè)實(shí)施方案中，抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分是阿達(dá)木單抗。
[0104]本發(fā)明包括治療其中TNFa活性有害的疾病的方法，所述方法包括將包含用本發(fā)明任何方法獲得的抗體的藥物組合物給予人受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，將該制劑長(zhǎng)時(shí)間給予人受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，該長(zhǎng)時(shí)間包括至少約3個(gè)月，至少約4個(gè)月或至少約5個(gè)月。
[0105]在一個(gè)實(shí)施方案中，該其中TNFa活性有害的疾病選自自身免疫疾病、腸道疾病和皮膚疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，自身免疫疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏癥、多發(fā)性硬化、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、自身免疫性糖尿病、自身免疫性色素層炎、腎病綜合征和青年期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個(gè)實(shí)施方案中，腸道疾病是節(jié)段性回腸炎。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，皮膚疾病是牛皮癬。
[0106]在一個(gè)實(shí)施方案中，將該藥物組合物與另外的治療劑進(jìn)行組合給予。在一個(gè)實(shí)施方案中，該另外的治療劑是甲氨喋呤。
[0107]本發(fā)明包括治療其中TNFa活性有害的疾病的方法，所述方法包括將包含用本發(fā)明任何方法獲得的抗體的藥物組合物給予人受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，將該制劑長(zhǎng)時(shí)間給予人受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，該長(zhǎng)時(shí)間包括至少約3個(gè)月，至少約4個(gè)月或至少約5個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施方案中，該其中TNFa活性有害的疾病選自自身免疫疾病、腸道疾病和皮膚疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，自身免疫疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏癥、多發(fā)性硬化、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、自身免疫性糖尿病、自身免疫性色素層炎、腎病綜合征和青年期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在一個(gè)實(shí)施方案中，腸道疾病是節(jié)段性回腸炎。在一個(gè)實(shí)施方案中，皮膚疾病是牛皮癬。
[0108]在一個(gè)實(shí)施方案中，將該藥物組合物與另外的治療劑進(jìn)行組合給予。在一個(gè)實(shí)施方案中，該另外的治療劑是甲氨喋呤。
[0109]本發(fā)明提供包含包裝材料、阿達(dá)木單抗和標(biāo)簽或包裝插頁(yè)的制造品(articleof manufacture),該標(biāo)簽或包裝插頁(yè)裝在該包裝材料當(dāng)中，說(shuō)明該阿達(dá)木單抗制劑(formulation)包含不超過(guò)約70ng HCP/mg阿達(dá)木單抗。在一個(gè)實(shí)施方案中，該約70ngHCP/mg阿達(dá)木單抗是通過(guò)HCP ELISA來(lái)測(cè)量。
[0110]本發(fā)明還提供包含包裝材料、阿達(dá)木單抗和標(biāo)簽或包裝插頁(yè)的制造品，該標(biāo)簽或包裝插頁(yè)裝在該包裝材料當(dāng)中，說(shuō)明該阿達(dá)木單抗制劑包含不超過(guò)約13ng HCP/mg阿達(dá)木單抗。在一個(gè)實(shí)施方案中，該約13ng HCP/mg阿達(dá)木單抗是通過(guò)HCP ELISA來(lái)測(cè)量。
[0111]本發(fā)明還提供包含包裝材料、阿達(dá)木單抗和標(biāo)簽或包裝插頁(yè)的制造品，該標(biāo)簽或包裝插頁(yè)裝在該包裝材料當(dāng)中，說(shuō)明該阿達(dá)木單抗制劑包含不超過(guò)約5ng HCP/mg阿達(dá)木單抗。在一個(gè)實(shí)施方案中，該 約5ng HCP/mg阿達(dá)木單抗是通過(guò)HCP ELISA來(lái)測(cè)量。
[0112]本發(fā)明還提供包含包裝材料、阿達(dá)木單抗和標(biāo)簽或包裝插頁(yè)的制造品，該標(biāo)簽或包裝插頁(yè)裝在該包裝材料當(dāng)中，說(shuō)明該阿達(dá)木單抗制劑包含的組織蛋白酶L酶原水平不超過(guò)約3.0RFU/s/mg阿達(dá)木單抗的組織蛋白酶L活性所指示的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，組織蛋白酶L活性是通過(guò)組織蛋白酶L動(dòng)力學(xué)測(cè)定法來(lái)測(cè)量。
[0113]本發(fā)明還提供用以測(cè)定衍自哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料中組織蛋白酶L酶原的量的動(dòng)力學(xué)測(cè)定法，該測(cè)定法包括使該衍自哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料與酶接觸，以將組織蛋白酶L酶原加工成活性組織蛋白酶L形式，由此獲得組織蛋白酶L樣品；將該組織蛋白酶L樣品與組織蛋白酶L的底物接觸；和測(cè)定該組織蛋白酶L樣品中的組織蛋白酶L活性，作為該衍自哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料中組織蛋白酶L酶原的量的指標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該加工組織蛋白酶L酶原的酶是肽鏈內(nèi)切酶。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該組織蛋白酶L的底物包含標(biāo)記(label)。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該標(biāo)記是突光劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該熒光劑包含熒光7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組織蛋白酶L的底物包含Z-亮氨酸-精氨酸。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該Z-亮氨酸-精氨酸包含AMC基團(tuán)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0114]圖1A和IB顯示了每個(gè)工藝的Fractogel S層析步驟的典型洗脫曲線，包括本發(fā)明的工藝(圖1A)和工藝A(圖1B)。
[0115]圖2A和2B顯示了 Q瓊脂糖凝膠FF層析步驟的流通物洗滌曲線的比較，包括本發(fā)明的工藝(圖2A)和工藝A(圖2B)。
[0116]圖3A和3B顯示了苯基瓊脂糖凝膠HP層析步驟的洗脫曲線的比較，包括工藝B (圖3A)和工藝A(圖3B)。
[0117]圖4圖示了平均工藝B (菱形)和平均工藝A(正方形)的組織蛋白酶L酶原逐步降低。
[0118]圖5圖示了平均工藝B(菱形)和工藝A(正方形)的HCP逐步降低。
[0119]圖6顯示出活化的工藝中(in-process)樣品的動(dòng)力學(xué)讀數(shù)指示了反應(yīng)時(shí)間與突光信號(hào)的線性關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0120]1.定義
[0121]為了更容易地理解本發(fā)明，首先對(duì)某些術(shù)語(yǔ)進(jìn)行定義。
[0122]本文所用的術(shù)語(yǔ)“混合物”指待進(jìn)行純化的有粘度材料，該材料中包含有待從可能也存在于其中的其他物質(zhì)中純化出來(lái)的至少一種目的抗體。材料可以是例如水溶液、有機(jī)溶劑體系或者水/有機(jī)溶劑混合物或溶液?；旌衔锿前S多生物分子(如蛋白質(zhì)、抗體、激素和病毒)、小分子(如鹽、糖、脂質(zhì)等)甚至顆粒狀物質(zhì)的復(fù)雜混合物或溶液。雖然生物來(lái)源的典型混合物可能一開(kāi)始是水溶液或水懸浮液，但它也可能含有在較早的分離步驟如溶劑沉淀、提取等中使用到的 有機(jī)溶劑。可能含有易于通過(guò)本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行純化的有價(jià)值生物物質(zhì)的混合物的實(shí)例，包括但不限于生物反應(yīng)器的培養(yǎng)物上清液、均化后的細(xì)胞懸浮液、血漿、血漿級(jí)份和奶。
[0123]所謂從包含抗體和一種或多種物質(zhì)的混合物中“純化”該抗體，是指通過(guò)將至少一種物質(zhì)從該混合物中(完全或部分)除去來(lái)增加該抗體在該混合物中的純度。該物質(zhì)可以是雜質(zhì)或污染物，如但不限于宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)。
[0124]術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)”或“HCP〃指該混合物中的、與目的抗體不同但通常發(fā)源于抗體生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。宜將HCP排除出最終抗體制品。
[0125]術(shù)語(yǔ)“降低(的)(reduced) ”指減少或縮小物質(zhì)的數(shù)量。降低的制品包括與初始數(shù)量相比具有較少的某物質(zhì)如HCP或組織蛋白酶L酶原的制品。在一個(gè)實(shí)施方案中，該物質(zhì)是雜質(zhì)或污染物。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“降低(的)”是指該物質(zhì)顯著少(substantiallyless)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“降低(的)”是指沒(méi)有該物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，沒(méi)有某物質(zhì)包括用本文描述的測(cè)定法得出“沒(méi)有可檢測(cè)的量”。
[0126]術(shù)語(yǔ)“基本上沒(méi)有”包括沒(méi)有某物質(zhì)，但也可包括有極微量的某物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，沒(méi)有某物質(zhì)的數(shù)量包括用本文描述的測(cè)定法得出“沒(méi)有可檢測(cè)的量”。
[0127]術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)降低的〃指這樣的組合物(包括但不限于洗脫物、制品、流通物)，其在一個(gè)或多個(gè)純化步驟后包含抗體和減少或縮小數(shù)量的HCP。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“HCP降低的，，是指在包含抗體的組合物中HCP顯著少。在另一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“HCP降低的”是指在包含抗體的組合物中沒(méi)有HCP。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“HCP降低的”是指經(jīng)本文描述的測(cè)定法測(cè)定，在包含抗體的組合物中沒(méi)有可檢測(cè)量的HCP。[0128]術(shù)語(yǔ)“組織蛋白酶L酶原降低的〃指這樣的組合物(包括但不限于洗脫物、制品、流通物)，其在一個(gè)或多個(gè)純化步驟后包含抗體和減少或縮小數(shù)量的組織蛋白酶L酶原。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“組織蛋白酶L酶原降低的”是指在包含抗體的組合物中HCP顯著少。在另一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“組織蛋白酶L酶原降低的，，是指在包含抗體的組合物中沒(méi)有HCP。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“組織蛋白酶L酶原降低的"是指經(jīng)本文描述的測(cè)定法測(cè)定，在包含抗體的組合物中沒(méi)有可檢測(cè)量的組織蛋白酶L酶原。
[0129]術(shù)語(yǔ)“有重現(xiàn)性地低下〃指一貫地實(shí)現(xiàn)減少或縮小的數(shù)量的能力，如至少80%的時(shí)間、更優(yōu)選至少90 %的時(shí)間、更優(yōu)選至少95 %的時(shí)間、甚至更優(yōu)選至少98 %的時(shí)間實(shí)現(xiàn)減少或縮小的數(shù)量的能力。
[0130]術(shù)語(yǔ)“離子交換分離步驟"指這樣的步驟，在該步驟中，根據(jù)目的抗體和不需要的物質(zhì)或雜質(zhì)(例如HCP或組織蛋白酶L酶原)分別與帶電材料的離子相互作用的差異，將該不需要的物質(zhì)或雜質(zhì)與該目的抗體分離開(kāi)來(lái)。離子交換分離步驟的實(shí)例包括但不限于離子交換層析，包括陰離子交換層析和陽(yáng)離子交換層析。
[0131]“離子交換材料”指作為將該不需要的物質(zhì)或雜質(zhì)(例如HCP或組織蛋白酶L酶原)與該抗體進(jìn)行分離的基礎(chǔ)來(lái)使用的離子材料。離子交換材料的實(shí)例包括陰離子樹(shù)脂和陽(yáng)離子樹(shù)脂。
[0132]“陽(yáng)離子交換材料”指這樣的離子交換材料，它具有共價(jià)結(jié)合的帶負(fù)電的配體，并因此具有游離陽(yáng)離子可供與它所接觸到的溶液中的陽(yáng)離子進(jìn)行交換。有多種陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為本領(lǐng)域所公知，例如其中共價(jià)結(jié)合基團(tuán)是羧酸根或磺酸根的那些陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。市售的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂包括CMC-纖維素、SP-S印hadex?和Fast S_S印harose?(后兩者為Pharmacia 市售)。
[0133]“陰離子交換材料”指具有共價(jià)結(jié)合的帶正電基團(tuán)如季氨基基團(tuán)的離子交換樹(shù)脂。市售的陰離子交換樹(shù)脂包括DEAE纖維素、TMAE、QAE Sephadex?和Fast Q瓊脂糖凝膠? (后兩者為Pharmacia市售)。
[0134]所謂將某分子“結(jié)合"到離子交換材料，是指將該分子在適當(dāng)?shù)臈l件(pH/電導(dǎo)率)下暴露于該離子交換材料，該適當(dāng)?shù)臈l件會(huì)使得該分子借助其與該離子交換材料的(一個(gè)或多個(gè))帶電基團(tuán)之間的離子相互作用可逆地固定化在該離子交換材料之中或之上。
[0135]術(shù)語(yǔ)“疏水相互作用步驟"指這樣的步驟，在該步驟中，根據(jù)目的抗體和不需要的物質(zhì)或雜質(zhì)(例如HCP或組織蛋白酶L酶原)分別與疏水材料的疏水相互作用的差異，將該不需要的物質(zhì)或雜質(zhì)與該目的抗體分離開(kāi)來(lái)。
[0136]“疏水相互作用材料"指作為將該不需要的物質(zhì)或雜質(zhì)(例如HCP或組織蛋白酶L酶原)與該抗體進(jìn)行分離的基礎(chǔ)來(lái)使用的疏水材料。疏水相互作用材料的實(shí)例包括疏水配體，如具有約2至約8個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)，或者芳基基團(tuán)如苯基。
[0137]術(shù)語(yǔ)“洗滌”或“洗滌步驟”包括使適當(dāng)?shù)木彌_液從給定材料(例如離子交換材料或疏水相互作用材料)之中或之上流過(guò)。
[0138]術(shù)語(yǔ)“多個(gè)洗滌步驟”包括超過(guò)一個(gè)的接連洗滌步驟。接連的緩沖液可具有不同的特性如pH、電導(dǎo)率、溶劑濃度等，這些特性是設(shè)計(jì)來(lái)將各種類型的與給定材料(例如離子交換材料或疏水相互作用材料)非特異性締合的雜質(zhì)進(jìn)行解離和除去。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多個(gè)洗滌步驟包括中間洗滌，該中間洗滌還包含約40-50%洗脫緩沖液。[0139]所謂將某分子(例如抗體或污染物質(zhì))從某材料中“洗脫”下來(lái)，是指通過(guò)改變?cè)摬牧现車木彌_液從而降低該分子與該材料的相互作用，來(lái)將該分子從該材料除去。在一個(gè)實(shí)施方案中，將抗體從離子交換柱上洗脫下來(lái)，其中緩沖液與該抗體競(jìng)爭(zhēng)該離子交換材料上的帶電位點(diǎn)。
[0140]術(shù)語(yǔ)“洗脫物”指這樣的包含分子(例如抗體或污染物質(zhì))的液體，它是在使目的抗體與層析材料結(jié)合并加入洗脫緩沖液來(lái)解離該抗體后獲得的。洗脫物可針對(duì)純化過(guò)程中的步驟來(lái)說(shuō)明。例如，術(shù)語(yǔ)“第一洗脫物"指第一層析步驟的洗脫物，術(shù)語(yǔ)“第二洗脫物”指第二層析步驟的洗脫物，依此類推。
[0141]術(shù)語(yǔ)“流通物”指這樣的包含分子(例如抗體或污染物質(zhì))的液體，它是通過(guò)使包含該分子的混合物通過(guò)層析材料以使該分子通過(guò)該材料而不發(fā)生結(jié)合來(lái)獲得的。
[0142]“緩沖液〃指這樣的物質(zhì)，由于它在溶液中的存在，使得為引起單位pH變化所必需加入的酸或堿的數(shù)量要增加。緩沖溶液是通過(guò)其酸-堿共軛物成分的作用來(lái)抵抗PH變化的。用于生物試劑的緩沖溶液通常能夠維持恒定濃度的氫離子，使得溶液的pH在生理范圍內(nèi)。傳統(tǒng)的緩沖成分包括但不限于有機(jī)和無(wú)機(jī)的鹽、酸和堿。示例性的用于純化生物分子(例如抗體)的緩沖液，包括兩性離子緩沖液或“Good"緩沖液，參見(jiàn)例如Good etal.(1966) Biochemistry5:467 和 Good and Izawa (1972)Methods Enzymol.24:62。不例性的緩沖液包括但不限于 TES、MES、PIPES、HEPES, MOPS、M0PS0, TRICINE 和 BICINE。
[0143]本文所用的“洗滌緩沖液"在本文中均指用以從結(jié)合有抗體的給定材料(例如離子交換材料或疏水相互作用材料)帶走雜質(zhì)的物質(zhì)。
[0144]“洗脫緩沖液”指用以將抗體從經(jīng)一種或多種洗滌物質(zhì)洗滌過(guò)的給定材料(例如離子交換材料或疏水相互作用材料)解離下來(lái)的物質(zhì)。洗脫緩沖液起到解離抗體的作用。典型的洗脫物質(zhì)是本領(lǐng)域公知的，它們可具有較高濃度的鹽、游離親和配體或類似物或者其他能促進(jìn)靶物質(zhì)(例如抗體)從給定材料的解離的物質(zhì)。洗脫緩沖液的電導(dǎo)率和/或PH使得該抗體從該離子交換材料或疏水相互作用材料洗脫下來(lái)。
[0145]術(shù)語(yǔ)“電導(dǎo)率〃指水溶液在兩個(gè)電極之間傳導(dǎo)電流的能力。在溶液中，電流是通過(guò)離子運(yùn)輸而流動(dòng)。因此，水溶液中存在越多的離子，溶液就會(huì)有越高的電導(dǎo)率。電導(dǎo)率的測(cè)量單位是mmhos (mS/cm),可用例如Orion出售的電導(dǎo)率儀進(jìn)行測(cè)量。溶液的電導(dǎo)率可通過(guò)改變其中的離子濃度來(lái)改變。例如，可改變?nèi)芤褐械木彌_劑的濃度和/或鹽(e.g.NaCl或KCl)的濃度，以達(dá)到所需的電導(dǎo)率。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)層析中所用的洗滌緩沖液或任何其他水溶液的鹽濃度進(jìn)行改變，以達(dá)到縮小的電導(dǎo)率。
[0146]多肽如抗體的“ρ或“等電點(diǎn)”指該多肽的正電荷與其負(fù)電荷平衡時(shí)的pH，可從該多肽的氨基酸殘基的凈電荷來(lái)計(jì)算，或者可通過(guò)等電聚焦來(lái)測(cè)定。
[0147]術(shù)語(yǔ)“病毒滅活〃包括使混合物中所含的病毒失去功能，或者將病毒從待純化的混合物中除去。該病毒可發(fā)源于抗體生產(chǎn)、下游加工步驟或制造環(huán)境。使病毒失去功能或除去病毒的方法包括熱滅活、PH滅活、化學(xué)滅活劑等。術(shù)語(yǔ)“pH病毒滅活”包括使病毒經(jīng)受某足以使它失去功能的pH。
[0148]本文所用的術(shù)語(yǔ)“人TNF α ” (本文縮寫(xiě)為hTNF α，或簡(jiǎn)稱hTNF)，意指以17kD分泌形式和26kD膜締合形式存在的人細(xì)胞因子，其生物活性形式由非共價(jià)結(jié)合的17kD分子的三聚體構(gòu)成。hTNFa 的結(jié)構(gòu)在例如 Pennica，D.等，(1984)Nature312:724-729 ；Davis,J.M.等，(1987) Biochemisty26:1322-1326 和 Jones，Ε.Y.等，(1989) Nature338:225-228中有進(jìn)一步的描述。術(shù)語(yǔ)人TNF α意在包括重組人TNF a (rhTNF α )，其能通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組表達(dá)方法來(lái)制備或者能商業(yè)購(gòu)得(R & D Systems, Catalog N0.210-TA, Minneapolis, MN)。TNFa也稱作TNF。
[0149]本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”意指由四個(gè)多肽鏈即兩個(gè)重鏈(H)和兩個(gè)輕鏈(L)通過(guò)二硫鍵相互連接構(gòu)成的免疫球蛋白分子。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫(xiě)為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)構(gòu)成。重鏈恒定區(qū)由CH1、CH2和CH3三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫(xiě)為L(zhǎng)CVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL構(gòu)成。VH區(qū)和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分為稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，這些高變區(qū)被稱作構(gòu)架區(qū)(FR)的更為保守的區(qū)所中斷。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR構(gòu)成，從氨基末端至羧基末端按以下順序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本發(fā)明的抗體在美國(guó)專利6，090, 382、6，258，562和6，509, 015中有進(jìn)一步詳細(xì)描述，每個(gè)專利通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是能干擾TNF α活性的抗TNF α抗體?？筎NF α抗體的實(shí)例包括但不限于抗TNFa人抗體和本文描述的抗體部分，以及美國(guó)專利6，090, 382,6, 258，562和6，509, 015和美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/801185和10/302356中描述的那些抗體和抗體部分，每個(gè)專利和專利申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的TNFa抑制劑是抗TNF α抗體或其片段,包括英夫利昔單抗(Remicade?, Johnson and Johnson ；
在美國(guó)專利5，656，272中描述，該專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中)、⑶P571 (人源化的單克隆抗 TNFa 抗體片段)、抗 TNF dAb (Peptech)、CNT0148 (golimumab ；Medarex and Centocor) >W002/12502中描述的抗體,和阿達(dá)木單抗(Hnmira(K) Abbott Laboratories, 一種人抗TNFmAb，在US6，090，382中描述為D2E7)?？捎糜诒景l(fā)明的另外的抗體或其片段描述于美國(guó)專利6，593，458,6, 498，237,6, 451，983和6，448，380，每個(gè)專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。該術(shù)語(yǔ)包括“目的抗體“，是作為本發(fā)明方法的目標(biāo)的抗體。
[0150]本文所用的術(shù)語(yǔ)抗體的“抗 原結(jié)合部分”(或簡(jiǎn)稱“抗體部分”)，指抗體的一個(gè)或幾個(gè)保留與抗原(例如hTNFa)特異性結(jié)合的能力的片段。已經(jīng)證明抗體的抗原結(jié)合功能可通過(guò)全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)實(shí)現(xiàn)。抗體的“抗原結(jié)合部分”這個(gè)術(shù)語(yǔ)所涵蓋的結(jié)合片段的例子包括(i)Fab片段，是由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段；(ii)F(ab' )2片段，是由兩個(gè)Fab片段通過(guò)鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接而構(gòu)成的二價(jià)片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段，(V) dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)，由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；和(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，雖然Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH是由不同的基因所編碼，但是可使用重組方法通過(guò)合成的接頭將它們連接起來(lái)，所述接頭使得它們變成為單一的蛋白質(zhì)鏈，其中VL區(qū)和VH區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv (scFv);參見(jiàn)例如Bird等(1988) Science242:423-426和Huston等(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85 =5879-5883)。這樣的單鏈抗體也要被涵蓋在抗體的“抗原-結(jié)合部分”這個(gè)術(shù)語(yǔ)中。其他形式的單鏈抗體如雙抗體(diabody)也涵蓋在內(nèi)。雙抗體是二價(jià)的雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單一多肽鏈上表達(dá)，但是所使用的接頭短得不能讓同一鏈上的這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生配對(duì)，從而迫使這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域發(fā)生配對(duì)，產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)例如Holliger, P.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 ；Pol jak, R.J.等，(1994) Structure〗:1121-1123)。本發(fā)明的抗體部分在美國(guó)專利6，090, 382,6, 258，562和6，509, 015中有進(jìn)一步的詳細(xì)描述，
每個(gè)專利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
[0151 ] 結(jié)合片段是通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)生產(chǎn)，或者通過(guò)完整免疫球蛋白的酶促或化學(xué)切割來(lái)產(chǎn)生。結(jié)合片段包括Fab、Fab'、F (ab’)2、Fabc、Fv、單鏈和單鏈抗體。與“雙特異性"或“雙功能”免疫球蛋白或抗體不同，免疫球蛋白或抗體被認(rèn)為其每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是相同的?！半p特異性"或“雙功能抗體”是人造雜合抗體，具有兩個(gè)不同的重鏈/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)。雙特異性抗體可通過(guò)多種方法來(lái)制備，包括雜交瘤的融合或Fab’片段的連接。參見(jiàn)例如 Songsivilai & Lachmann,Clin.Exp.1mmunol.79:315-321 (1990) ;Kostelny 等，J.1mmunol.148，1547-1553(1992)。
[0152]本文所用的“保守的氨基酸置換”是其中一個(gè)氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的另一個(gè)氨基酸殘基所置換的置換作用。本領(lǐng)域已經(jīng)確定了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族，包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。
[0153]“嵌合抗體”指這樣的抗體，其中重鏈和輕鏈的每個(gè)氨基酸序列的一部分與衍自特定物種或?qū)儆谔囟悇e的抗體中的相應(yīng)序列同源，而所述鏈的其余區(qū)段與另一物種的相應(yīng)序列同源。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的嵌合抗體或抗原結(jié)合片段，其中輕鏈和重鏈的可變區(qū)都模擬衍自一種哺乳動(dòng)物物種的抗體的可變區(qū)，而恒定區(qū)則與衍自另一種物種的抗體中的序列同源。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌合抗體是通過(guò)將小鼠抗體的CDR嫁接到人抗體的構(gòu)架區(qū)上而制備的。
[0154]“人源化抗體”指包含至少一條這樣的鏈的抗體，該鏈包含基本上來(lái)自人抗體鏈(稱為受體方免疫球蛋白或抗體)的可變區(qū)構(gòu)架殘基和至少一個(gè)基本上來(lái)自非人抗體(例如小鼠)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。除了 CDR的嫁接外，人源化抗體通常進(jìn)行進(jìn)一步的改造以改進(jìn)親和力和/或免疫原性。
[0155]術(shù)語(yǔ)“多價(jià)抗體〃指包含超過(guò)一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)的抗體。例如，“二價(jià)”抗體具有兩個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)，而“四價(jià)"抗體具有四個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)“單特異性”、“雙特異性”、“三特異性”、“四特異性”等指多價(jià)抗體中存在的不同抗原識(shí)別位點(diǎn)特異性的數(shù)量(與抗原識(shí)別位點(diǎn)的數(shù)量相對(duì))。例如，“單特異性"抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)都結(jié)合相同的表位?！半p特異性"或“二元特異性”抗體具有至少一個(gè)結(jié)合第一表位的抗原識(shí)別位點(diǎn)，和至少一個(gè)結(jié)合不同于第一表位的第二表位的抗原識(shí)別位點(diǎn)?！岸鄡r(jià)單特異性"抗體具有都結(jié)合相同的表位的多個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)?！岸鄡r(jià)雙特異性”抗體具有多個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)，其中一些結(jié)合第一表位，另一些結(jié)合不同于第一表位的第二表位。
[0156]本文所用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”意在包括具有衍自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過(guò)體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變引入的突變或者通過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突變)，例如在CDR中，特別是在CDR3中。然而，本文所用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”不意在包括其中衍自另一個(gè)哺乳動(dòng)物物種(如小鼠)的種系的CDR序列已被嫁接到人構(gòu)架序列上的抗體。[0157]本文所用的術(shù)語(yǔ)“重組人抗體”意在包括所有通過(guò)重組方法制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的人抗體，例如使用轉(zhuǎn)染到宿主中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體(下文進(jìn)一步描述)，從重組、組合人抗體文庫(kù)分離的抗體(下文進(jìn)一步描述)，從轉(zhuǎn)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小、鼠)分離的抗體(參見(jiàn)例如 Taylor，L.D.等，(1992) Nucl.Acids Res.20:6287)，或者通過(guò)涉及到將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法來(lái)制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有衍自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。但是在某些實(shí)施方案中，將這種人抗體進(jìn)行體外誘變(或者當(dāng)使用轉(zhuǎn)人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此重組抗體的VH區(qū)和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，它們雖然衍自人種系VH和VL序列或與之有關(guān)，但可能不天然存在于體內(nèi)人抗體種系庫(kù)(antibody germline repertoire)當(dāng)中。
[0158]這種嵌合的、人源化的、人的和二元特異性的抗體可通過(guò)本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)，例如使用以下專利和文獻(xiàn)中描述的方法來(lái)生產(chǎn):PCT國(guó)際申請(qǐng)PCT/USg6/02269 ；歐洲專利申請(qǐng)184，187 ；歐洲專利申請(qǐng)171，496 ；歐洲專利申請(qǐng)173，494 ；PCT國(guó)際公開(kāi) W086/01533 ;美國(guó)專利 4，816，567 ；歐洲專利申請(qǐng) 125，023 ；Better et al (1988)Science240:1041-1043 ；Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sd.USA84:3439-3443 ;Liu et al.(1987)J.1mmunol 139:3521-3526 ;Sun et al.(1987)Proc.Natl.Acad.ScL USA84:214-218 ；Nishimura et al.(1987)Cancer Res.47:999-1005 ；ffood etal.(1985)Nature314:446-449 ；Shaw et al.(1988) J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559)；Morrison(1985)Science229:1202-1207 ；0i et al.(1986)BioTechniques4:214 ；美國(guó)專利 5，225，539 ;Jones et al.(1986)Nature321:552-525 ；Verhoeyan et al.(1988)Science239:1534 ；和 Beidler et al.(1988)J.1mmunol.141:4053-4060, Queen etal.，Proc.Natl.Acad.Sd.USA86:10029-10033(1989)，US5, 530，101、US5, 585，089、US5, 693，761、US5, 693，762、Selick et al, W090/07861 和 Winter, US5, 225，539。
[0159]本文所用的“分離抗體”意指基本上脫除了具有不同的抗原特異性的其他抗體的抗體(例如特異性結(jié)合hTNFa的分離抗體基本上脫除了特異性結(jié)合hTNF α之外的抗原的抗體)。但是，特異性結(jié)合hTNFa的分離抗體可能與其他抗原有交叉反應(yīng)性，例如與來(lái)自其他物種的TNFa分子(下面進(jìn)一步詳細(xì)討論)。此外，分離抗體可以基本上脫除了其他細(xì)胞材料和/或化學(xué)品。
[0160]本文所用的“中和抗體”(或者“中和hTNF α活性的抗體”)意指其與hTNF α的結(jié)合導(dǎo)致hTNF α的生物活性被抑制的抗體。這一對(duì)hTNF α的生物活性的抑制，可通過(guò)測(cè)量hTNF α生物活性的一個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià),所述指標(biāo)例如hTNF α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(體外或體內(nèi))、hTNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞激活和hTNF α與hTNF α受體的結(jié)合。這些hTNF α生物活性的指標(biāo)可通過(guò)本領(lǐng)域公知的幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)體外或體內(nèi)測(cè)定中的一個(gè)或幾個(gè)來(lái)評(píng)價(jià)(參見(jiàn)美國(guó)專利6，090, 382)。優(yōu)選地，通過(guò)對(duì)L929細(xì)胞的hTNF α誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的抑制，來(lái)評(píng)價(jià)抗體中和hTNFa活性的能力。作為hTNF α活性的附加的或另選的參數(shù)，可評(píng)價(jià)抗體抑制ELAM-1在HUVEC上的hTNF α誘導(dǎo)表達(dá)的能力，作為hTNF α誘導(dǎo)細(xì)胞激活的一個(gè)量度。
[0161]本文所用的術(shù)語(yǔ)“表面等離振子共振”指這樣的光學(xué)現(xiàn)象，該現(xiàn)象使得可以例如使用 BIAcore 系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden 和 Piscataway, NJ)對(duì)生物傳感器矩陣當(dāng)中的蛋白質(zhì)濃度的變化進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)實(shí)時(shí)生物特異性相互作用進(jìn)行分析。更多的描述參見(jiàn)美國(guó)專利6，258，562的實(shí)施例1和Jonsson等(1993)Ann.Biol.Clin.51:19 ； Jonsson 等，(1991)Biotechniquesll:620-627 ；Johnsson 等(1995) J.Mol.Recognit.8: 125 和 Johnnson 等(1991)Anal.Biochem.198:268。
[0162]本文所用的術(shù)語(yǔ)“K-”意指抗體從抗體/抗原復(fù)合體解離的離開(kāi)(Off)速度常數(shù)。
[0163]本文所用的術(shù)語(yǔ)“Kd”意指特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。
[0164]本文所用的術(shù)語(yǔ)“IC5tl"意指抑制生物學(xué)目的終點(diǎn)(如中和細(xì)胞毒性活性)所需的抑制劑的濃度。
[0165]本文所用的術(shù)語(yǔ)“核酸分子〃意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但是優(yōu)選雙鏈DNA。
[0166]本文針對(duì)編碼能結(jié)合hTNF α的抗體或抗體部分(例如VH、VL、⑶R3)的核酸所使用的術(shù)語(yǔ)“分離核酸分子"，意指這樣的核酸分子，其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列脫除了編碼能結(jié)合hTNFa之外的抗原的抗體或抗體部分的其他核苷酸序列，該其他序列可天然地位于人基因組DNA中的核酸的側(cè)翼。因此例如，本發(fā)明的編碼抗hTNF α抗體的VH區(qū)的分離核酸，不含有編碼能與hTNFa之外的抗原結(jié)合的其他VH區(qū)的其他序列。
[0167]本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”意指能轉(zhuǎn)運(yùn)其所連接的另一個(gè)核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，指的是其中可以連接上另外的區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中另外的DNA區(qū)段可以被連接到病毒基因組中。某些載體在其被引入的宿主細(xì)胞中能自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)能被整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而隨宿主基因組被復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)其所操作性連接的基因的表達(dá)。這樣的載體在本文稱作“重組表達(dá)載體”(或者簡(jiǎn)稱“表達(dá)載體”)。一般情況下，適用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)載體經(jīng)常是質(zhì)粒的形式。在本說(shuō)明書(shū)中，“質(zhì)?！焙汀拜d體"可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。但是，本發(fā)明意在包括能起著同等功能的其他形式的表達(dá)載體，如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
[0168]本文所用的術(shù)語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞”(或者簡(jiǎn)稱“宿主細(xì)胞”)，意指其中導(dǎo)入重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，這些術(shù)語(yǔ)意在不僅指特定的受試者細(xì)胞，而且還指這樣的細(xì)胞的后代。因?yàn)橛捎谕蛔兓颦h(huán)境影響而在后續(xù)世代中可能發(fā)生某些修飾，事實(shí)上這樣的后代可能與親代細(xì)胞不同，但是仍然包括在本文所用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”的范圍內(nèi)。
[0169]本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥盒”指包含各成分的包裝產(chǎn)品或制造品。藥盒優(yōu)選包括盛有藥盒的各成分的盒子或容器。盒子或容器中附加有標(biāo)簽或食品和藥物管理部的批準(zhǔn)方案。盒子或容器裝有本發(fā)明的各成分，優(yōu)選裝在塑料、聚乙烯、聚丙烯、乙烯或丙烯容器中。容器可以是帶蓋子的管或瓶。藥盒還可以包括施用本發(fā)明的TNFa抗體的說(shuō)明書(shū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥盒包括包含有如PCT/IB03/04502和美國(guó)申請(qǐng)第10/222140號(hào)所述的人抗體D2E7的制劑。
[0170]本文進(jìn)一步描述本發(fā)明的各個(gè)方面。
[0171]I1.杭體牛產(chǎn)
[0172]本發(fā)明提供從包含抗體和一種或多者HCP的混合物中純化該抗體的方法。初始混合物通常是由抗體的重組生產(chǎn)得到的混合物?；蛘撸跏蓟旌衔锟傻米酝ㄟ^(guò)肽合成(或其他合成方法)進(jìn)行的抗體生產(chǎn)，或者該抗體可從其天然來(lái)源純化。[0173]為表達(dá)本發(fā)明的抗體或抗體部分，將編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈或重鏈的DNA插入到表達(dá)載體中，使得基因被操作性連接到轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。在這個(gè)情形中，術(shù)語(yǔ)“操作性連接”指的是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列能發(fā)揮其調(diào)節(jié)抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)定功能。選擇表達(dá)載體和表達(dá)控制序列使之與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容?？贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因可以插入單獨(dú)的載體中，或者更典型的是兩種基因都插入同一個(gè)表達(dá)載體中?？贵w基因通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法插入到表達(dá)載體中(如將抗體基因片段上的互補(bǔ)限制性酶切位點(diǎn)與載體相連接，或者如果沒(méi)有限制性酶切位點(diǎn)，則進(jìn)行鈍末端連接)。在插入抗體或抗體相關(guān)輕鏈或重鏈序列之前，表達(dá)載體可能已經(jīng)攜帶有抗體恒定區(qū)序列。例如，一種將阿達(dá)木單抗或阿達(dá)木單抗相關(guān)VH序列和VL序列轉(zhuǎn)變成全長(zhǎng)抗體基因的方法，就是將它們分別插入到已編碼重鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體和已編碼輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，使得VH區(qū)段操作性連接到載體當(dāng)中的CH區(qū)段，而VL區(qū)段操作性連接到載體當(dāng)中的CL區(qū)段。另外，重組表達(dá)載體可編碼有助于抗體鏈從宿主細(xì)胞中分泌出來(lái)的信號(hào)肽?？蓪⒖贵w鏈基因克隆到載體中，使得信號(hào)肽符合讀框地連接到(linked in-frame to)抗體鏈基因的氨基末端。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽，也可以是異源信號(hào)肽(即非免疫球蛋白的信號(hào)肽)。
[0174]除了抗體鏈基因外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還攜帶能調(diào)控抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列"意指包括能控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子以及別的表達(dá)控制元件(如多聚腺苷酸信號(hào))。這些調(diào)節(jié)序列在例如Goeddel ；Gene Expression Technology !Methods in Enzymologyl85,Academic Press，San Diego,CA(1990)中有描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，要取決于諸如所選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、所需蛋白的表達(dá)水平等因素。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選調(diào)控序列，包括能指導(dǎo)蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高水平表達(dá)的病毒元件，如衍自巨細(xì)胞病毒(CMV)(如CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、猿病毒40 (SV40)(如SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))以及多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。有關(guān)病毒調(diào)節(jié)元件及其序列的進(jìn)一步介紹參看例如Stinski的美國(guó)專利5，168，062，Bell等的美國(guó)專利4，510，245以及Schaffnet等的美國(guó)專利4，968，615。
[0175]除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可攜帶別的序列，如能調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(如復(fù)制起點(diǎn))以及選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因有助于挑選出其中已導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞(參看美國(guó)專利4，399，216,4, 634，665和5，179，017，這三個(gè)專利都是Axel等人的)。例如，通常選擇性標(biāo)記基因能給其中已導(dǎo)入了載體的宿主賦予對(duì)藥物如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在&打_宿主細(xì)胞中用于氨甲蝶呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因(進(jìn)行G418選擇)。
[0176]為了表達(dá)輕鏈和重鏈，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中。不同形式的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”意在涵蓋多種常用于將外源DNA導(dǎo)入到原核或真核宿主細(xì)胞中的技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染等。盡管從理論上說(shuō)，本發(fā)明的抗體可以在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)，但最優(yōu)選的是在真核細(xì)胞、最優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體，真核細(xì)胞尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞比原核細(xì)胞更可能裝配和分泌正確折疊并具有免疫活性的抗體?？贵w基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)據(jù)報(bào)道不能有效地高產(chǎn)率生產(chǎn)活性抗體(Boss，Μ.A 和 Wood, C.R(1985)，Immunology Today6:12-13)。
[0177]適用于克隆和表達(dá)本文所述載體中的DNA的宿主細(xì)胞，是原核生物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或上述的高等真核生物細(xì)胞。適用于此目的的原核生物包括真細(xì)菌如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，例如腸桿菌科細(xì)菌如埃希氏菌屬細(xì)菌(例如大腸桿菌)、腸桿菌屬細(xì)菌、歐文氏菌屬細(xì)菌、克雷伯氏菌屬細(xì)菌、變形菌(Proteus)屬細(xì)菌、沙門(mén)氏菌屬細(xì)菌(例如鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌屬細(xì)菌(例如 Serratia marcescans)和志賀氏菌屬細(xì)菌以及芽孢桿菌屬細(xì)菌(如B.subtilis和B.1icheniformis (例如1989年4月12日公布的DD266, 710中所公開(kāi)的B.licheniformis41P)、假單胞桿菌屬細(xì)菌(如P.aeruginosa)，和鏈霉菌。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是E.coli294 (ATCC31, 446)，不過(guò)其他的菌株 E.coli B、E.coli X1776 (ATCC31, 537)和 E.coli W3110 (ATCC27, 325)如也適合。這些實(shí)例是說(shuō)明性的而非限制性的。
[0178] 除了原核生物外，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適用于多肽編碼載體的克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者說(shuō)普通面包酵母是低等真核宿主微生物當(dāng)中最常用的。但是，有多種其他的屬、種和株是易于得到并可用于本發(fā)明的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe);克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，例如 K.lactis、K.fragilis (ATCC12, 424)、K.bulgaricus (ATCC16,045)、K.wickeramii (ATCC24, 178)、K.waltii (ATCC56, 500)、K.drosophilarum(ATCC36,906)、K.thermotoIerans 和 K.marxianus ;亞羅酵母屬(yarrowia) (EP402, 226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) (EP183, 070);假絲酵母屬(Candida) ;Trichoderraareesia (EP244, 234) ；Neurospora crassa ；許旺酵母屬(Schwanniomyces)如Schwanniomyces occidentalis,和絲狀真菌如脈抱菌屬(Neurospora)、青霉菌屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)和曲霉屬(Aspergillus)宿主如 A.nidulans和 A.niger。
[0179]適用于表達(dá)糖基化抗體的宿主細(xì)胞衍自多細(xì)胞生物。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。在諸如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲(chóng))、埃及斑蚊(Aedes aegyPti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蜆(Drosophilamelanogaster)(果蜆)和家蠶(Bombyx mori)的宿主中，已鑒定出多種桿狀病毒毒株和變體及相應(yīng)的允許(permissive)昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞。有多種轉(zhuǎn)染用病毒株可公開(kāi)獲得，例如苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica) NPV 的 L-1 株和家香(Bombyx mori) NPV 的 Bm_5 株，這種病毒可用作本發(fā)明的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、西紅柿和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可用作宿主。
[0180]優(yōu)選用于表達(dá)本發(fā)明重組抗體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)(包括 dhfr-CHO 細(xì)胞，在 Urlaub and Chasin, (1980) PNAS USA77:4216-4220 中描述，與例如 Kaufman and Sharp (1982) Mol.Biol.159:601-621 中描述的 DHFR選擇性標(biāo)記一起使用)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。當(dāng)編碼抗體基因的重組表達(dá)載體被導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，通過(guò)將宿主細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間來(lái)生產(chǎn)抗體，該段時(shí)間足以使抗體得以在宿主細(xì)胞中表達(dá)，或者更優(yōu)選地使抗體得以分泌到宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的其他實(shí)例有:被SV40(C0S-7，ATCC CRL1651)轉(zhuǎn)化的猴腎CVl細(xì)胞系；人胚胎腎細(xì)胞系(被亞克隆以在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的293或293細(xì)胞，Grahamet al.，J.Gen Virol.36:59(1977));幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK, ATCC CCL10);中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CH0.Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77:4216 (1980));小鼠 Sertoli細(xì)胞(TM4, Mather, Biol.R印rod.23:243-251 (1980));猴腎細(xì)胞(CVl ATCC CCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76, ATCC CRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL2);犬腎細(xì)胞(MDCK, ATCC CCL34);布法羅大鼠肝細(xì)胞(BRL3A, ATCC CRL1442);人肺細(xì)胞(W138, ATCCCCL75);人肝細(xì)胞(Hep G2，HB8065);小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞(MMT060562, ATCC CCL51) ;TRI 細(xì)胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sc1.383:44-68 (1982)) ;MRC5 細(xì)胞；FS4細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系(Hep G2) ο
[0181]用上述抗體生產(chǎn)用的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并將宿主細(xì)胞在經(jīng)適當(dāng)改進(jìn)而可誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼所需序列的基因的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0182]用來(lái)生產(chǎn)抗體的宿主細(xì)胞可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售的培養(yǎng)基如HamisFlO(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基((MEM)，(Sigma)、RPMI640 (Sigma)和 Duibecco 改進(jìn)分Eagle培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)適用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，在以下文獻(xiàn)和專利中描述的任何培養(yǎng)基都可用作宿主系的培養(yǎng)基:Ham et al.,Meth.Enz.58:44 (1979), Barnes et al.，Anal.Biochem.102:255 (1980)，美國(guó)專利 4，767，704,4, 657，866,4, 927，762,4, 560，655 或5，122，469 ；W090/03430 ；W087/00195或美國(guó)專利Re.30, 985。任何這些培養(yǎng)基都可按需補(bǔ)充激素和/或其他生長(zhǎng)因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(如氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂和磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如慶大霉素藥物)、痕量元素(定義為通常以毫摩爾級(jí)的最終濃度存在的無(wú)機(jī)化合物)和葡萄糖或等價(jià)的能源。任何其他必需的補(bǔ)充物也可按本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道的適當(dāng)濃度加入。培養(yǎng)條件如溫度、PH等是之前用于選定進(jìn)行表達(dá)的宿主細(xì)胞的那些條件，它們是普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。[0183]宿主細(xì)胞也可用來(lái)產(chǎn)生完整抗體的部分，如Fab片段或scFv分子。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，上述方法的修改方案也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，可能宜用編碼本發(fā)明抗體的輕鏈或重鏈(但不是同時(shí)編碼兩者)的DNA來(lái)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。也可利用重組DNA技術(shù)，來(lái)去掉編碼輕鏈或重鏈或兩者的DNA中對(duì)結(jié)合hTNF α沒(méi)有必要的一些部分或全部。從這種截短的DNA分子表達(dá)的分子也涵蓋在本發(fā)明的抗體范圍之內(nèi)。此外，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)交聯(lián)方法將本發(fā)明的抗體與另一抗體交聯(lián)，來(lái)產(chǎn)生雙功能抗體，其中一條重鏈和一條輕鏈屬本發(fā)明的抗體，而另外一條重鏈和輕鏈對(duì)hTNF α之外的抗原有特異性。
[0184]在一個(gè)優(yōu)選的進(jìn)行本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分的重組表達(dá)的系統(tǒng)中，通過(guò)磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染將編碼抗體重鏈和輕鏈的重組表達(dá)載體導(dǎo)入dhfr-CHO細(xì)胞中。在這個(gè)重組表達(dá)載體當(dāng)中，抗體重鏈和輕鏈各自操作性連接到CMV增強(qiáng)子/AdMLP啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件，以驅(qū)動(dòng)高水平的基因轉(zhuǎn)錄。重組表達(dá)載體還攜帶有DHFR基因，該基因使得可以采用氨甲蝶呤選擇/擴(kuò)增來(lái)選出轉(zhuǎn)染了載體的CHO細(xì)胞。將選出的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以使抗體重鏈和輕鏈得以表達(dá)，而后從培養(yǎng)基中回收完整抗體。用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)制備重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，選擇轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)宿主細(xì)胞和從培養(yǎng)基中回收抗體。
[0185]本文公開(kāi)的本發(fā)明重組人抗體，包括阿達(dá)木單抗或其抗原結(jié)合部分，或者阿達(dá)木單抗相關(guān)抗體，可以通過(guò)篩選用人VL和VH cDNA制備的重組組合抗體文庫(kù)(優(yōu)選scFv噬菌體展示文庫(kù))進(jìn)行分離，該人VL和VH cDNA是從衍自人淋巴細(xì)胞的mRNA制備的。制備和篩選這樣的文庫(kù)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。除了市售的用以產(chǎn)生噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒(例如Pharmacia重組曬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號(hào)27-9400-01 ;和StratageneSurfZAP?噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)240612)外，特別適用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(kù)的方法和試劑的實(shí)例可見(jiàn)于例如Ladner et al.美國(guó)專利5，223，409 ；Kang et al.PCT公開(kāi)說(shuō)明書(shū) W092/18619 ;Dower et al.PCT 公開(kāi)說(shuō)明書(shū) TO91/17271 ;Winter et al.PCT 公開(kāi)說(shuō)明書(shū) W092/20791 ;Markland et al.PCT 公開(kāi)說(shuō)明書(shū) TO92/15679 ;Breitling et al.PCT公開(kāi)說(shuō)明書(shū) W093/01288 ；McCafferty et al.PCT 公開(kāi)說(shuō)明書(shū) W092/01047 ；Garrard etal.PCT 公開(kāi)說(shuō)明書(shū)W092/09690 ；Fuchs et al.(1991)Bio/Technology9:1370-1372 ；Hay etal.(1992)Hum Antibod Hybridomas3:81-85 ；Huse et al.(1989)Science246:1275-1281:McCaffertv et al., Nature (1990) 348:552-554 Griffiths et al.(1993) EMBO ]12:725-734 ；Hawkins et al.(1992)J Mol Biol226:889-896 ；Clackson et al.(1991)Nature352:624-628:Gram et al.(1992)PNAS89:3576-3580 ；Garrard et al.(1991)Bio/Technology豆:1373-1377 ；Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Resl9:4133-4137 ；和Barbas et al.(1991)PNASM:7978_7982。
[0186]當(dāng)使用重組技術(shù)時(shí)，抗體可胞內(nèi)產(chǎn)生，在周質(zhì)間隙，或者可直接分泌到培養(yǎng)基中。如果抗體是胞內(nèi)產(chǎn)生，作為第一個(gè)步驟，將顆粒碎片例如通過(guò)離心或超濾除去，該顆粒碎片可以是宿主細(xì)胞或裂解細(xì)胞(例如來(lái)自均化操作)。在抗體被分泌到培養(yǎng)基的情況中，通常首先用市售的蛋白質(zhì)濃縮濾器如Amicon或Millipore Pellicon超濾組件,將得自這種表達(dá)系統(tǒng)的上清液進(jìn)行濃縮。
[0187]在進(jìn)行本發(fā)明方法之前，從細(xì)胞碎片純化抗體的程序最初決定于抗體的表達(dá)位點(diǎn)?？梢允挂恍┛贵w直接從細(xì)胞分泌到周圍生長(zhǎng)培養(yǎng)基中；其他抗體則是胞內(nèi)產(chǎn)生。對(duì)于后一類抗體，純化方法的第一個(gè)步驟涉及到裂解細(xì)胞，這可通過(guò)多種方法來(lái)進(jìn)行，包括機(jī)械剪切、滲透沖擊或酶法處理。這種破壞作用會(huì)使細(xì)胞的全部?jī)?nèi)容物釋放到勻衆(zhòng)(homogenate)中，另外還會(huì)產(chǎn)生因尺寸小而難以除去的亞細(xì)胞碎片。這些通常是通過(guò)差速離心或通過(guò)過(guò)濾來(lái)除去。在抗體不分泌到培養(yǎng)基的情況中，通常首先用市售的蛋白質(zhì)濃縮濾器如Amicon或MiIlipore Pellicon超濾組件 ,將得自這種表達(dá)系統(tǒng)的上清液進(jìn)行濃縮。在抗體被分泌到培養(yǎng)基的情況中，也可例如通過(guò)切向流過(guò)濾將重組宿主細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離出來(lái)。還可進(jìn)一步使用本發(fā)明的抗體純化方法，從培養(yǎng)基中回收抗體。
【權(quán)利要求】
1.一種用以從包含抗體和至少一種宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(HCP)的混合物生產(chǎn)HCP降低的抗體制品的方法，所述方法包括以下步驟: (a)將所述混合物施加到在平衡緩沖液中的第一離子交換樹(shù)脂，其中施加量大于30克抗體/升樹(shù)脂； (b)以多個(gè)洗滌步驟從所述樹(shù)脂洗滌HCP;和 (c)用洗脫緩沖液從所述樹(shù)脂洗脫所述抗體形成第一洗脫物，由此獲得所述HCP降低的抗體制品。
2.權(quán)利要求1的方法，其中施加量約為35-70克抗體/升樹(shù)脂。
3.權(quán)利要求1的方法，其中施加量約為70克抗體/升樹(shù)脂。
4.權(quán)利要求1的方法，其中包含抗體和至少一種HCP的所述混合物在被施加到第一離子交換樹(shù)脂前不被施以A蛋白捕捉。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述多個(gè)洗滌步驟包括至少第一次洗滌和第二次洗滌，其中從第一次洗滌到第二次洗滌電導(dǎo)率有增加。
6.權(quán)利要求5的方法，其中第一次洗滌是用平衡緩沖液進(jìn)行，第二次洗滌是用洗脫緩沖液和水的混合物進(jìn)行。
7.權(quán)利要求6的方法，其中洗脫緩沖液和水的混合物包含約40-50%洗脫緩沖液和約50-60%水。
8.權(quán)利要求7的方法，其中洗脫緩沖液和水的混合物包含約45%洗脫緩沖液和約55% 水。
9.權(quán)利要求8的方法，其中洗脫緩沖液包含20mM磷酸鈉和150mM氯化鈉。
10.權(quán)利要求1的方法，所述方法在pH7下進(jìn)行。
11.權(quán)利要求1的方法,所述方法在約PH5至約pH7的pH下進(jìn)行。
12.權(quán)利要求1的方法，所述方法在pH5下進(jìn)行。
13.權(quán)利要求1的方法，其中第一離子交換樹(shù)脂是陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。
14.權(quán)利要求13的方法，其中將所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂形成柱子，將包含抗體和至少一種HCP的混合物施加到所述柱子。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂包含與磺酸基連接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物樹(shù)脂。
16.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括將第一洗脫物進(jìn)行病毒滅活步驟。
17.權(quán)利要求16的方法，其中病毒滅活是通過(guò)pH病毒滅活來(lái)實(shí)現(xiàn)，以形成病毒滅活制品O
18.權(quán)利要求17的方法，其中將病毒滅活制品施加到第二離子交換樹(shù)脂，其中在將病毒滅活制品施加到第二離子交換樹(shù)脂前，將病毒滅活制品的PH和電導(dǎo)率調(diào)整到與第二離子交換樹(shù)脂的PH和電導(dǎo)率基本相似。
19.權(quán)利要求18的方法，其中第二離子交換樹(shù)脂的pH在約pH7.7至約pH8.3的范圍，病毒滅活制品的PH調(diào)整到約pH7.7至約pH8.3的范圍。
20.權(quán)利要求19的方法，其中第二離子交換樹(shù)脂的pH為約pH8.0，病毒滅活制品的pH調(diào)整到約PH8.0。
21.權(quán)利要求18的方法，其中第二離子交換樹(shù)脂的電導(dǎo)率在約3.5mS/cm至約5.2mS/cm的范圍，病毒滅活制品的電導(dǎo)率調(diào)整到約3.5mS/cm至約5.2mS/cm的范圍。
22.權(quán)利要求21的方法，其中第二離子交換樹(shù)脂的電導(dǎo)率為約5.0mS/cm，病毒滅活制品的電導(dǎo)率調(diào)整到約5.0mS/cm。
23.權(quán)利要求18的方法，其中第二離子交換樹(shù)脂是陰離子交換樹(shù)脂。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述陰離子交換樹(shù)脂是Q瓊脂糖凝膠樹(shù)脂。
25.權(quán)利要求18的方法，其中將第二離子交換樹(shù)脂形成柱子，將病毒滅活制品施加到所述柱子，由此獲得第一流通物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中將第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此獲得第二洗脫物。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述疏水相互作用柱是苯基瓊脂糖凝膠柱。
28.權(quán)利要求26的方法，其中施加到所述疏水相互作用柱的第一流通物包含約20至約40克抗體/升疏水相互作用柱材料。
29.權(quán)利要求28的方法，其中施加到所述疏水相互作用柱的第一流通物包含約30至約36克抗體/升疏水相互作用柱材料。
30.權(quán)利要求26的方法，其中第二洗脫物不進(jìn)行產(chǎn)物峰分級(jí)分離。
31.權(quán)利要求1的方法，所述方法包括: (a)將所述混合物施加到在平衡緩沖液中的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，其中所述混合物在施加到所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂前未曾`被施以A蛋白捕捉，且其中施加量大于30克抗體/升樹(shù)脂； (b)以多個(gè)洗滌步驟從所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂洗滌HCP； (c)用洗脫緩沖液從所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂洗脫所述抗體形成第一洗脫物； (d)將第一洗脫物進(jìn)行病毒滅活步驟； (e)將所述病毒滅活制品施加到陰離子交換樹(shù)脂，以獲得第一流通物；和 (f)將第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此獲得第二洗脫物； 從而獲得HCP降低的抗體制品。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為pH7，且施加量約為35克抗體/升樹(shù)脂。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為pH5，且施加量約為70克抗體/升樹(shù)脂。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述多個(gè)洗滌步驟包括用采用平衡緩沖液的第一次洗滌和采用洗脫緩沖液和水混合物的第二次洗滌來(lái)洗滌所述樹(shù)脂。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述洗脫緩沖液和水的混合物包含約40-50%洗脫緩沖液和約50-60%水。
36.權(quán)利要求31的方法，其中在將所述病毒滅活制品施加到所述陰離子交換樹(shù)脂前，將所述病毒滅活制品的PH和電導(dǎo)率調(diào)整到與所述陰離子交換樹(shù)脂的pH和電導(dǎo)率基本相似。
37.權(quán)利要求31的方法，其中經(jīng)HCPELISA測(cè)定，第一洗脫物包含的HCP比所述混合物少約90至約100倍。
38.權(quán)利要求31的方法，其中經(jīng)HCPELISA測(cè)定，第一流通物包含的HCP比第一洗脫物少約840至約850倍。
39.權(quán)利要求31的方法，其中經(jīng)HCPELISA測(cè)定，第二洗脫物包含的HCP比第一流通物少約3至約5倍。
40.權(quán)利要求1的方法，所述方法包括: (a)將所述混合物施加到在平衡緩沖液中的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，其中所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為PH7且施加量約為35克抗體/升樹(shù)脂，或者所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的pH在pH5至pH7的范圍且施加量約為35至約70克抗體/升樹(shù)脂，或者所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為pH5且施加量約為70克抗體/升樹(shù)脂； (b)以包括第一次洗滌和第二次洗滌的洗滌步驟從所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂洗滌HCP，所述第一次洗滌采用平衡緩沖液，所述第二次洗滌采用洗脫緩沖液和水的混合物； (c)用所述洗脫緩沖液從所述陽(yáng)離子交換樹(shù)脂洗脫所述抗體，以形成第一洗脫物； (d)將第一洗脫物進(jìn)行病毒滅活步驟，其中病毒滅活是通過(guò)pH病毒滅活來(lái)實(shí)現(xiàn)，以形成病毒滅活制品； (e)將所得病毒滅活制品施加到陰離子交換樹(shù)脂，其中在將所述病毒滅活制品施加到陰離子交換樹(shù)脂前，將所述病毒滅活制品的PH和電導(dǎo)率調(diào)整到與所述陰離子交換樹(shù)脂的pH和電導(dǎo)率基本相似，由此獲得第一流通物；和 (f)將第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此獲得第二洗脫物； 從而獲得HCP降低的抗體制品。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述抗體混合物在被施加到該陽(yáng)離子交換樹(shù)脂前未曾被施以A蛋白捕捉。
42.權(quán)利要求40的方法，其`中所述洗脫緩沖液和水的混合物包含約40-50%洗脫緩沖液和約50-60%水。
43.權(quán)利要求40的方法，其中經(jīng)HCPELISA測(cè)定，第一洗脫物包含的HCP比該混合物少約90至約100倍。
44.權(quán)利要求40的方法，其中經(jīng)HCPELISA測(cè)定，第一流通物包含的HCP比第一洗脫物少約840至約850倍。
45.權(quán)利要求40的方法，其中經(jīng)HCPELISA測(cè)定，第二洗脫物包含的HCP比第一流通物少約3至約5倍。
46.權(quán)利要求1-45任一項(xiàng)的方法，其中所述HCP包含組織蛋白酶L酶原，由此獲得組織蛋白酶L酶原降低的抗體制品。
47.權(quán)利要求46的方法，其中經(jīng)組織蛋白酶L動(dòng)力學(xué)測(cè)定法測(cè)定，第一洗脫物包含的組織蛋白酶L活性為約25至約60RFU/s/mg抗體。
48.權(quán)利要求46的方法，其中經(jīng)組織蛋白酶L動(dòng)力學(xué)測(cè)定法測(cè)定，第一流通物包含的組織蛋白酶L活性為約0.4至約4RFU/s/mg抗體。
49.權(quán)利要求46的方法，其中經(jīng)組織蛋白酶L動(dòng)力學(xué)測(cè)定法測(cè)定，第二洗脫物包含的組織蛋白酶L活性為約0.5至約1.5RFU/s/mg抗體。
50.權(quán)利要求46-49任一項(xiàng)的方法，其中所述組織蛋白酶L酶原的水平有重現(xiàn)性地低下。
51.權(quán)利要求1-45任一項(xiàng)的方法，其中所述抗體是抗腫瘤壞死因子-a(TNFa)抗體或其抗原結(jié)合部分。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述抗TNFα抗體或其抗原結(jié)合部分是人源化抗體、嵌合抗體或多價(jià)抗體。
53.權(quán)利要求51的方法，其中所述抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是英夫利昔單抗或goIimumab ο
54.權(quán)利要求51的方法，其中所述抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是人抗體。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是分離的人抗體，它以1x10_8M或以下的&和IxKT3iT1或以下的Ktjff速率常數(shù)從人TNF a上解離下來(lái)，所述參數(shù)均由表面等離振子共振法測(cè)出，并在標(biāo)準(zhǔn)的體外L929測(cè)定中以1χ10_7Μ或以下的IC5tl中和人TNF a細(xì)胞毒性。
56.權(quán)利要求54的方法，其中所述抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是具有以下特征的分離的人抗體: a)以IxKT3iT1或以下的Ktjff速率常數(shù)從人TNFα上解離下來(lái)，該參數(shù)是由表面等離振子共振法測(cè)出； b)具有包含SEQID NO:3氨基酸序列或者從SEQ ID NO:3修飾而成的氨基酸序列的輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置1、4、5、7或8處的單一丙氨酸置換或者位置1、3、4、6、7、8和/或9處的一至五個(gè)保守氨基酸置換； c)具有包含SEQID NO:4氨基酸序列或者從SEQ ID NO:4修飾而成的氨基酸序列的重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，該修飾是位置2、3、4、5、6、8、9、10或11處的單一丙氨酸置換或者位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12處的一至五個(gè)保守氨基酸置換。
57.權(quán)利要求54的方法`，其中所述抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是分離的人抗體，所述抗體的輕鏈可變區(qū)(LCVR)包含SEQ ID NO:1氨基酸序列，重鏈可變區(qū)(HCVR)包含SEQID NO: 2氨基酸序列。
58.權(quán)利要求54的方法，其中所述抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是阿達(dá)木單抗。
59.一種經(jīng)HCP ELISA測(cè)定基本上不含HCP的抗體制品，所述抗體制品用權(quán)利要求1_45任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)。
60.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含用權(quán)利要求1-45任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的HCP降低的抗體制品和藥物可接受載體。
61.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含HCP降低的抗體和藥物可接受載體，其中經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，HCP的水平不超過(guò)約70ng HCP/mg抗體。
62.權(quán)利要求61的藥物組合物，其中經(jīng)HCPELISA測(cè)定，HCP的水平不超過(guò)約13ng HCP/mg抗體。
63.權(quán)利要求61的藥物組合物，其中經(jīng)HCPELISA測(cè)定，HCP的水平不超過(guò)約5ng HCP/mg抗體。
64.一種包含抗體的組合物，其中經(jīng)HCP ELISA測(cè)定，所述組合物沒(méi)有可檢測(cè)水平的HCP。
65.一種基本上沒(méi)有組織蛋白酶L酶原的抗體制品，所述抗體制品用權(quán)利要求1-45任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)。
66.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含用權(quán)利要求1-45任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的組織蛋白酶L酶原降低的抗體制品和藥物可接受載體。
67.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含組織蛋白酶L酶原降低的抗體和藥物可接受載體，其中組織蛋白酶L酶原的水平不超過(guò)約3.0RFU/s/mg抗體的組織蛋白酶活性。
68.權(quán)利要求59-67任一項(xiàng)的組合物或制品，其中所述抗體是抗腫瘤壞死因子-a (TNFa)抗體或其抗原結(jié)合部分。
69.一種治療其中TNFa活性有害的疾病的方法，所述方法包括將權(quán)利要求68的組合物或制品給予人受試者。
70.一種包含包裝材料、阿達(dá)木單抗和標(biāo)簽或包裝插頁(yè)的制造品,所述標(biāo)簽或包裝插頁(yè)裝在該包裝材料當(dāng)中，說(shuō)明所述阿達(dá)木單抗制劑包含不超過(guò)約70ng HCP/mg阿達(dá)木單抗。
71.—種包含包裝材料、阿達(dá)木單抗和標(biāo)簽或包裝插頁(yè)的制造品,所述標(biāo)簽或包裝插頁(yè)裝在該包裝材料當(dāng)中，說(shuō)明所述阿達(dá)木單抗制劑包含不超過(guò)約13ng HCP/mg阿達(dá)木單抗。
72.—種包含包裝材料、阿達(dá)木單抗和標(biāo)簽或包裝插頁(yè)的制造品,所述標(biāo)簽或包裝插頁(yè)裝在該包裝材料當(dāng)中，說(shuō)明所述阿達(dá)木單抗制劑包含不超過(guò)約5ng HCP/mg阿達(dá)木單抗。
73.—種包含包裝材料、阿達(dá)木單抗和標(biāo)簽或包裝插頁(yè)的制造品，所述標(biāo)簽或包裝插頁(yè)裝在該包裝材料當(dāng)中，說(shuō)明該阿達(dá)木單抗制劑包含的組織蛋白酶L酶原水平不超過(guò)約3.0RFU/s/mg阿達(dá)木單抗的組織 蛋白酶L活性所指示的水平。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK103509116SQ201310142761
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2007年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2006年4月5日
【發(fā)明者】M.W.萬(wàn), G.阿夫格尼諾斯, G.扎比斯-帕帕斯托伊特西斯 申請(qǐng)人:艾伯維生物技術(shù)有限公司