一種免疫抑制劑誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性cd8+t細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種免疫抑制劑誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法，所述的方法為CD8+T細(xì)胞在TGF?β和RAPA的聯(lián)合誘導(dǎo)下擴(kuò)增。本發(fā)明還提供一種具有免疫抑制功能的CD8+Treg細(xì)胞及其應(yīng)用。其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：本發(fā)明首次在CD8+T細(xì)胞多克隆體外擴(kuò)增體系中添加TGF?β和RAPA，并成功獲得了大量具有顯著的體外抑制功能的CD8+Treg細(xì)胞；隨著多輪擴(kuò)增的進(jìn)行，不僅在細(xì)胞數(shù)上能達(dá)到指數(shù)級(jí)增長，從而達(dá)到臨床細(xì)胞治療需求；并且其活性、純度、表型、無能性、抑制功能等都能維持穩(wěn)定。可用于過繼性輸注治療多種自身免疫性疾病，臨床運(yùn)用潛力巨大。
【專利說明】
一種免疫抑制劑誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞體外擴(kuò)増的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種免疫抑制劑誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞 體外擴(kuò)增的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Tregs)因其強(qiáng)大的免疫抑制功 能已成為針對(duì)Treg細(xì)胞家族研究的熱點(diǎn)，而基于CDS+Tregs的細(xì)胞治療也作為一種新興的 潛在治療手段備受關(guān)注。
[0003] 有研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)CD4+Tregs相似，CD8+Tregs不僅持續(xù)表達(dá)Foxp3這一 Treg細(xì)胞 的標(biāo)志性功能轉(zhuǎn)錄因子，還表達(dá)〇)103、〇)25丄044、61了1?、〇)621^、？381^、(：1'1^-4等分子。2006 年，Uss E.等發(fā)現(xiàn)，整合素家族成員⑶103是⑶8+Tregs的一個(gè)功能分子，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì) 胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互粘附。另外，其它與功能相關(guān)的膜蛋白（如CD39、PD-1、CCR7等） 也相繼被發(fā)現(xiàn)在⑶8+Foxp3+Tregs上表達(dá)，并證實(shí)與其功能密切相關(guān)。CD8+Foxp3+Tregs具有 顯著的體外抑制功能，所涉及的抑制機(jī)制也呈現(xiàn)多樣化。有研究表明，⑶8+Foxp3+Tregs可通 過細(xì)胞間接觸機(jī)制起抑制作用，涉及CTLA-4、Fas-FasL等多個(gè)關(guān)鍵分子介導(dǎo)的免疫抑制途 徑;也可通過分泌一些抑制性細(xì)胞因子，如IL-HKTGF-β等，調(diào)節(jié)微環(huán)境中的免疫平衡，從而 發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控作用。另外，CD8 + LAG3+Foxp3 + Tregs可通過分泌趨化因子配體4(CC Chemokine Ligand 4，CCL4)，直接抑制T細(xì)胞的增殖，減弱免疫應(yīng)答反應(yīng)。同時(shí)，CD8+Foxp3+ Tregs也能通過調(diào)節(jié)其他細(xì)胞類型，如⑶4+Tregs、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells， DCs)、濾泡輔助性T細(xì)胞(Follicular Helper T cells，Tfh)等發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。這些研 究表明，CD8+F〇Xp3+Treg細(xì)胞可通過多種途徑協(xié)同發(fā)揮免疫抑制功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)微環(huán)境的免疫 負(fù)調(diào)控?？梢?，與傳統(tǒng)的⑶4+Tregs相比，CD8+Tregs具有更有效、更穩(wěn)定的抑制功能，能在促 進(jìn)免疫耐受、調(diào)節(jié)機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮更積極的作用。
[0004] 同時(shí)，多項(xiàng)臨床研究結(jié)果表明，與正常人相比，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (RheumatoidArthritis，RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE)、多 發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)、I型糖尿?。═ype IDiabetes Mellitus，IDM)、自身免 疫性腎炎(autoimmune nephritis)等多種自身免疫性疾病患者體內(nèi)，外周血中Treg的數(shù) 量雖然沒有減少，但CD8+Treg的功能明顯減弱?？梢娺@些自身免疫性疾病的發(fā)生與⑶8+ Tregs功能的缺陷具有明顯相關(guān)性。目前，自身免疫性疾病多因無法明確病因及發(fā)病機(jī)理而 很難治愈，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，甚至危及生命。而現(xiàn)在針對(duì)自身免疫病的治療方案多為 使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑。但長期使用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制藥物會(huì)降低人體的整體 免疫功能，造成患者容易受病原體感染以及誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生。因此，有必要尋求新的能促進(jìn) 免疫耐受、平衡機(jī)體免疫系統(tǒng)的治療方法。近年來，基于多種耐受型免疫細(xì)胞(如間充質(zhì)干 細(xì)胞、CD4+Tregs、耐受型DCs等）的細(xì)胞治療備受關(guān)注，并在多種自身免疫性疾病動(dòng)物模型 中被證實(shí)有效。其中，有些過繼性輸注的細(xì)胞治療方法已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，有力的證明了 細(xì)胞治療具有臨床運(yùn)用的可行性和有效性。因此，可以設(shè)想，作為與自身免疫病密切相關(guān)的 CD8+Tregs能誘導(dǎo)免疫耐受，必將成為耐受型細(xì)胞治療療法的"優(yōu)勢(shì)作用細(xì)胞"?；冖?+ Tregs的過繼性治療將成為治療自身免疫性疾病的潛在治療方法，有巨大的臨床運(yùn)用前景。
[0005] 由于⑶8+Foxp3+Tregs在人體內(nèi)含量很少，需經(jīng)過體外誘導(dǎo)擴(kuò)增后才有可能滿足臨 床細(xì)胞治療需求。而目前CD8 + F〇Xp3 + TregS體外多克隆擴(kuò)增還缺乏有效的方法。 Gunnlaugsdottir B等采用anti_CD3抗體、IL_2、TGF_01誘導(dǎo)擴(kuò)增臍帶血單個(gè)核細(xì)胞生成 CD103+CD8+Tregs細(xì)胞，誘導(dǎo)3天后CD25hiFoxp3+細(xì)胞占 CD8+T細(xì)胞的比例小于30%，其中 ⑶103+細(xì)胞的比例約為60% diegmund K等從外周血幼稚⑶8+T細(xì)胞中采用anti-CD3抗體、 IL-2、TGF-0誘導(dǎo)CD8+Foxp3+T細(xì)胞生成，誘生的CD8+Foxp3+T細(xì)胞高表達(dá)CD25和CD28,分泌較 高水平的TNF-cuIFN-γ、顆粒酶B，不分泌IL-17A，CD8+Foxp3+T細(xì)胞對(duì)CD4+效應(yīng)T細(xì)胞體外擴(kuò) 增有較弱的抑制作用。另外，Suzuki Μ等發(fā)現(xiàn)⑶8+T細(xì)胞在較低強(qiáng)度的⑶3和IL-15刺激下能 夠誘生CD45RA+CCR7+F0XP3+Tregs。這種CD8+Tregs對(duì)幼稚型CD4效應(yīng)Τ細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)， 對(duì)記憶型⑶4效應(yīng)T細(xì)胞的抑制作用較弱。
[0006] 目前已有文獻(xiàn)報(bào)道了體外大量擴(kuò)增抗原特異性⑶8+⑶28+Foxp3+Tregs的方法。 Zheng J等采用⑶40活化的B細(xì)胞從幼稚⑶8+T細(xì)胞中有效地誘導(dǎo)擴(kuò)增獲得⑶8high和⑶81?兩 群細(xì)胞，其中CD8high細(xì)胞具有抗原特異性抑制CD4+效應(yīng)T細(xì)胞增殖的能力及較弱的細(xì)胞毒殺 傷作用。誘導(dǎo)擴(kuò)增過程不需要添加其他細(xì)胞因子，內(nèi)源性產(chǎn)生的IFN-γ、IL-2、IL-4、CTLA-4 對(duì)⑶8+Tregs的誘導(dǎo)擴(kuò)增起重要作用。另外他們還通過輸注人PBMC建立了人同種異基因 GVHD人源性小鼠模型來模擬骨髓移植后GVHD的發(fā)生。體外誘導(dǎo)擴(kuò)增的⑶8highTregs以CTLA- 4依賴的方式通過抑制同種異基因反應(yīng)性T細(xì)胞增殖，同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞也有殺傷作用。但這 種體外擴(kuò)增的方法存在的問題是擴(kuò)增時(shí)間較長，擴(kuò)增后的CD8hlghTregS需要用流式細(xì)胞儀 分選，難以符合GMP要求。
[0007] 雖然抗原特異性Treg細(xì)胞具有免疫反應(yīng)專一性強(qiáng)，不影響機(jī)體正?？共≡w以及 抗腫瘤的功能，但是由于大部分自身免疫性疾病還未找到特異性抗原，以及在很多治療過 程中不能及時(shí)獲得供體APC或者等待較長的體外擴(kuò)增時(shí)間，因此，抗原特異性Treg細(xì)胞廣泛 的臨床應(yīng)用目前還較難實(shí)現(xiàn)。另外對(duì)于多克隆Treg細(xì)胞是否會(huì)引起機(jī)體廣泛的免疫抑制反 應(yīng)目前還存在爭(zhēng)議，因?yàn)槊绹鸵獯罄翰＜乙淹瓿闪藘身?xiàng)體外擴(kuò)增臍血和外周血 CD4+Tregs抑制GVHD的I期臨床試驗(yàn)，證明過繼性輸注第三方無關(guān)供者以及多克隆Treg細(xì)胞 對(duì)病人是安全的，對(duì)GVHD的發(fā)生具有抑制作用并且不會(huì)增加病毒感染和腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。 因此，建立⑶8+F〇Xp3+TregS體外多克隆擴(kuò)增的方法具有很重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，將推動(dòng)⑶8 +TregS相關(guān)細(xì)胞治療領(lǐng)域的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種免疫抑制劑誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性CD8+細(xì) 胞體外擴(kuò)增的方法，從而便捷而高效的獲得具有穩(wěn)定抑制功能的調(diào)節(jié)性CD8+細(xì)胞，以滿足 臨床需求。
[0009] 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞的應(yīng)用。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞體外擴(kuò)增的方 法，所述的方法為CD8+T細(xì)胞在TGF-β和雷帕霉素 (Rapamycin，RAPA)的聯(lián)合誘導(dǎo)下擴(kuò)增。
[0012]所述的方法為CD8+T細(xì)胞多克隆體外擴(kuò)增體系中添加 TGF-β和RAPA誘導(dǎo)擴(kuò)增。
[0013]所述的CD8+T細(xì)胞多克隆體外擴(kuò)增體系中包含白細(xì)胞介素-2(IL-2)。
[0014]所述的⑶8+T細(xì)胞多克隆體外擴(kuò)增體系采用包被anti-CD3/CD28抗體的磁珠和IL- 2擴(kuò)增。
[0015] 所述的TGF-β為轉(zhuǎn)化生長因子1 (TGF-βΙ)。
[0016]所述的CD8+T細(xì)胞為人CD8+T細(xì)胞。所述的CD8+T細(xì)胞的來源包括人外周血單個(gè)核細(xì) 胞、臍血單個(gè)核細(xì)胞、經(jīng)動(dòng)員后的外周血單個(gè)核細(xì)胞、骨髓細(xì)胞。
[0017] 所述的方法采用人外周血單個(gè)核細(xì)胞中新鮮分離的⑶8+T細(xì)胞在Anti-CD3/CD28 包被的磁珠刺激下，同時(shí)添加 IL-2，在TGF-βΙ、RAPA聯(lián)合誘導(dǎo)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0018] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種具有免疫抑制功能的調(diào) 節(jié)性CD8+T細(xì)胞，所述的具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞為TGF-β和RAPA聯(lián)合誘導(dǎo)的調(diào) 節(jié)性CD8+T細(xì)胞。
[0019] 為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:所述的具有免疫抑制功能的 調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞在針對(duì)自身免疫性疾病的細(xì)胞治療療法中的應(yīng)用。
[0020] 所述的自身免疫性疾病包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、I型糖 尿病、自身免疫性腎炎等。
[0021] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0022]本發(fā)明建立了一種新的人⑶8+Treg細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，即首次在⑶8+T細(xì)胞多克 隆體外擴(kuò)增體系中添加 TGF-β和RAPA，并成功獲得了大量具有顯著的體外抑制功能的CD8+ Treg細(xì)胞。TGF-i3/RAPA聯(lián)合誘導(dǎo)的⑶8+Treg細(xì)胞隨著多輪擴(kuò)增的進(jìn)行，不僅在細(xì)胞數(shù)上能 達(dá)到指數(shù)級(jí)增長，從而達(dá)到臨床細(xì)胞治療需求;并且其活性、純度、表型、無能性、抑制功能 等都能維持穩(wěn)定?？捎糜谶^繼性輸注治療多種自身免疫性疾病，臨床運(yùn)用潛力巨大。
【附圖說明】
[0023]附圖1A: CD8+Treg-TR體外四輪擴(kuò)增之每輪擴(kuò)增倍數(shù)(R1-R4為第一至第四輪，η = 6)；
[0024] 附圖IB: CD8+Treg-TR體外四輪擴(kuò)增之細(xì)胞總量(R0為起始接種量，R1-R4為第一至 第四輪，n = 6)。
[0025] 附圖2A:體外擴(kuò)增的CD8+Treg-TR細(xì)胞CD8/CD25雙陽性率(Fresh為新鮮分離的CD8+ T細(xì)胞，R1、R4分別為單輪擴(kuò)增和四輪擴(kuò)增的⑶8+Treg-TR，n = 3,圖為其中一組數(shù)據(jù)）；
[0026] 附圖2B:體外擴(kuò)增的CD8+Treg-TR細(xì)胞Foxp3陽性率(R1、R4分別為單輪擴(kuò)增和四輪 擴(kuò)增的CD8+Treg-TR，η = 3，圖為其中一組數(shù)據(jù)）；
[0027]附圖2C:體外擴(kuò)增的CD8+Treg-TR細(xì)胞表面分子陽性率(R1、R4分別為單輪擴(kuò)增和 四輪擴(kuò)增的CD8+Treg-TR，n = 3);
[0028] 附圖2D:體外擴(kuò)增的CD8+Treg-TR細(xì)胞活性(η = 3，圖為其中一組數(shù)據(jù)）。
[0029] 附圖 3:CD8+Treg-TR 對(duì) CD4+效應(yīng) Τ 細(xì)胞增殖的抑制率(CD8+Treg-TR:CD4+T = 0:1，1: 1，1:4，1:16，1:64，11 = 3，圖為其中一組數(shù)據(jù)）。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0031 ]本發(fā)明米用人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC) 中新鮮分離的⑶8+T細(xì)胞在Anti-⑶3/⑶28包被的磁珠刺激下，同時(shí)添加 IL-2,在TGF-βΙ、雷 帕霉素(Rapamycin，RAPA)聯(lián)合誘導(dǎo)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行多輪重復(fù)刺激的廣譜擴(kuò)增。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果表明，TGF-i3/RAPA聯(lián)合誘導(dǎo)的CD8+Treg細(xì)胞(CD8+Tregs-TR)可在體外大量擴(kuò)增并具 有顯著的體外抑制功能，并且隨著多輪擴(kuò)增的進(jìn)行，其活性、純度、表型、無能性、抑制功能 等維持穩(wěn)定。
[0032] 實(shí)施例1 [0033]材料：
[0034] 健康人單個(gè)核細(xì)胞(PBMC);AB血型人血清;淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll);1640培養(yǎng) 液;磷酸鹽緩沖液(PBS);胎牛血清(FBS);人⑶8+細(xì)胞分選試劑盒;Anti-⑶3/⑶28單克隆抗 體包被的免疫刺激磁珠；重組人白細(xì)胞介素2(IL-2);轉(zhuǎn)化生長因子l(TGF-m);雷帕霉素 (RAPA)〇 [0035]方法：
[0036] 1 ·人⑶8+T細(xì)胞的分離與純化(無菌環(huán)境）
[0037] 1.1用Ficoll密度梯度離心法分離白膜血中的PBMC細(xì)胞
[0038] 將一個(gè)單位的白膜血3500rpm離心15min;吸取離心后的濃縮白細(xì)胞層，用原血漿 稀釋，混勻后緩慢重懸于Ficol 1上，密度梯度離心后將白細(xì)胞層吸出；加入PBS洗滌，獲得 PBMC細(xì)胞。
[0039] 1.2用人⑶8+T細(xì)胞分選試劑盒進(jìn)行分選
[0040]使用人CD8+T細(xì)胞分選試劑盒，按其說明書，用免疫磁珠陽性分選步驟從PBMC細(xì)胞 中分選獲得CD8+T細(xì)胞:每1 X 107個(gè)PBMC細(xì)胞中加入80yL的含2%FBS的PBS(FBS-PBS)和20yL 人⑶8+T細(xì)胞分選磁珠，4°C，孵育20min;FBS-PBS洗滌后，細(xì)胞懸液過磁柱;打出吸附在磁柱 上的細(xì)胞，即⑶8+T細(xì)胞。
[0041 ] 2.人⑶8+Tregs-TR細(xì)胞的體外誘導(dǎo)與多輪擴(kuò)增(無菌環(huán)境）
[0042] 2.1將分選獲得的⑶8+T細(xì)胞懸于含1%AB血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞濃度為 1 X 105/mL;加入細(xì)胞因子混合液（含有TGF-β 125ng/mL、RAPA0 · 2yg/mL、IL-21600U/mL)和 Anti-⑶3/⑶28單克隆抗體包被的免疫刺激磁珠(磁珠:細(xì)胞= 4:1);接種于96孔U型底培養(yǎng) 板，終體積為l〇〇yL/孔;置于37°C、5%⑶2及飽和濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，記為第0天。每隔 兩天進(jìn)行半量換液。
[0043] 2.2以"6天擴(kuò)增+1天靜息"記為一個(gè)輪次；重復(fù)刺激四輪后，收集細(xì)胞，即為CD8+ Treg-TR 細(xì)胞。
[0044] 3.人CD8+Treg_TR細(xì)胞的生物學(xué)特征檢測(cè)
[0045] 3.1對(duì)獲得的⑶8+Tregs-TR進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)。
[0046] 3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)0)8+1'代88-了1?細(xì)胞的表面分子(0)103、0)25、0039、(：1'1^-4等） 和Foxp3的陽性表達(dá)率。
[0047] 3.3Annexin V/PI-流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡/死亡率。
[0048] 3.4流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定0)8+1'代88-了1?胞內(nèi)細(xì)胞因子（1?^丫、11^4、幾-2、11^17)的表 達(dá)情況。
[0049] 3.5將⑶8+Tregs-TR與CFSE標(biāo)記的⑶4/⑶8效應(yīng)T細(xì)胞按不同比例混合培養(yǎng)，加入 anti-⑶3/⑶28抗體刺激后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)前后CFSE+細(xì)胞比例，根據(jù)CFSE損耗程度 計(jì)算效應(yīng)T細(xì)胞被抑制程度。
[0050] 結(jié)果：
[0051 ] 1.通過TGF-0/RAPA聯(lián)合誘導(dǎo)可獲得大量的CD8+Tregs-TR
[0052]實(shí)驗(yàn)研究表明，CD8+T細(xì)胞多克隆體外擴(kuò)增體系中（采用包被anti-CD3/CD28抗體 的磁珠和IL-2擴(kuò)增）添加 TGF-β和RAPA能夠誘導(dǎo)擴(kuò)增得到大量的CD8+CD103+Foxp3+Tregs (⑶8+Tregs-TR)，在體外培養(yǎng)8天后擴(kuò)增20-30倍。以"6天擴(kuò)增+1天靜息"為一個(gè)擴(kuò)增輪次進(jìn) 行四輪刺激后，可獲得大量的表型和功能穩(wěn)定的⑶8+Tregs-TR。對(duì)⑶8+Tregs-TR計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì) 后發(fā)現(xiàn)，各輪擴(kuò)增倍數(shù)(R1 = 15.42±1.73，R2 = 15.32±1.33，R3 = 14.58±2.09，R4 = 11.58 ±0.77，圖1A)之間無顯著差異，說明⑶8+Tregs-TR細(xì)胞隨著體外多輪擴(kuò)增的進(jìn)行，其擴(kuò)增 能力并未下降。經(jīng)四輪擴(kuò)增后，細(xì)胞總數(shù)可達(dá)原始接種細(xì)胞數(shù)的10000倍以上(最大擴(kuò)增能 力，圖1B)，說明TGF-i3/RAPA聯(lián)合誘導(dǎo)的CD8+Tregs-TR可在體外進(jìn)行多輪擴(kuò)增，獲得滿足臨 床治療需求的細(xì)胞量。
[0053] 2.體外誘導(dǎo)擴(kuò)增的CD8+Treg-TR純度高、表型穩(wěn)定、活性強(qiáng)
[0054]收集TGF-i3/RAPA聯(lián)合誘導(dǎo)單輪擴(kuò)增和四輪擴(kuò)增的CD8+Treg-TR細(xì)胞(分別為R1和 R4)，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表型檢測(cè)。流式結(jié)果表明：CD8+CD25+雙陽性率為Rl = 99.4 土 0.3%，1?4 = 99.2±0.7%(圖2八），卩(《口3陽性率1?1 = 88.4±0.5%，1?4 = 90.4±1.5%(圖28)， 均無顯著性差異。另外，與R1相比，經(jīng)四輪擴(kuò)增后R4細(xì)胞表面分子⑶28、⑶62L、⑶103的表達(dá) 也均無顯著性差異，但⑶39、CD73、⑶152(CTLA-4)的表達(dá)量顯著升高（圖2C)，提示經(jīng)四輪刺 激后CD8+Treg-TR功能可能有所增強(qiáng)。
[0055] 同時(shí)，擴(kuò)增四輪后，通過Annexin V/PI染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CD8+Treg-TR活細(xì)胞為93.9 ±1.5%，細(xì)胞存活率高（圖2D)。
[0056] 3.體外誘導(dǎo)擴(kuò)增的CD8+Treg_TR分泌較少的炎性細(xì)胞因子
[0057] 我們將⑶8+Treg-TR和⑶8+T效應(yīng)細(xì)胞(對(duì)照組)經(jīng)佛波酯、離子霉素刺激后，對(duì)多種 細(xì)胞因子進(jìn)行熒光標(biāo)記并進(jìn)行流式檢測(cè)。流式結(jié)果顯示，與CD8+T效應(yīng)細(xì)胞相比，CD8+Treg- 丁1?分泌較少的11^-2、11^-4、正^丫；表達(dá)較高的11^-10。另外，〇)8+1^8-了1?和〇)8 +1'效應(yīng)細(xì)胞均 不分泌IL-17(表1)。
[0058] 表1 CD8+Tregs-TR胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)
[0059]
[0060] 注：CD8+Tregs-TR 與 CD8+T 效應(yīng)細(xì)胞比較，*ρ<0·01，#ρ<0·05，η = 3 [0061 ] 4.體外誘導(dǎo)擴(kuò)增的⑶8+Treg-TR具有較強(qiáng)的免疫抑制功能
[0062] 在CD4+T效應(yīng)細(xì)胞的增殖體系（anti-CD3/28、IL-2刺激）中加入不同比例的CD8+ Treg-TR。共培養(yǎng)4天后，流式檢測(cè)結(jié)果顯示:Q)8+Treg-TR在各個(gè)Treg:Tresp比例下，都能較 強(qiáng)的抑制CD4+T效應(yīng)細(xì)胞增殖；即使當(dāng)CD8+Treg-TR細(xì)胞數(shù)較少時(shí)(Treg:Tresp比例=1:64)， 仍能發(fā)揮有效的抑制作用（圖3)。
[0063]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種調(diào)節(jié)性⑶8+T細(xì)胞體外擴(kuò)增的方法，其特征在于，所述的方法為⑶8+T細(xì)胞在TGF-β和RAPA的聯(lián)合誘導(dǎo)下擴(kuò)增。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法為CD8+T細(xì)胞多克隆體外擴(kuò)增體 系中添加 TGF-β和RAPA誘導(dǎo)擴(kuò)增。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的CD8+T細(xì)胞多克隆體外擴(kuò)增體系中包 含IL-2。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的CD8+T細(xì)胞多克隆體外擴(kuò)增體系采用 包被anti-⑶3/⑶28抗體的磁珠和IL-2擴(kuò)增。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的TGF-β為TGF-βΙ。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CD8+T細(xì)胞的來源包括人外周血單個(gè) 核細(xì)胞、臍血單個(gè)核細(xì)胞、經(jīng)動(dòng)員后的外周血單個(gè)核細(xì)胞、骨髓細(xì)胞。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法采用人外周血單個(gè)核細(xì)胞中新 鮮分離的⑶8+T細(xì)胞在Anti-⑶3/⑶28包被的磁珠刺激下，同時(shí)添加 IL-2，在TGF-βΙ、RAPA聯(lián) 合誘導(dǎo)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。8. -種具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞，其特征在于，所述的具有免疫抑制功能 的調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞為TGF-β和RAPA聯(lián)合誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性CD8+T細(xì)胞在制備治療自身免疫性 疾病的藥物中的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的自身免疫性疾病包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、I型糖尿病、自身免疫性腎炎。
【文檔編號(hào)】A61P19/04GK105838674SQ201610369644
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月30日
【發(fā)明人】楊潔, 范華驊, 孫娟, 楊懿銘, 謝如鋒, 蔣雪玉, 劉李棟
【申請(qǐng)人】上海市血液中心