一種天然無機(jī)骨基質(zhì)及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種天然無機(jī)骨基質(zhì)及其制備方法。本發(fā)明提供的制備無機(jī)骨基質(zhì)的方法，包括如下步驟：（1）使用表面活性劑溶液浸泡處理骨松質(zhì)；（2）使用堿溶液浸泡處理步驟（1）的產(chǎn)物；（3）將步驟（2）的產(chǎn)物進(jìn)行梯度高溫處理；所述梯度高溫處理依次包括如下步驟：①105-110℃煅燒1.5-3小時；②350℃-400℃煅燒1.5-3小時；③750℃-800℃煅燒3-5小時；④1200℃-1300℃煅燒1.5-3小時；（4）使用堿溶液浸泡處理步驟（3）的產(chǎn)物；（5）使用PBS緩沖液浸泡處理步驟（4）的產(chǎn)物，得到無機(jī)骨基質(zhì)。采用本發(fā)明得到的無機(jī)骨基質(zhì)進(jìn)行骨移植，具有無免疫排異反應(yīng)、生物相容性好、有足夠機(jī)械強(qiáng)度、能滿足被修補(bǔ)組織的力學(xué)要求等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種天然無機(jī)骨基質(zhì)及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種天然無機(jī)骨基質(zhì)及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)代外科手術(shù)中，常需要對骨組織進(jìn)行修復(fù)。長期以來，材料主要采取自體或異體骨移植物。
[0003]自體骨移植在材料來源方面存在著嚴(yán)重的缺陷，從自體異位取骨，無異于拆了東墻補(bǔ)西墻，使病人易于患手術(shù)后并發(fā)癥，失敗率高達(dá)10%-30%。
[0004]異體骨移植在材料篩選、儲存方面相當(dāng)困難，價格昂貴，還容易產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)、感染艾滋病毒等，失敗率更高。同時，異體骨被取代緩慢，新生骨體積偏小。
[0005]為了克服自體骨和異體骨移植存在的種種問題，人們試圖通過天然或合成途徑，取得理想的骨修復(fù)材料?，F(xiàn)有的具有生物相容性的材料(如陶瓷、金屬、高分子)中僅有一小部分同時兼有適當(dāng)?shù)臋C(jī)械強(qiáng)度。金屬材料作為骨移植材料的主要問題在于其熱傳導(dǎo)性，造成病人的術(shù)后生活質(zhì)量受到影響。現(xiàn)在常用的無機(jī)非金屬材料(如骨水泥、磷酸鈣陶瓷等)存在孔隙率不足、強(qiáng)度不夠、操作性差等問題?，F(xiàn)有的天然無機(jī)骨基質(zhì)存在孔隙率不足和強(qiáng)度不夠的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種天然無機(jī)骨基質(zhì)及其制備方法。
[0007]本發(fā)明提供的制備無機(jī)骨基質(zhì)的方法，包括如下步驟:
[0008]( I)使用表面活性劑溶液浸泡處理離體的骨松質(zhì)；
[0009](2)使用堿溶液浸泡處理步驟(I)的產(chǎn)物；
[0010](3)將步驟(2)的產(chǎn)物進(jìn)行梯度高溫處理；所述梯度高溫處理依次包括如下步驟:① 105-110°C (如 105-108°C、108-110°C、105°C、108°C或 110°C)煅燒 1.5-3 小時(如 1.5-2小時、2-3 小時、1.5 小時、2 小時或 3 小時)；(2) 3500C -400°C (如 350-380°C>380-400°C>350°C、380°C或400°C)煅燒1.5-3小時(如1.5-2小時、2-3小時、1.5小時、2小時或3小時)；③ 750。。-800。。(如 750-780O、780-800O、750O、780O或 800。0煅燒 3-5 小時(如 3-4 小時、4-5 小時、3 小時、4 小時或 5 小時);④ 12000C -1300。。(如 1200_1250°C、1250-1300°C、1200°C、1250°C或1300°C)煅燒1.5-3小時(如1.5-2小時、2_3小時、1.5小時、2小時或3小時);
[0011](4)使用堿溶液浸泡處理步驟(3)的產(chǎn)物；
[0012](5)使用PBS緩沖液浸泡處理步驟(4)的產(chǎn)物，得到無機(jī)骨基質(zhì)。
[0013]所述步驟(I)又稱脫細(xì)胞處理。所述步驟(I)中:所述表面活性劑可為TritonX-1OO或Tween-80。所述步驟(I)中:所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度可為 0.5-2g/100ml(如 0.5-lg/100ml、lg_2g/100ml、0.5g/100ml、lg/100ml 或 2g/100ml)。所述步驟(I)中:所述浸泡處理的條件可為:4-30°C (如4-17°C、13-30°C、6±2°C、15±2°C或28±2°C)、5-168小時(如5_16小時、16-168小時、5小時、16小時或168小時)。所述表面活性劑溶液具體可為表面活性劑水溶液。
[0014]所述步驟(2)中:所述堿溶液可為堿性化合物溶液。所述堿性化合物可為NaOH或KOH0所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度可為0.5-1M(如0.5M或1M)。所述步驟
(2)中:所述浸泡處理的條件可為:0-25°C (如 0-8°C、4-25°C、2±2°C、6±2°C 或 23±2°C)、15-120分鐘(如15-30分鐘、30-120分鐘、15分鐘、30分鐘或120分鐘)。所述堿溶液具體可為堿性化合物的水溶液。
[0015]所述步驟(4)中:所述堿溶液可為堿性化合物溶液。所述堿性化合物可為NaOH或KOH0所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度可為0.5-1M(如0.5M或1M)。所述步驟
(4)中:所述浸泡處理的條件可為:0-25°C (如 0-8°C、4-25°C、2±2°C、6±2°C 或 23±2°C)、15-120分鐘(如15-30分鐘、30-120分鐘、15分鐘、30分鐘或120分鐘)。所述堿溶液具體可為堿性化合物的水溶液。
[0016]所述步驟(5)中:所述PBS 緩沖液的 pH 可為 6.5-7.8 (如 6.5-7.2,7.2-7.8,6.5、
7.2或7.8)。所述步驟(5)中:所述浸泡處理的條件可為:0-8°C (如0_6°C、2_8°C、2±2°C、4±2°C或6±2°C )、16-168小時(如16-48小時、48-168小時、16小時、48小時或168小時)。
[0017]所述方法中還可包括如下步驟:將所述步驟(5)的產(chǎn)物依次進(jìn)行冷凍干燥和滅菌。所述滅菌可為鈷-60輻射滅菌。所述鈷-60輻射滅菌的輻照劑量可為15-30KGy (如15-25KGy、25-30KGy、15KGy、25KGy 或 30KGy)。
[0018]所述骨松質(zhì)可為動物長骨的骨松質(zhì)。所述動物具體可為豬或牛。
[0019]以上任一所述方法制備得到的無機(jī)骨基質(zhì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020]將骨松質(zhì)進(jìn)行脫細(xì)胞處理和第一次堿處理，有助于使組織的多孔結(jié)構(gòu)充分暴露，從而在后續(xù)的高溫熔融處理中受熱均勻，并可有效縮短高溫熔融處理的時間。
[0021]采用梯度高溫的形式對脫細(xì)胞處理和堿處理后的產(chǎn)物進(jìn)行高溫熔融處理，具有如下優(yōu)點(diǎn):根據(jù)原料組織成分不同的熱敏感特點(diǎn)，逐一去除非目標(biāo)成分，最終去除組織中的全部有機(jī)成分，保留無機(jī)成分，可保留組織的宏觀天然多孔結(jié)構(gòu)，使材料定型固定，同時能增加材料的機(jī)械強(qiáng)度，同時可以去除可能表現(xiàn)出免疫原性的表面微觀結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)了降低免疫原性的目的。
[0022]將高溫熔融處理的產(chǎn)物再次進(jìn)行堿處理(第二次堿處理)，可以去除骨組織中可能存在的內(nèi)毒素。
[0023]將第二次堿處理后的產(chǎn)物進(jìn)行緩沖液浸泡處理，有助于去除高溫處理時產(chǎn)生的堿性鹽類，使材料PH值與人體接近，增加安全性。
[0024]冷凍干燥可以使無機(jī)骨基質(zhì)更易在普通環(huán)境中儲存。
[0025]動物骨松質(zhì)中，無機(jī)鹽成分為沉積在膠原支架上的晶體結(jié)構(gòu)，脫除有機(jī)成分后，無機(jī)鹽成分之間結(jié)合較為松散、機(jī)械強(qiáng)度低、容易破碎、不能保持天然的多孔形態(tài)，且脫除有機(jī)成分后，在原膠原的位置留下大量微觀孔隙，這些孔隙在臨床上表現(xiàn)出一定的免疫原性。本發(fā)明提供的方法中，在脫除骨松質(zhì)的有機(jī)成分后，進(jìn)一步在可控條件下進(jìn)行高溫熔融處理，使無機(jī)鹽成分在保持宏觀多孔結(jié)構(gòu)的前提下熔融，表面呈現(xiàn)光滑結(jié)構(gòu)，從而生物相容性更好，保留的宏觀多孔結(jié)構(gòu)易于再生組織長入。采用本發(fā)明的方法制備得到的無機(jī)骨基質(zhì)進(jìn)行骨移植后，無機(jī)骨基質(zhì)本身在修復(fù)初期提供支架，修復(fù)后期在三種骨細(xì)胞的共同作用下才會被侵蝕，機(jī)體產(chǎn)生的無機(jī)鹽成分重新沉積于新生的膠原支架上，有助于新骨的形成，最終自體新生骨完全替代無機(jī)骨基質(zhì)。
[0026]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):原料是動物骨組織，主要成分是以羥基磷灰石為主的無機(jī)骨鹽，保留了與受體相似的宏觀結(jié)構(gòu)，可被動降解，降解速度與再生組織的生長速度同步；降解產(chǎn)物是無機(jī)骨鹽(與人體血鈣相同)，可在原位被機(jī)體吸收利用，有利于缺損組織的再生性修復(fù)。采用本發(fā)明得到的無機(jī)骨基質(zhì)進(jìn)行骨移植，具有無免疫排異反應(yīng)、生物相容性好、有足夠機(jī)械強(qiáng)度、能滿足被修補(bǔ)組織的力學(xué)要求等優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為步驟一的I得到的骨松質(zhì)進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE染色)后的20倍放大照片。
[0028]圖2為將第一次堿處理后得到的產(chǎn)物先進(jìn)行脫鈣處理，再后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色后的20倍放大照片。
[0029]圖3為梯度高溫處理后得到的產(chǎn)物進(jìn)行蘇木素-伊紅染色后的20倍放大照片。
[0030]圖4為冷凍干燥后得到的產(chǎn)物的照片。

【具體實(shí)施方式】
[0031]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0032]實(shí)施例1、天然無機(jī)骨基質(zhì)的制備
[0033]一、天然無機(jī)骨基質(zhì)的制備
[0034]1、制備骨松質(zhì)
[0035](I)從規(guī)范化管理的屠宰廠中收集剛完成屠宰的豬的新鮮長骨，盡量避免接觸污染物，收集后立即冷凍儲存。
[0036](2)將步驟(I)得到的長骨解凍并充分清洗，切取骨松質(zhì)，然后將骨松質(zhì)切成易于處理的形態(tài)，沖洗去除表面附著物。
[0037]2、天然無機(jī)骨基質(zhì)的制備
[0038](I)脫細(xì)胞處理
[0039]使用表面活性劑溶液浸泡處理骨松質(zhì)。
[0040]本步驟的目的為:破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞破碎溶出，并去除骨組織中大部分的脂肪及脂溶性雜質(zhì)。
[0041]具體步驟:使用0.5g/100ml TritonX-1OO水溶液15±2°C浸泡處理16小時，然后用清水洗滌。
[0042](2)第一次堿處理
[0043]使用堿溶液浸泡處理步驟(I)的產(chǎn)物。
[0044]本步驟的目的為:使骨組織中的非膠原類蛋白變性水解、溶出。
[0045]具體步驟:使用IM NaOH水溶液，6±2°C浸泡處理30min，然后用清水洗滌。
[0046]完成堿溶液浸泡處理后，可將產(chǎn)物切制成需求的規(guī)格，制作時需考慮后期處理對規(guī)格的影響。
[0047](3)將步驟(2)的產(chǎn)物進(jìn)行梯度高溫處理(其中前3階溫度處理的目的是去除有機(jī)成分，第4階溫度處理為高溫熔融處理)，包括如下步驟:
[0048]①進(jìn)行I階溫度處理。
[0049]本步驟的目的為:使組織充分干燥。
[0050]具體步驟:108 °C煅燒2h。
[0051]②從I階溫度升溫至2階溫度，進(jìn)行2階溫度處理。
[0052]本步驟的目的為:使組織中的有機(jī)成分充分碳化。
[0053]具體步驟:380 V煅燒2h。
[0054]③從2階溫度升溫至3階溫度，進(jìn)行3階溫度處理。
[0055]本步驟的目的為:使已碳化的有機(jī)成分進(jìn)一步氧化，去除全部已碳化的有機(jī)成分。
[0056]具體步驟:780 V煅燒4h。
[0057]④從3階溫度升溫至4階溫度，進(jìn)行4階溫度處理。
[0058]本步驟的目的為:使組織中的無機(jī)成分可控程度上部分熔融。
[0059]具體步驟:1250°C煅燒2h。
[0060](4)第二次堿處理
[0061]使用堿溶液浸泡處理步驟(3)的產(chǎn)物。
[0062]本步驟的目的為:去除骨組織中可能存在的內(nèi)毒素。
[0063]具體步驟:使用IM NaOH水溶液，6±2°C浸泡處理30min，然后用清水洗滌。
[0064](5) pH 值調(diào)節(jié)
[0065]使用PBS緩沖液浸泡處理步驟(4)的產(chǎn)物。
[0066]具體步驟:使用pH7.2的PBS緩沖液，4±2°C浸泡48h，然后用清水洗滌。
[0067]pH7.2的PBS緩沖液的制備方法:取50ml0.2M磷酸二氫鉀水溶液和35ml0.2M氫氧化鈉水溶液，用水稀釋至200ml。
[0068]3、后處理
[0069]取步驟2的(5)的產(chǎn)物，使用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，然后封裝并用鈷-60輻射滅菌(輻照劑量為25KGy)。
[0070]二、無機(jī)骨基質(zhì)制備過程中的顯微形態(tài)
[0071]步驟一的制備過程中的照片見圖1至圖4。
[0072]圖1為步驟一的I得到的骨松質(zhì)進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE染色)后的20倍放大照片，可見孔隙間有大量細(xì)胞及其他間質(zhì)，骨陷窩不清晰，陷窩中可見骨細(xì)胞。
[0073]圖2為將第一次堿處理后得到的產(chǎn)物先進(jìn)行脫鈣處理(脫鈣處理的目的是為了方便觀察；脫鈣處理的方法為:用IM硝酸水溶液浸泡24h)，再后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色后的20倍放大照片，可見孔隙間已無任何細(xì)胞及間質(zhì)殘留，且骨陷窩清晰，其中不見遺傳物質(zhì)。
[0074]圖3為梯度高溫處理后得到的產(chǎn)物進(jìn)行蘇木素-伊紅染色后的20倍放大照片，可見經(jīng)過高溫處理后，已難發(fā)現(xiàn)骨陷窩的存在，即骨陷窩已經(jīng)熔融閉合。
[0075]圖4為冷凍干燥后得到的產(chǎn)物的照片，可見經(jīng)梯度高溫處理后，產(chǎn)物的邊緣已趨于圓滑。
[0076]實(shí)施例2、天然無機(jī)骨基質(zhì)的制備
[0077]1、制備骨松質(zhì)
[0078](I)從規(guī)范化管理的屠宰廠中收集剛完成屠宰的牛的新鮮長骨，盡量避免接觸污染物，收集后立即冷凍儲存。
[0079](2)將步驟(I)得到的長骨解凍并充分清洗，切取骨松質(zhì)，然后將骨松質(zhì)切成易于處理的形態(tài)，沖洗去除表面附著物。
[0080]2、天然無機(jī)骨基質(zhì)的制備
[0081](I)脫細(xì)胞處理
[0082]使用表面活性劑溶液浸泡處理骨松質(zhì)。
[0083]具體步驟:使用2g/100ml Tween-80水溶液28±2°C浸泡處理5小時，然后用清水洗漆。
[0084](2)第一次堿處理
[0085]使用堿溶液浸泡處理步驟(I)的產(chǎn)物。
[0086]具體步驟:使用IM KOH水溶液，23 ±2 °C浸泡處理15min，然后用清水洗滌。
[0087]完成堿溶液浸泡處理后，可將產(chǎn)物切制成需求的規(guī)格，制作時需考慮后期處理對規(guī)格的影響。
[0088](3)將步驟(2)的產(chǎn)物進(jìn)行梯度高溫處理(其中前3階溫度處理的目的是去除有機(jī)成分，第4階溫度處理為高溫熔融處理)，包括如下步驟:
[0089]①進(jìn)行I階溫度處理。
[0090]具體步驟:110°C煅燒1.5h。
[0091]②從I階溫度升溫至2階溫度，進(jìn)行2階溫度處理。
[0092]具體步驟:400°C煅燒1.5h。
[0093]③從2階溫度升溫至3階溫度，進(jìn)行3階溫度處理。
[0094]具體步驟:800°C煅燒3h。
[0095]④從3階溫度升溫至4階溫度，進(jìn)行4階溫度處理。
[0096]具體步驟:1300°C煅燒1.5h。
[0097](4)第二次堿處理
[0098]使用堿溶液浸泡處理步驟(3)的產(chǎn)物。
[0099]具體步驟:使用IM KOH水溶液，23 ±2 °C浸泡處理15min，然后用清水洗滌。
[0100](5) pH 值調(diào)節(jié)
[0101]使用PBS緩沖液浸泡處理步驟(4)的產(chǎn)物。
[0102]具體步驟:使用pH7.8的PBS緩沖液，6±2°C浸泡16h，然后用清水洗滌。
[0103]pH7.8的PBS緩沖液的制備方法:取35.9g磷酸氫二鈉，加水溶解，并用水稀釋至500ml，得到甲液；取2.76g磷酸二氫鈉，加水溶解，并用水稀釋至100ml，得到乙液；將91.5ml甲液與8.5ml乙液混合。
[0104]3、后處理
[0105]取步驟2的(5)的產(chǎn)物，使用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，然后封裝并用鈷-60輻射滅菌(輻照劑量為15KGy)。
[0106]實(shí)施例3、天然無機(jī)骨基質(zhì)的制備
[0107]1、制備骨松質(zhì)
[0108](I)從規(guī)范化管理的屠宰廠中收集剛完成屠宰的豬的新鮮長骨，盡量避免接觸污染物，收集后立即冷凍儲存。
[0109](2)將步驟(I)得到的長骨解凍并充分清洗，切取骨松質(zhì)，然后將骨松質(zhì)切成易于處理的形態(tài)，沖洗去除表面附著物。
[0110]2、天然無機(jī)骨基質(zhì)的制備
[0111](I)脫細(xì)胞處理
[0112]使用表面活性劑溶液浸泡處理骨松質(zhì)。
[0113]具體步驟:使用lg/100ml Tween-80水溶液6±2°C浸泡處理168小時，然后用清水洗漆。
[0114](2)第一次堿處理
[0115]使用堿溶液浸泡處理步驟(I)的產(chǎn)物。
[0116]具體步驟:使用0.5M NaOH水溶液，2±2°C浸泡處理120min，然后用清水洗滌。
[0117]完成堿溶液浸泡處理后，可將產(chǎn)物切制成需求的規(guī)格，制作時需考慮后期處理對規(guī)格的影響。
[0118](3)將步驟(2)的產(chǎn)物進(jìn)行梯度高溫處理(其中前3階溫度處理的目的是去除有機(jī)成分，第4階溫度處理為高溫熔融處理)，包括如下步驟:
[0119]①進(jìn)行I階溫度處理。
[0120]具體步驟:105°C煅燒3h。
[0121]②從I階溫度升溫至2階溫度，進(jìn)行2階溫度處理。
[0122]具體步驟:350°C煅燒3h。
[0123]③從2階溫度升溫至3階溫度，進(jìn)行3階溫度處理。
[0124]具體步驟:750°C煅燒5h。
[0125]④從3階溫度升溫至4階溫度，進(jìn)行4階溫度處理。
[0126]具體步驟:1200°C煅燒3h。
[0127](4)第二次堿處理
[0128]使用堿溶液浸泡處理步驟(3)的產(chǎn)物。
[0129]具體步驟:使用0.5M NaOH水溶液，2±2°C浸泡處理120min，然后用清水洗滌。
[0130](5) pH 值調(diào)節(jié)
[0131]使用PBS緩沖液浸泡處理步驟(4)的產(chǎn)物。
[0132]具體步驟:使用pH6.5的PBS緩沖液，2±2°C浸泡168小時，然后用清水洗滌。
[0133]pH6.5的PBS緩沖液的制備方法:取0.68g磷酸二氫鉀，加15.2ml0.1M氫氧化鈉水溶液，用水稀釋至100ml。
[0134]3、后處理
[0135]取步驟2的(5)的產(chǎn)物，使用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，然后封裝并用鈷-60輻射滅菌(輻照劑量為30KGy)。
[0136]實(shí)施例4、天然無機(jī)骨基質(zhì)的抗壓強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)
[0137]參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T1448-2005《纖維增強(qiáng)塑料壓縮性能實(shí)驗(yàn)方法》分別檢測實(shí)施例1的步驟一的3得到的天然無機(jī)骨基質(zhì)、實(shí)施例2的步驟3得到的天然無機(jī)骨基質(zhì)、實(shí)施例3的步驟3得到的天然無機(jī)骨基質(zhì)、實(shí)施例1的步驟一的2的(2)中第一次堿處理后得到的產(chǎn)物和實(shí)施例1的步驟一的2的(3)的③中3階溫度處理后得到的產(chǎn)物和的抗壓強(qiáng)度，具體步驟如下:
[0138]1、將試樣制成抗壓橫截面積40-80mm2,高約為10_15mm的立方體或圓柱體,兩抗壓面切平，試樣邊緣平滑無缺口，舍去邊緣有缺陷的試樣。
[0139]2、用游標(biāo)卡尺測量試樣長度、寬度、高或直徑、高，準(zhǔn)確至0.01mm，每個項(xiàng)目測量三次并計(jì)算出其平均值。
[0140]3、將試樣置于試驗(yàn)機(jī)(微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)，深圳市新三思計(jì)量技術(shù)有限公司，型號CMT8502)的兩壓板之間，使試樣縱軸與上下夾具中心連線相重合，設(shè)置試樣定變形5mm,按照10mm/min的規(guī)定速度，開動試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)試驗(yàn)機(jī)返車時，記錄試樣屈服負(fù)荷力值和屈服強(qiáng)度。
[0141]實(shí)施例1的步驟一的3得到的天然無機(jī)骨基質(zhì)的抗壓強(qiáng)度為1.2±0.3MPa。實(shí)施例I的步驟一的2的(2)中第一次堿處理后得到的產(chǎn)物的抗壓強(qiáng)度為2.0±0.5MPa。實(shí)施例I的步驟一的2的(3)的③中3階溫度處理后得到的產(chǎn)物稍碰即碎，無法進(jìn)行抗壓強(qiáng)度檢測。
[0142]實(shí)施例2的步驟3得到的天然無機(jī)骨基質(zhì)的抗壓強(qiáng)度為1.3±0.2MPa。
[0143]實(shí)施例3的步驟3得到的天然無機(jī)骨基質(zhì)的抗壓強(qiáng)度為1.3±0.3MPa。
[0144]實(shí)施例5、動物實(shí)驗(yàn)
[0145]實(shí)驗(yàn)動物:新西蘭白兔、清潔級、6個月齡，體重3_4kg。
[0146]1、將實(shí)驗(yàn)動物麻醉，從左后肢股骨前外側(cè)縱切口，長約10cm，切開皮膚、皮下組織和深筋膜，沿股直肌與股外側(cè)肌間隙銳性分開進(jìn)入，不切開骨膜，于股骨前外側(cè)放置已塑形好的4孔普通鋼板(鋼板預(yù)彎一定的弧度，約5° -8°，以使鋼板和股骨向前外凸的弧度相吻合)，電鉆鉆孔后依次旋入4枚螺釘固定。于鋼板第2孔、第3孔之間，以線鋸鋸斷股骨一偵牝用直尺測量股骨1.5cm長，并標(biāo)記好另一端截骨線，線鋸截?cái)?，并切除該段對?yīng)的骨膜，造成標(biāo)準(zhǔn)的1.5cm段缺性骨與骨膜缺損。
[0147]2、將完成步驟I的動物分組處理:
[0148]實(shí)驗(yàn)組-1:將實(shí)施例1的步驟一的3得到的天然無機(jī)骨基質(zhì)修剪為合適的形態(tài)后修補(bǔ)1.5cm段的骨缺損，然后用生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合，切口用敷料包扎，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4 X 15U預(yù)防感染(每天兩次，共3天)；
[0149]實(shí)驗(yàn)組-2:將實(shí)施例2的步驟3得到的天然無機(jī)骨基質(zhì)修剪為合適的形態(tài)后修補(bǔ)1.5cm段的骨缺損，然后用生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合，切口用敷料包扎，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4 X 15U預(yù)防感染(每天兩次，共3天)；
[0150]實(shí)驗(yàn)組-3:將實(shí)施例3的步驟3得到的天然無機(jī)骨基質(zhì)修剪為合適的形態(tài)后修補(bǔ)
1.5cm段的骨缺損，然后用生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合，切口用敷料包扎，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4 X 15U預(yù)防感染(每天兩次，共3天)；
[0151]對照組:用生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合，切口用敷料包扎，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素鈉4 X 15U預(yù)防感染(每天兩次，共3天)。
[0152]術(shù)后18周時，解剖動物并觀察股骨形態(tài)。對照組動物可見骨缺損區(qū)生成骨痂，但骨缺損區(qū)仍無骨性連接，其內(nèi)大部分仍然是由肉芽疤痕填充，骨缺損未愈合。實(shí)驗(yàn)組-1、實(shí)驗(yàn)組-2、實(shí)驗(yàn)組-3中，動物的骨缺損基本愈合。
【權(quán)利要求】
1.一種制備無機(jī)骨基質(zhì)的方法，包括如下步驟: (1)使用表面活性劑溶液浸泡處理離體的骨松質(zhì)； (2)使用堿溶液浸泡處理步驟(I)的產(chǎn)物； (3)將步驟(2)的產(chǎn)物進(jìn)行梯度高溫處理；所述梯度高溫處理依次包括如下步驟:① 105-110°C煅燒 1.5-3 小時；(2) 3500C _400°C煅燒 1.5-3 小時；? 750°C _800°C煅燒 3-5小時；@ 1200°C -1300°C煅燒 1.5-3 小時； (4)使用堿溶液浸泡處理步驟(3)的產(chǎn)物； (5)使用PBS緩沖液浸泡處理步驟(4)的產(chǎn)物，得到無機(jī)骨基質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(I)中:所述表面活性劑為TritonX-1OO或Tween-80 ;所述表面活性劑溶液中，表面活性劑的濃度為0.5-2g/100ml ;所述浸泡處理的條件為:4-30°C、5-168小時。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中:所述堿溶液為堿性化合物溶液；所述堿性化合物為NaOH或KOH ;所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度為0.5-1M ;所述浸泡處理的條件為:0-25°C、15-120分鐘。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:所述步驟(4)中:所述堿溶液為堿性化合物溶液；所述堿性化合物為NaOH或KOH ;所述堿性化合物溶液中，所述堿性化合物的濃度為0.5-1M ;所述浸泡處理的條件為:0-25°C、15-120分鐘。
5.如權(quán)利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于:所述步驟(5)中:所述PBS緩沖液的PH為6.5-7.8 ;所述浸泡處理的條件為:0-8°C、16-168小時。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中還包括如下步驟:將所述步驟(5)的產(chǎn)物依次進(jìn)行冷凍干燥和滅菌。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述滅菌為鈷-60輻射滅菌。
8.如權(quán)利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于:所述骨松質(zhì)為動物長骨的骨松質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述動物為豬或牛。
10.權(quán)利要求1至9中任一所述方法制備得到的無機(jī)骨基質(zhì)。
【文檔編號】A61L27/36GK104174067SQ201310192571
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月22日
【發(fā)明者】孫先昌, 董佳桓, 林萍, 馬百聚, 郭松, 蔣紹霞 申請人:煙臺正海生物技術(shù)有限公司