一種生物型軟骨修復(fù)材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物型軟骨修復(fù)材料及其制備方法。本發(fā)明提供的制備軟骨修復(fù)材料的方法，包括如下步驟：（1）使用表面活性劑溶液浸泡處理離體的動(dòng)物軟骨；（2）使用堿溶液浸泡處理步驟（1）的產(chǎn)物；（3）使用表面活性劑溶液浸泡處理步驟（2）的產(chǎn)物；（4）使用堿溶液浸泡處理步驟（3）的產(chǎn)物；（5）使用pH5.0-9.0的輻照保護(hù)試劑溶液浸泡處理步驟（4）的產(chǎn)物；（6）將步驟（5）的產(chǎn)物依次進(jìn)行冷凍干燥和輻照滅菌，得到軟骨修復(fù)材料。本發(fā)明提供的生物型軟骨修復(fù)材料無免疫排異反應(yīng)，生物相容性好，能滿足被修補(bǔ)組織的力學(xué)要求。
【專利說明】一種生物型軟骨修復(fù)材料及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)療器械領(lǐng)域，具體涉及一種在外科手術(shù)中對(duì)骨組織進(jìn)行修復(fù)的生物型軟骨修復(fù)材料及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)代外科手術(shù)，常需對(duì)一些缺損的軟骨組織進(jìn)行修補(bǔ)，如骨損傷修復(fù)、關(guān)節(jié)面修復(fù)等。為滿足這些修補(bǔ)的需要，目前臨床上已有多種材料及方案用于軟骨損傷的修復(fù)，但目前來說，都存在不同程度的應(yīng)用缺陷。
[0003]理想的支架材料應(yīng)具有以下特點(diǎn):①有良好的組織相容性，無毒，無致畸性；②有三維立體結(jié)構(gòu)生物可降解性；④良好的細(xì)胞界面；⑤具有可塑性和一定的機(jī)械強(qiáng)度。
[0004]目前在臨床上使的修復(fù)材料包括以下幾大類:
[0005]天然生物材料:主要包括膠原、明膠，纖維蛋白、殼聚糖、瓊脂、糖胺多糖、藻酸鹽、蠶絲蛋白、幾丁質(zhì)、松質(zhì)骨骨基質(zhì)、脫細(xì)胞基質(zhì)等。天然生物支架材料安全性較高且易獲得，但最大的缺點(diǎn)是降解太快，新生組織往往達(dá)不到很好的塑形，且力學(xué)強(qiáng)度不夠，被大大限制了應(yīng)用。
[0006]無機(jī)材料以羥基磷灰石、磷酸三鈣為代表，有機(jī)材料以PLA、PGA、PLGA、聚己內(nèi)酯、聚環(huán)氧乙烯、聚乙烯醇、聚氧化乙烯等高分子聚合物為主。其中研究最多的是PLA、PGA以及PLGA。但人工合成材料在不同程度上都存在生物相容性的問題，會(huì)引發(fā)物理刺激引起的無囷炎癥及慢性排異引起的后遺癥。。
[0007]自體軟骨來源有限，且容易造成供區(qū)缺損；異體軟骨被廣泛應(yīng)用，但可引起免疫排斥反應(yīng)，或引起交叉感染；骨膜移植則存在效果不穩(wěn)定的缺陷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種異種來源的生物型軟骨修復(fù)材料及其制備方法。
[0009]本發(fā)明提供的制備軟骨修復(fù)材料(生物型軟骨修復(fù)材料)的方法，包括如下步驟:
[0010]( I)使用表面活性劑溶液浸泡處理離體的動(dòng)物軟骨；
[0011](2)使用堿溶液浸泡處理步驟(I)的產(chǎn)物；
[0012](3)使用表面活性劑溶液浸泡處理步驟(2)的產(chǎn)物；
[0013](4)使用堿溶液浸泡處理步驟(3)的產(chǎn)物；
[0014](5)使用 ρΗ5.0-9.0 (如 ρΗ5.0-6.5、ρΗ6.5-9.0、ρΗ5.0、ρΗ6.5 或 ρΗ9.0)的輻照保護(hù)試劑溶液浸泡處理步驟(4)的產(chǎn)物；
[0015](6)將步驟(5)的產(chǎn)物依次進(jìn)行冷凍干燥和輻照滅菌，得到軟骨修復(fù)材料。
[0016]所述步驟(I)又稱脫細(xì)胞處理。所述步驟(I)中:所述表面活性劑為非離子型表面活性劑，要求殘留可控、無細(xì)胞毒性或低細(xì)胞毒性、不會(huì)污染環(huán)境。所述步驟(I)中:所述表面活性劑可為TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述步驟(I)中:所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度可為 0.5-3g/100ml (如 0.5_lg/100ml、lg_3g/100ml、0.5g/100ml、lg/lOOml或3g/100ml)。所述步驟(I)中:所述浸泡處理的條件可為:0-25°C (如0-10°C>6-25°〇、2±21:、8±21:或23±2°0、5-168小時(shí)(如 5-15 小時(shí)、15-168 小時(shí)、5 小時(shí)、15 小時(shí)或168小時(shí))。所述表面活性劑溶液具體可為表面活性劑水溶液。
[0017]所述步驟(2)中:所述堿溶液可為堿性化合物溶液。所述堿性化合物可為NaOH, KOH或Ca (OH)20所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度可為0.02-1M (如0.02-0.5Μ、0.5-1Μ、0.02M、0.5M或1M)。所述步驟(2)中:所述浸泡處理的條件可為:0_25°C(如 0-10°C、6-25°C、2±2°C、8±2°C或 23±2°C )、30_180 分鐘(如 30-60 分鐘、60-180 分鐘、30分鐘、60分鐘或180分鐘)。所述堿溶液具體可為堿性化合物的水溶液。
[0018]所述步驟(3)又稱脫脂處理。所述步驟(3)中:所述表面活性劑可為TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述步驟(3)中:所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度可為
0.5-3g/100ml (如 0.5-lg/100ml、lg_3g/100ml、0.5g/100ml、lg/100ml 或 3g/100ml)。所述步驟(3)中:所述浸泡處理的條件可為:0-25°C (如0-10°C、6-25°C、2±2°C、8±2°C或23±2°C)、1_168小時(shí)(如1-10小時(shí)、10-168小時(shí)、I小時(shí)、10小時(shí)或168小時(shí))。所述表面活性劑溶液具體可為表面活性劑水溶液。
[0019]所述步驟(4)中:所述堿溶液可為堿性化合物溶液。所述堿性化合物可為NaOH, KOH或Ca (OH)20所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度可為0.02-1M (如0.02-0.5Μ、0.5-1Μ、0.02M、0.5M或1M)。所述步驟(4)中:所述浸泡處理的條件可為:0_25°C(如 0-10°〇、6-251:、2±21:、8±21:或23±2°0、30-180 分鐘(如 30-60 分鐘、60-180 分鐘、30分鐘、60分鐘或180分鐘)。所述堿溶液具體可為堿性化合物的水溶液。
[0020]所述步驟(5)中:所述的輻照保護(hù)劑可以是阻隔劑、穩(wěn)定劑、還原劑中的一種或幾種。所述步驟(5)中:所述輻照保護(hù)試劑可為甘氨酸。所述步驟(5)中:所述輻照保護(hù)試劑溶液中，所述輻照保護(hù)試劑的濃度可為0.1-3.5g/100ml(如0.1-lg/lOOml、lg_3.5g/100ml、0.lg/100ml、lg/100ml或3.5g/100ml)。所述步驟(5)中:所述浸泡處理的條件可為:0_25°C(如 0-8°〇、4-251:、2±21:、6±21:或23±2°0、60-180分鐘(如60-120分鐘、120-180分鐘、60分鐘、120分鐘或180分鐘)。所述輻照保護(hù)試劑溶液具體可為輻照保護(hù)試劑水溶液。
[0021]所述輻照滅菌具體可為鈷-60輻射滅菌。所述鈷-60輻射滅菌的輻照劑量可為15-30KGy (如 15-25KGy、25_30KGy、15KGy、25KGy 或 30KGy)。
[0022]所述動(dòng)物軟骨可為動(dòng)物肋軟骨或動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨。
[0023]所述動(dòng)物可為牛或豬。
[0024]以上任一所述方法制備得到的軟骨修復(fù)材料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025]動(dòng)物骨組織含有豐富的細(xì)胞及間質(zhì)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的免疫原性。常規(guī)的乙醇清洗、過氧化氫清洗脫除細(xì)胞的能力有限，幾乎不能做到完全脫細(xì)胞；結(jié)合深凍工藝，雖可以進(jìn)一步降低材料的免疫原性，但深凍本身并不能進(jìn)一步脫除細(xì)胞成分，仍然有較強(qiáng)的免疫原性；而且遺傳物質(zhì)的殘留也存在較大的安全隱患。
[0026]本發(fā)明中，選用的動(dòng)物的軟骨組織為動(dòng)物肋軟骨，屬透明軟骨。肋軟骨適宜加工為柱狀材料，其機(jī)械強(qiáng)度較高，帶有宏觀孔洞，但與關(guān)節(jié)軟骨所制得材料相比略脆。軟骨本身細(xì)胞含量極少，主要成分硫酸軟骨素和膠原蛋白均為安全成分，可作為植入材料，其他成分含量也很少。也可以采用關(guān)節(jié)軟骨，適宜加工為片狀材料，可為平直或彎曲的片狀，且有較好的彈性及柔韌度。
[0027]發(fā)明中，通過脫細(xì)胞、脫脂可以完全去除內(nèi)毒素，完全脫除抗原的成分。
[0028]本發(fā)明中，對(duì)軟骨修復(fù)材料進(jìn)行了輻照保護(hù)處理，在軟骨組織上結(jié)合輻照保護(hù)劑，降低輻照過程對(duì)生物型軟骨修復(fù)材料固有結(jié)構(gòu)的破壞，從而避免其在使用過程中降解過快，使材料只在骨組織再生時(shí)被破骨細(xì)胞被動(dòng)降解，降解與組織的生長速度同步，同時(shí)降解產(chǎn)物可被機(jī)體吸收利用，有利于缺損組織的再生性修復(fù)。
[0029]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):原料是動(dòng)物軟骨組織，主要成分是硫酸軟骨素和膠原蛋白，保留了與機(jī)體相似的空間結(jié)構(gòu)，可被動(dòng)降解，降解速度與再生組織的生長速度同步，降解產(chǎn)物可被機(jī)體吸收利用，有利于缺損組織的再生性修復(fù)，本發(fā)明無免疫排異反應(yīng)，生物相容性好，能滿足被修補(bǔ)組織的力學(xué)要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為實(shí)施例1的步驟2的產(chǎn)物的切片的HE染色圖。
[0031]圖2為實(shí)施例1制備的生物型軟骨修復(fù)材料的切片的HE染色圖。

【具體實(shí)施方式】
[0032]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0033]甘氨酸:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為62011516, CAS編號(hào)為56_40_6。
[0034]實(shí)施例1、生物型軟骨修復(fù)材料的制備
[0035]1、從規(guī)范化管理的屠宰廠中收集剛完成屠宰的成年豬的肋軟骨，盡量避免接觸污染物，收集后立即冷凍儲(chǔ)存。
[0036]2、將步驟I得到的肋軟骨解凍后并充分清洗，剪去肌肉組織，剔除骨膜(此時(shí)的HE染色結(jié)果見圖1)。
[0037]3、脫細(xì)胞處理
[0038]使用表面活性劑溶液浸泡處理肋軟骨。
[0039]本步驟的目的為:破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞破碎溶出。
[0040]具體步驟:使用0.5g/100ml TritonX-100水溶液8±2°C浸泡處理15小時(shí)，然后用清水洗滌。
[0041]4、第一次堿處理
[0042]使用堿溶液浸泡處理步驟3的產(chǎn)物。
[0043]本步驟的目的為:破壞并溶出非膠原類蛋白。
[0044]具體步驟:使用IM NaOH水溶液，8±2°C浸泡處理60min，然后用清水洗滌。
[0045]5、脫脂處理
[0046]用表面活性劑溶液浸泡處理步驟4的產(chǎn)物。
[0047]本步驟的目的為:去除脂肪及脂溶性雜質(zhì)。
[0048]具體步驟:使用lg/100ml TritonX-100水溶液8±2°C浸泡處理10小時(shí)，然后用清水洗滌。
[0049]6、第二次堿處理
[0050]使用堿溶液浸泡處理步驟5的產(chǎn)物。
[0051]本步驟的目的為:去除內(nèi)毒素及滅活可能存在的病毒。
[0052]具體步驟:使用IM NaOH水溶液，8±2°C浸泡處理60min，然后用清水洗滌。
[0053]7、輻照保護(hù)劑處理
[0054]具體步驟:使用pH6.5、lg/100mL的甘氨酸水溶液，6±2°C浸泡處理120min，然后用清水洗滌。
[0055]8、取步驟7的產(chǎn)物，使用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，然后封裝并用鈷-60輻射滅菌(輻照劑量為25KGy)。產(chǎn)物的HE染色結(jié)果見圖2，可以觀察到產(chǎn)品的脫細(xì)胞效果顯著。
[0056]實(shí)施例2、生物型軟骨修復(fù)材料的制備
[0057]1、從規(guī)范化管理的屠宰廠中收集剛完成屠宰的成年豬的關(guān)節(jié)軟骨，盡量避免接觸污染物，收集后立即冷凍儲(chǔ)存。
[0058]2、將步驟I得到的關(guān)節(jié)軟骨解凍后并充分清洗，剪去肌肉組織，剔除骨膜。
[0059]3、脫細(xì)胞處理
[0060]使用表面活性劑溶液浸泡處理關(guān)節(jié)軟骨。
[0061]具體步驟:使用lg/100ml Tween-80水溶液23±2°C浸泡處理5小時(shí)，然后用清水洗漆。
[0062]4、第一次堿處理
[0063]使用堿溶液浸泡處理步驟3的產(chǎn)物。
[0064]具體步驟:使用0.5M KOH水溶液，23 ±2 °C浸泡處理30min，然后用清水洗滌。
[0065]5、脫脂處理
[0066]用表面活性劑溶液浸泡處理步驟4的產(chǎn)物。
[0067]具體步驟:使用0.5g/100ml Tween-80水溶液23±2°C浸泡處理I小時(shí)，然后用清水洗漆。
[0068]6、第二次堿處理
[0069]使用堿溶液浸泡處理步驟5的產(chǎn)物。
[0070]具體步驟:使用0.5M KOH水溶液，23 ±2 °C浸泡處理30min，然后用清水洗滌。
[0071]7、輻照保護(hù)劑處理
[0072]具體步驟:使用pH5.0,0.1g/1OOmL的甘氨酸水溶液，23±2°C浸泡處理60min，然后用清水洗滌。
[0073]8、取步驟7的產(chǎn)物，使用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，然后封裝并用鈷-60輻射滅菌(輻照劑量為15KGy)。
[0074]實(shí)施例3、生物型軟骨修復(fù)材料的制備
[0075]1、從規(guī)范化管理的屠宰廠中收集剛完成屠宰的成年牛的肋軟骨，盡量避免接觸污染物，收集后立即冷凍儲(chǔ)存。
[0076]2、將步驟I得到的肋軟骨解凍后并充分清洗，剪去肌肉組織，剔除骨膜。
[0077]3、脫細(xì)胞處理
[0078]使用表面活性劑溶液浸泡處理肋軟骨。
[0079]具體步驟:使用3g/100ml Tween-40水溶液2±2°C浸泡處理168小時(shí)，然后用清水洗漆。
[0080]4、第一次堿處理
[0081]使用堿溶液浸泡處理步驟3的產(chǎn)物。
[0082]具體步驟:使用0.02M Ca(OH)JK溶液，2±2°C浸泡處理180min，然后用清水洗滌。
[0083]5、脫脂處理
[0084]用表面活性劑溶液浸泡處理步驟4的產(chǎn)物。
[0085]具體步驟:使用3g/100ml Tween-40水溶液2±2°C浸泡處理168小時(shí)，然后用清水洗漆。
[0086]6、第二次堿處理
[0087]使用堿溶液浸泡處理步驟5的產(chǎn)物。
[0088]具體步驟:使用0.02M Ca(OH)JK溶液，2±2°C浸泡處理180min，然后用清水洗滌。
[0089]7、輻照保護(hù)劑處理
[0090]具體步驟:使用pH9.0,3.5g/100mL的甘氨酸水溶液，2±2°C浸泡處理180min，然后用清水洗滌。
[0091]8、取步驟7的產(chǎn)物，使用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，然后封裝并用鈷-60輻射滅菌(輻照劑量為30KGy)。
[0092]實(shí)施例4、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0093]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:新西蘭白兔、體重2-2.5kg。
[0094]1、將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉，膝關(guān)節(jié)前切口，縱向切開皮膚，逐層深入，暴露股骨踝間窩關(guān)節(jié)面，用手鉆做一直徑為3毫米、深5毫米的軟骨缺損。止血后，用等滲鹽水沖洗創(chuàng)口，逐層縫合。傷后連續(xù)3天肌內(nèi)注射青霉素鈉鹽，不外固定，籠內(nèi)喂養(yǎng)。
[0095]2、將完成步驟I的動(dòng)物分組處理:
[0096]實(shí)驗(yàn)組-1:將實(shí)施例1得到的生物型軟骨修復(fù)材料修剪為合適的形態(tài)后修補(bǔ)軟骨缺損，用等滲鹽水沖洗創(chuàng)口，逐層縫合，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4X 15U預(yù)防感染(每天兩次，共3天)；
[0097]實(shí)驗(yàn)組-2:將實(shí)施例2得到的生物型軟骨修復(fù)材料修剪為合適的形態(tài)后修補(bǔ)軟骨缺損，用等滲鹽水沖洗創(chuàng)口，逐層縫合，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4X 15U預(yù)防感染(每天兩次，共3天)；
[0098]實(shí)驗(yàn)組-3:將實(shí)施例3得到的生物型軟骨修復(fù)材料修剪為合適的形態(tài)后修補(bǔ)軟骨缺損，用等滲鹽水沖洗創(chuàng)口，逐層縫合，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4X 15U預(yù)防感染(每天兩次，共3天)；
[0099]對(duì)照組:用等滲鹽水沖洗創(chuàng)口，逐層縫合，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4X 15U預(yù)防感染(每天兩次，共3天)。
[0100]術(shù)后8周時(shí)，解剖動(dòng)物并觀察股骨踝間窩關(guān)節(jié)面的形態(tài)。對(duì)照組動(dòng)物可見骨軟骨缺損區(qū)填充物為灰白色、半透明、較硬、略凹，細(xì)胞排列不甚規(guī)則，分層不明顯，僅少部分細(xì)胞形成陷窩樣結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)組-1、實(shí)驗(yàn)組-2、實(shí)驗(yàn)組-3中，動(dòng)物的股骨踝間窩關(guān)節(jié)面基本愈口 ο
【權(quán)利要求】
1.一種制備軟骨修復(fù)材料的方法，包括如下步驟: (1)使用表面活性劑溶液浸泡處理離體的動(dòng)物軟骨； (2)使用堿溶液浸泡處理步驟(I)的產(chǎn)物； (3)使用表面活性劑溶液浸泡處理步驟(2)的產(chǎn)物； (4)使用堿溶液浸泡處理步驟(3)的產(chǎn)物； (5)使用pH5.0-9.0的輻照保護(hù)試劑溶液浸泡處理步驟(4)的產(chǎn)物； (6)將步驟(5)的產(chǎn)物依次進(jìn)行冷凍干燥和輻照滅菌，得到軟骨修復(fù)材料。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(I)中:所述表面活性劑為TritonX-100、Tween-80或Tween-40 ;所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度為0.5-3g/100ml ;所述浸泡處理的條件為:0_25°C、5_168小時(shí)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中:所述堿溶液為堿性化合物溶液；所述堿性化合物為NaOH、KOH或Ca(OH)2 ;所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度為0.02-1M ;所述浸泡處理的條件為:0-25°C、30-180分鐘。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中:所述表面活性劑為TritonX-100、Tween-80或Tween-40 ;所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度為0.5-3g/100ml ;所述浸泡處理的條件為:0_25°C、1-168小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于:所述步驟(4)中:所述堿溶液為堿性化合物溶液；所述堿性化合物為Na0H、K0H*Ca(0H)2 ;所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度為0.02-1M ;所述浸泡處理的條件為:0-25°C、30-180分鐘。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述步驟(5)中:所述輻照保護(hù)試劑為甘氨酸；所述輻照保護(hù)試劑溶液中，所述輻照保護(hù)試劑的濃度為0.1-3.5g/100ml ；所述浸泡處理的條件為:0-25°C、60-180分鐘。
7.如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于:所述滅菌為鈷-60輻射滅菌。
8.如權(quán)利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于:所述動(dòng)物軟骨為動(dòng)物肋軟骨或動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨。
9.如權(quán)利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于:所述動(dòng)物為?；蜇i。
10.權(quán)利要求1至9中任一所述方法制備得到的軟骨修復(fù)材料。
【文檔編號(hào)】A61L27/58GK104174068SQ201310192619
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月22日
【發(fā)明者】董佳桓, 孫先昌, 郭松, 林萍, 辛春鳳 申請(qǐng)人:煙臺(tái)正海生物技術(shù)有限公司