小分子rna作為免疫抑制劑的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小分子RNA作為免疫抑制劑的應(yīng)用。堿基序列為SEQ?ID?NO:1的小分子RNA作為免疫抑制劑在制備由NFAT信號通路異常激活所引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的小分子RNA以NFAT為靶點，通過抑制NFAT信號通路中的關(guān)鍵因子而抑制NFAT信號通路，能夠顯著抑制NFAT的活性，可作為一種新的免疫抑制劑用于治療器官移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病。本發(fā)明的小分子RNA是人體的內(nèi)源性RNA，對人體的毒性較小。
【專利說明】小分子RNA作為免疫抑制劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,更具體地,本發(fā)明涉及一種microRNA (miRNA)的應(yīng)用，特別是涉及miR-124a作為免疫抑制劑在制備由NFAT信號通路異常激活所引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫抑制劑(immunosuppressant)是一類通過抑制細胞及體液免疫反應(yīng)而使組織損傷得以減輕的化學(xué)或生物物質(zhì)，可抑制機體異常的免疫反應(yīng)，主要應(yīng)用于器官移植抗排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病(如類風濕性關(guān)節(jié)炎、風濕熱、膠原病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮膚真菌病、強直性脊柱炎、膜腎球腎炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、炎性腸病和自身免疫性溶血性貧血等)的治療。
[0003]microRNAs CmiRNAs)是一類長約22個核苷酸(nt)、非編碼的小分子單鏈RNA，廣泛存在于動物、植物和病毒中，對基因表達起負調(diào)控作用。成熟的單鏈miRNA與Dicer和 Argonaute2 等蛋白一起形成 RNA 介導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-1nduced silencing complex,RISC)，特異性地結(jié)合靶基因mRNA的:V -非翻譯區(qū)(Un-translated Region, UTR)，抑制靶基因mRNA的翻譯或促進其降解，從而起到在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)作用。
[0004]自1993年在線蟲中發(fā)現(xiàn)首個miRNA以來,現(xiàn)已證實miRNA參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化、凋亡、胚胎發(fā)育、器官形成和疾病發(fā)生等許多生物學(xué)過程。迄今，在miRBase (Ver: 18)登錄的成熟miRNA序列有21634條，來源于168個物種，其中人有2154條，預(yù)測調(diào)控60%的人類基因。目前認為，miRNA的表達被精確的調(diào)控，具有嚴格的時空特異性；每個miRNA可以有多個潛在的靶基因，對多條信號通路都具有潛在的調(diào)控作用；同時，同一個基因又有可能受到多個miRNA協(xié)同調(diào)節(jié)。
[0005]T 細胞核因子(nuclear factor of activated T, NFAT)是一組在哺乳動物細胞內(nèi)廣泛表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。迄今已發(fā)現(xiàn)的NFAT蛋白可分為5個:NFATcl、NFATc2、NFATc3、NFATc4和NFAT5，其中，NFATc 1-4的激活均依賴于胞內(nèi)鈣信號途徑。細胞內(nèi)NFAT的活化分三個階段:脫磷酸、入核和對DNA親和力的提升，其功能的發(fā)揮主要受鈣調(diào)磷酸酶calcineurin (CaN)的調(diào)節(jié)。CaN是唯一受Ca2+/ 鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM)調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，其體內(nèi)主要的底物是NFAT家族蛋白。靜息狀態(tài)下，NFAT以高度磷酸化無活性狀態(tài)存在于細胞質(zhì)；在刺激條件下，胞內(nèi)Ca2+水平升高，激活CaN，使NFAT迅速脫磷酸，暴露出核定位序列，向核移位；入核后的NFAT與靶基因啟動子上的特定序列結(jié)合，從而誘導(dǎo)這些基因的表達。因此，NFAT主要通過Ca2+/CaN信號路徑被激活，NFAT的激活和核質(zhì)穿梭主要是通過CaN與組成型激酶的動力學(xué)相互作用來調(diào)控的。
[0006]NFAT在免疫系統(tǒng)的發(fā)育、成熟和功能中起著關(guān)鍵性的作用，它們在多數(shù)免疫細胞中均有表達，并作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)許多細胞因子(如IL22、IL24、IL23、IL210、IL213、IFN2 Y和GM2CSF等)、細胞表面配體(如⑶40L和⑶95L等)的表達。因此，NFAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙會引起多種細胞因子的缺乏和嚴重的免疫缺陷。NFAT缺陷小鼠、NFATl和NFAT2雙敲除小鼠和NFATl和NFAT4雙敲除小鼠的免疫表型都證明了 NFAT在T細胞活化和發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。此外，最新的研究顯示，活化的NFAT能促進乳腺癌細胞和直腸癌細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移。在心肌細胞中，活化的NFATs結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子GATA-4，激活心肌肥厚基因的轉(zhuǎn)錄。研究證實，NFATc3基因在介導(dǎo)鈣神經(jīng)素下游的心肌肥厚反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。NFAT的激活或異常表達與自身免疫性疾病、腫瘤轉(zhuǎn)移、心肌肥大等眾多疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系。因此，抑制NFAT激活已成為開發(fā)新型免疫抑制劑的靶點。
[0007]環(huán)孢霉素(cyclosporin A, CsA)和FK506是以NFAT為靶點的藥物，它們分別結(jié)合其胞內(nèi)受體免疫嗜素(immunophilin):環(huán)孢親和素(cyclophilin A, CyPA)和12kD的FK506結(jié)合蛋白(FK506binding protein, FKBP12)，然后與CaN形成三聚體復(fù)合物，最終抑制了 NFAT的活化及下游靶基因的表達。這2種藥物是目前臨床使用的最為有效的免疫抑制藥物，為器官移植迎來了革命性時代。但是，由于這類藥物直接抑制了 CaN的磷酸酶活性，具有嚴重的副反應(yīng)(如腎毒性、神經(jīng)毒性、高血壓、糖尿病、胃腸道紊亂等)。鑒于此，人們迫切需要效能更高、毒性更低的新型免疫抑制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種小分子RNA作為免疫抑制劑的新應(yīng)用。
[0009]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案:
[0010]小分子RNA作為免疫抑制劑在制備由NFAT信號通路異常激活所引起的疾病的藥物中的應(yīng)用，所述小分子RNA的堿基序列為SEQ ID NO:1所示。
[0011]在其中一個實施例中，所述由NFAT信號通路異常激活所引起的疾病為腫瘤轉(zhuǎn)移、心肌肥大、自身免疫性疾病或器官移植排斥反應(yīng)。
[0012]在其中一個實施例中，所述小分子RNA為化學(xué)修飾的小分子RNA。
[0013]在其中一個實施例中，所述小分子RNA為單鏈RNA、雙鏈RNA或插于質(zhì)粒載體中的雙鏈DNA。
[0014]本發(fā)明的發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，構(gòu)建了 300個miRNA過表達載體，結(jié)合NFAT熒光素酶報告載體(pNFAT-Luc)和內(nèi)參phRL_TK質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293A細胞，在靜止和PMA/1nomycin激活鈣離子通路后分別檢測熒光素酶的活性。最終發(fā)現(xiàn)了在兩種條件下均顯著抑制NFAT活性的miRNA為miR_124a。
[0015]本發(fā)明利用miRanda及Targetscan等軟件預(yù)測miR_124a的祀分子,在上百個預(yù)測的靶基因中，其中有NFATcl,CAMTAl (鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子I)和PTBPl (多嘧啶序列結(jié)合蛋白1)，而CAMTAl和PTBPl也參與NFAT活性的調(diào)控。經(jīng):V -UTR實驗及蛋白質(zhì)水平檢測均證明過表達miR-124a對NFATcl，CAMTAl和PTBPl具有抑制作用，驗證了 NFATcl，CAMTAl 和 PTBPl 是 miR_124a 的靶基因。
`[0016]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)人骨肉瘤細胞系(U2-0S)在刺激狀態(tài)下，過表達miR_124a可以有效抑制共轉(zhuǎn)染的cMyc-NFATc2的激活(去磷酸化)以及AcGFP-NFATcl的入核。在刺激狀態(tài)下，穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-124a的Jurket T細胞中NFAT的下游靶基因IL2的生成顯著降低。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0018]1、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)小分子RNA miR-124a以NFAT為靶點，通過抑制NFAT信號通路中的關(guān)鍵因子而抑制NFAT信號通路，能夠顯著抑制NFAT的活性，可作為一種新的免疫抑制劑用于治療由NFAT信號通路異常激活所引起的疾病。
[0019]2、本發(fā)明的小分子RNA是人體的內(nèi)源性RNA，對人體的毒性較小。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1 顯示了 miR-124a 直接調(diào)控 NFATcl;其中 A 為 miR_124a 與 NFATcl 的 UTR 的結(jié)合位點為過表達miR-124a或其突變體對NFATcl_UTR熒光素酶報告質(zhì)粒的影響；C、D為分別突變兩個預(yù)測的結(jié)合位點后，驗證miR-124a可能的結(jié)合位點；E、F、G為過表達miR-124a后對內(nèi)源NFATcl的蛋白質(zhì)表達水平的影響；
[0021]圖2為本發(fā)明實施例3中過表達miR_124a對C-myC-NFATC2在激活狀態(tài)下去磷酸化的抑制作用結(jié)果圖；
[0022]圖3為本發(fā)明實施例4中過表達miR_124a對AcGFP-NFATcl在激活狀態(tài)下入核的抑制作用結(jié)果圖；
[0023]圖4為本發(fā)明實施例5中Jurkat T細胞過表達miR_124a對NFAT下游基因IL2在激活狀態(tài)下的生成的抑制作用結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0024]以下結(jié)合附圖和具體實施例來詳細說明本發(fā)明。
[0025]如無特別說明，以下實施例中所采用的各種原料均來源于市售。所采用的方法均為常規(guī)技術(shù)手段。
[0026]實施例1小分子RNA miR-124a的制備
[0027]miR_l24a 的成熟序列為` 5，-uaaggcacgcggugaaugcc-3，(20bp, SEQ ID N0:1),可通過以下方式制得。
[0028]1.化學(xué)合成
[0029]miR_124a的模擬物(miRNA mimic)由廣州銳博生物科技有限公司合成，為雙鏈RNA,能模擬內(nèi)源性成熟miR-124a高水平表達；標準純化，于_20°C保存。用無RNA酶的水溶解配制成25 μ M的儲存液，置_80°C備用，用時稀釋成所需的濃度。
[0030]2.DNA載體或病毒載體介導(dǎo)miR_124a的表達
[0031](I)表達pr1-miR_124a載體的制備
[0032]在miRBase(http://www.mirbase.0rg/)數(shù)據(jù)庫中得到人的 miR_124a 的成熟序列和前體序列(pre-miRNA)信息。分析表明，miR_124a的成熟序列在人類基因組中有三個前體序列:miR-124a-l、miR-124a-2和miR-124a_3，它們從人類基因組不同位置轉(zhuǎn)錄，并表達出具有相同成熟序列的miR-124a分子。以前體序列miR-124a-2為例，在人類基因組數(shù)據(jù)庫中找到在成熟序列兩側(cè)各約200~300bp的側(cè)翼序列，依據(jù)側(cè)翼序列設(shè)計一對引物，并分別加上XhoI及EcoRI的酶切位點和相應(yīng)的保護堿基，上游引物為5’-TCAGCTCGAGAGGCGTGTGCTGTAAATGGC-3 ’，下游引物為 5 ’ -TGCGAATTCCTGGAATATTTGCACAGGCG-3 ’。以人基因組 DNA 為模板，通過設(shè)計的引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)熱4分鐘，95°C 40秒、55°C 50秒、72°C 2分40秒進行35個循環(huán)，72度延伸10分鐘。將擴增的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，按膠回收試劑盒(Ε.Z.N.A Gel Extration Kit, Omega)操作說明進行回收。然后用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶(TAKARA)進行雙酶切，將酶切后的PCR片段按DNA純化試劑盒(E.Z.N.ACycle-Pure Kit, Omega)操作說明進行回收后作為插入片段。表達載體有兩種,分別為DNA載體pENTR/CMV-EGFP及慢病毒載體pLVX-CMV_EGFP-ccdb (均由本申請的發(fā)明人所在實驗室通過常規(guī)方法構(gòu)建得到，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過常規(guī)方法構(gòu)建)。載體均以XhoI和EcoRI (TAKARA)進行雙酶切后，利用與回收PCR產(chǎn)物相同的步驟進行純化，插入位點均為EGFP (增強型綠色熒光蛋白)終止子之后。將插入片段與載體片段(摩爾比=3:1~10:1)利用T4連接酶(Promega)于16°C水浴連接過夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細胞STBL3，37°C培養(yǎng)過夜后挑取生長情況良好的單菌落在含有載體相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液中進行擴增。提取質(zhì)粒(Plasmid Mini Kit 1100, Omega)后進行測序驗證(Invitrogen)。
[0033]制得的DNA載體可轉(zhuǎn)染入細胞，瞬時表達miR_124a，進行相關(guān)功能研究；而制得的慢病毒載體需通過以下步驟發(fā)揮作用。[0034](2)慢病毒的包裝和感染
[0035]慢病毒包裝所需細胞系為293T細胞系，所需質(zhì)粒包括慢病毒表達載體pLVX-miRNA和病毒包裝質(zhì)粒(5質(zhì)粒體系的第四代包裝質(zhì)粒，Clontech)，在接種細胞及包裝病毒的整個過程中，293T培養(yǎng)所用血清必須為不含四環(huán)素的血清(FBS-tet-off，F(xiàn)TEU/0828812，Biontex)。細胞轉(zhuǎn)染采用 PEI 轉(zhuǎn)染試劑(Polysciences)，用 IOmM NaCl 溶液分別稀釋質(zhì)粒和PEI溶液至相應(yīng)的體積，將質(zhì)粒部分和PEI部分混合后室溫靜置約10分鐘，緩慢逐滴加入含有細胞培養(yǎng)液中，輕輕轉(zhuǎn)動幾次使液體分布均勻。轉(zhuǎn)染6小時后移走含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液，更換新鮮利用Tet-ofT血清配制的培養(yǎng)液。
[0036]轉(zhuǎn)染48-72小時后，收集含有病毒顆粒的細胞培養(yǎng)液，4000rpm室溫離心10分鐘以去除沉底的細胞碎片，將上清液分裝后，置于_80°C備用。
[0037]包裝好的慢病毒可用于感染所選的細胞，通過抗生素的篩選，殺死沒有感染成功的細胞，存活的細胞均可穩(wěn)定過表達miR-124a。
[0038]實施例2miR_124a的靶基因的驗證
[0039]細胞培養(yǎng):293A細胞(購自 ATCC, Manassas, VA), 10%FBS_DMEM 培養(yǎng)基(FBS 購自Gibco, DMEM購自Hyclone)培養(yǎng)。收集生長狀態(tài)良好的細胞，離心計數(shù)，以6 X IO4/孔接種于24孔板內(nèi)，37 °C，5%C02培養(yǎng)24h。
[0040]轉(zhuǎn)染:待細胞的密度達60-70%時用PEI轉(zhuǎn)染細胞，共轉(zhuǎn)染3’ -UTR報告載體或突變的 3’ -UTR 報告載體(50ng)、miRNA 過表達載體 pENTR/CMV-EGFP_miR-124a 或 pENTR/CMV-EGFP-controI (500ng)和內(nèi)參載體phRL-TK (IOng),每組實驗做3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染兩天后，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2次后用SOyLlXPassive Lysis Buffer裂解細胞。
[0041]突光素酶檢測:利用Dual-Luciferase Reporter Assay System(E1910, Promega)試劑盒參考其說明書進行熒光素酶活性檢測，用螢火蟲熒光素酶數(shù)值除以內(nèi)參海腎熒光素酶讀值，即可得到校正的NFAT活性數(shù)值。將NFAT活性數(shù)值與pENTR/CMV-EGFP-control對照組相比較。
[0042]如圖1B所示，與對照相比，過表達miR_124a組(包括miR-124a-l，miR-124a_2，和miR-124a-3)的NFAT活性明顯降低，說明該基因有可能為miR_124a的靶基因。在此基礎(chǔ)上針對預(yù)測的結(jié)合位點構(gòu)建3’-UTR的突變載體NFAT-UTR BS1-mu t和NFAT-UTR BS2_mut，利用突變載體再次進行雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗，如圖1C所示，相比野生型的UTR，每個結(jié)合位點的突變均引起熒光素酶活性的恢復(fù)，表明兩個位點均可結(jié)合，但第二個位點更重要。進一步實驗驗證表明，過表達miR-124a可直接通過靶向NFATcl的3’ -UTR抑制NFATcl蛋白的表達(圖1E)，也可抑制內(nèi)源性NFATclmRNA和蛋白的表達水平(圖1F、G)。
[0043]結(jié)果表明:miR-124a通過靶向NFATcl的3’ -UTR抑制NFATcl的表達。
[0044]實施例3miR_124a對人胚腎上皮細胞系(293T) NFAT活性的抑制
[0045]細胞培養(yǎng):293T細胞(購自 ATCC, Manassas, VA), 10%FBS_DMEM 培養(yǎng)基(FBS 購自Gibco，DMEM購自Hyclone)培養(yǎng)。收集生長狀態(tài)良好的細胞，離心計數(shù)，以3 X IO5每孔接種于六孔板內(nèi)，37 0C，5%C02培養(yǎng)24h。
[0046]轉(zhuǎn)染:將293T細胞(3X IO5/孔)接種于6孔板，培養(yǎng)過夜后待細胞的密度達60-70%時用 PEI 轉(zhuǎn)染細胞，同時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pLVX-cMyc-NFATc2(300ng)和 pENTR/CMV-EGFP_miR-124a(1500ng)，對照組共轉(zhuǎn)染 pLVX-cMyc-NFATc2 和 pENTR/CMV-EGFP-control。轉(zhuǎn)染兩天后用終濃度為I μ M的1nomycin (Sigma)和終濃度為ImM的CaCl2處理細胞，時間分別為0、20、40和60分鐘。
[0047]Western-blot檢測:收集細胞總蛋白，經(jīng)蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳，用ant1-cMyc抗體檢測磷酸化和去磷酸化的NFATc2 (圖2),在靜止狀態(tài)下，c_Myc_NFATc2主要以磷酸化狀態(tài)(高分子量帶)分布在細胞中；而在1nomycin刺激下,磷酸化的NFAT迅速去磷酸化變?yōu)榛罨瘧B(tài)的NFAT (分子量變小)。
[0048]如圖2所示，細胞在激活60min時，對照組去磷酸化的NFATc2顯著多于磷酸化的NFATc2(比值約為4.17)，在過表達miR-375組(作為陰性對照)中，去磷酸化的NFATc2也明顯多于磷酸化的NFATc2(比值約為1.791)，而在過表達miR-124a組中，去磷酸化的NFATc2依然少于磷酸化NFATc2 (比值為0.64)。
[0049]結(jié)果表明:miR-124a對NFATc2的去磷酸化具有顯著的抑制作用(圖2)。實施例4miR-124a對人骨肉瘤細胞系(U2-0`S) NFAT活性的抑制
[0050]細胞培養(yǎng):U2_0S細胞(購自 ATCC, Manassas, VA), 10%FBS_DMEM 培養(yǎng)基(FBS 購自Gibco，DMEM購自Hyclone)培養(yǎng)。收集生長狀態(tài)良好的細胞，離心計數(shù)，以3 X IO5每孔接種于六孔板內(nèi)，37 0C，5%C02培養(yǎng)24h。
[0051]轉(zhuǎn)染:待細胞長至30%~50%，利用PEI法共轉(zhuǎn)染表達綠色熒光融合蛋白AcGFP-NFATcl 的載體(IOOng)和 miRNA 過表達載體 pENTR/Ubc-miR-124 或空載體 pENTR/Ubc-Con (600ng)，48h后，利用不含有血清的DMEM培養(yǎng)液配制終濃度為I μ M的1nomycin和10ng/mL的PMA的處理液，刺激細胞I小時。到時間后，迅速棄去孔板中含有藥物的培養(yǎng)液，用PBS清洗2次，用4%多聚甲醛覆蓋細胞，室溫固定10-20分鐘。然后棄去固定液，用PBS清洗2-3次后，每孔加入約250 μ L適當稀釋的DAPI染料(KGA215，凱基生物)，室溫染色約5分鐘，棄去染料，PBS清洗2-3次。
[0052]熒光顯微鏡監(jiān)測:通過活細胞熒光顯微鏡實時觀察綠色熒光融合蛋白(AcGFP-NFATcl)在細胞中的分布情況，如圖3所示，在無刺激的靜息細胞中，幾乎所有的AcGFP-NFATcl均處于細胞質(zhì)中。在1nomycin/PMA刺激I小時后，基本上所有AcGFP-NFATcl蛋白均發(fā)生核轉(zhuǎn)移。然而，盡管在1nomycin/PMA刺激條件下，miR-124a的過表達導(dǎo)致幾乎所有的AcGFP-NFATcl滯留在細胞質(zhì)中。進一步地說明miR-124a對NFATcl激活及入核的抑制作用。[0053]結(jié)果表明:miR-124a通過抑制NFATcl的入核抑制NFAT活性。
[0054]實施例5miR_124a對人外周血白血病T細胞(Jurkat T) NFAT活性的抑制
[0055]細胞培養(yǎng)Jurkat T 細胞(購自 ATCC, Manassas, VA), 10%FBS_DMEM 培養(yǎng)基(FBS 購自Gibco，DMEM購自Hyclone)培養(yǎng)。收集生長狀態(tài)良好的細胞，接種適量于IOOmm板內(nèi)，37°C，5%C02 培養(yǎng) 24h。
[0056]轉(zhuǎn)染:
[0057]A.將 Iml 表達人 miR_124a 或其突變體(miR-124a_m: 5’ -uuuccgacgcggugaaugcc-3’，對照)的慢病毒與8 μ 1/ml的Polybrene混勻加入培養(yǎng)Jurkat T細胞的IOOmm培養(yǎng)皿中。2天后，感染的Jurkat T細胞用puromycin(0.5 μ g/ml)篩選。篩選后的Jurkat T細胞接種于35mm培養(yǎng)皿，在終濃度為0.5 μ M的1nomycin和10ng/mL的PMA的處理液，刺激細胞6小時。
[0058]B.另外，還通過瞬時轉(zhuǎn)染,將50nM miR_124a mimic或mimic control (購至銳博生物技術(shù)，廣州，中國)通過Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)入Jurkat T細胞,6小時后換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時，在收集細胞前，用1nomycin和PMA刺激細胞6小時。
[0059]qRT-PCR檢測:提取總RNA及通過定量RT-PCR法檢測IL_2mRNA的表達。正向引物的序列是5’ -CCCAAGAAGGCCACAGAACT-3’，反向引物的序列是5’ -TGCTGATTAAGTCCCTGGGTCTTA-3’，以 beta-actin 為內(nèi)參。
[0060]如圖4所示，在1nomycin/PMA刺激6小時后，IL_2mRNA表達顯著上調(diào)，與對照相比，刺激的同時過表達miR-124a卻能顯著抑制IL_2mRNA的表達；而IL-2是NFAT下游的基因，說明miR-124a可通過抑制NFAT的激活，進而抑制下游基因的表達，達到抑制免疫反應(yīng)的作用。
[0061]結(jié)果表明:miR-124a可通過抑制NFAT的活性進而抑制其下游基因的表達水平，通過級聯(lián)效應(yīng)達到抗免疫反應(yīng)的作用。
[0062]以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。
【權(quán)利要求】
1.小分子RNA作為免疫抑制劑在制備由NFAT信號通路異常激活所引起的疾病的藥物中的應(yīng)用，所述小分子RNA的堿基序列為SEQ ID NO:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述由NFAT信號通路異常激活所引起的疾病為腫瘤轉(zhuǎn)移、心肌肥厚、自身免疫性疾病或器官移植排斥反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述小分子RNA為化學(xué)修飾的小分子RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述小分子RNA為單鏈RNA、雙鏈RNA或插于質(zhì)粒載體中的雙鏈DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述小分子RNA是用DNA載體或病毒載體制備得到的。
【文檔編號】A61P37/06GK103505745SQ201310442036
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】茍德明, 康康, 王玉娜, 張小英 申請人:深圳大學(xué)