中國明對蝦抗脂多糖因子及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程，尤其是涉及一種中國明對蝦抗脂多糖因子及其制備和應(yīng)用。中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF基因為(a)由SEQ?ID?NO.1中氨基酸序列所示的蛋白質(zhì)，或者(b)在（a）限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抗脂多糖因子活性的由（a）衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明選取畢赤酵母作為真核表達(dá)系統(tǒng)，對中國明對蝦抗脂多糖因子（FcALF）進(jìn)行重組表達(dá)。同時分析了其抗菌活性，為抗菌藥物與免疫增強劑篩選提供了指導(dǎo)。具體的說本發(fā)明中國明對蝦抗脂多糖因子重組蛋白對革蘭氏陰性菌大腸桿菌具有明顯抑制生長作用和殺菌作用。
【專利說明】中國明對蝦抗脂多糖因子及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程，尤其是涉及一種中國明對蝦抗脂多糖因子及其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002]進(jìn)入21世紀(jì)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)向多品種、高投入、高密度、集約式、工廠化的方向快速發(fā)展，但頻繁暴發(fā)的傳染性病害時刻威脅著該產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)性發(fā)展。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖生物病害防治主要方法有藥物防治、免疫防治和生態(tài)防治等，并逐步向高效、低毒、無殘留和無公害的方向發(fā)展。而化學(xué)藥物仍是目前水產(chǎn)動物病害防治最直接和最有效的一種手段。我國漁藥產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)薄弱、水產(chǎn)養(yǎng)殖生物病害防治技術(shù)滯后與養(yǎng)殖戶用藥知識匱乏等因素，導(dǎo)致大部分養(yǎng)殖戶使用價格低廉、殘留嚴(yán)重的農(nóng)藥及化工原料，造成了水體的嚴(yán)重污染。此外，抗生素、激素類等藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用，雖然對病害控制起到一定作用，但在很大程度上破壞了水環(huán)境及動物體內(nèi)的微生態(tài)平衡，使水產(chǎn)動物失去了正常的菌群屏障及生物拮抗作用，進(jìn)而導(dǎo)致外源性效應(yīng)菌和內(nèi)源性致病菌大量增殖，由此造成了潛在的更大病害。濫用藥物將導(dǎo)致致病菌株產(chǎn)生耐藥性，變異出致病性更強、危害性更大、流行性更廣的致病微生物，長期使用化學(xué)藥品勢必導(dǎo)致病原生物抗藥性的增加。隨著科技的發(fā)展和人類經(jīng)濟(jì)文化水平的提高，人們對食品安全和環(huán)境安全提出了更高的要求，化學(xué)藥物正逐漸被生物制品所替代。
[0003]作為一種無脊椎動物，中國明對蝦依靠其僅有的先天免疫系統(tǒng)實現(xiàn)對外界病原微生物的免疫。中國明對蝦在海水這一復(fù)雜微生物環(huán)境中的正常生長、繁殖,說明其免疫系統(tǒng)能夠有效抵御外界病原微生物的侵襲。抗脂多糖因子(ant1-lipopolysaccharide factor,ALF)是一種脂多糖結(jié)合蛋白，是鱟、蟹蝦類等甲殼動物體內(nèi)中廣泛存在的一類抗菌肽，通過結(jié)合脂多糖，調(diào)節(jié)細(xì)胞的脫顆粒作用，引起一系列級聯(lián)反應(yīng)，從而在甲殼動物的體液免疫中發(fā)揮著重要作用。在前期研究中， 申請人:所在項目組從中國明對蝦血細(xì)胞中克隆到ALF全長cDNA序列(FcALF)，研究發(fā)現(xiàn)在鰻弧菌等病原刺激下，F(xiàn)cALF在mRNA水平上的表達(dá)發(fā)生劇烈變化，提示FcALF在對蝦應(yīng)對外界病原感染過程中，發(fā)揮著重要作用(Liu，F(xiàn)S,等，Marine Biotechnology,2005, 7 (6):600-608)0

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種中國明對蝦抗脂多糖因子及其制備和應(yīng)用。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF，中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF基因為
[0007](a)由SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示的蛋白質(zhì)，或者
[0008](b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抗脂多糖因子活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0009]中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF重組蛋白的制備方法:[0010](a)構(gòu)建中國明對蝦抗脂多糖因子重組表達(dá)載體pPIC9k_FcALF ;
[0011](b)將步驟(a)所得重組表達(dá)載體經(jīng)線性化后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，結(jié)合抗生素G418和PCR的方法進(jìn)行陽性克隆的篩選，并對獲得的陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)產(chǎn)物；
[0012](c)分離純化步驟(b)所得的表達(dá)產(chǎn)物，即獲得重組的SEQ ID N0.1序列所示氨基酸的蛋白(即rFcALF)或SEQ ID N0.1序列所示的氨基酸中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抗脂多糖因子活性的由SEQID N0.1中氨基酸序列所示的衍生的蛋白質(zhì)。
[0013]所述步驟(b)中宿主細(xì)胞為畢赤酵母。
[0014]中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF的應(yīng)用:所述中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF可用于制備廣譜抗菌類藥物。
[0015]所述中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF可用于制備革蘭氏陰性菌的抗菌類藥物。
[0016]所述中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF可用于制備免疫增強劑、保健品或飼料添加劑。
[0017]本發(fā)明所具有的優(yōu)點:本發(fā)明選取畢赤酵母作為真核表達(dá)系統(tǒng)，對中國明對蝦抗脂多糖因子(FcALF)進(jìn)行重組表達(dá)。同時分析了其抗菌活性，為抗菌藥物與免疫增強劑篩選提供了指導(dǎo)。具體的說本發(fā)明中國明對蝦抗脂多糖因子重組蛋白對革蘭氏陰性菌大腸桿菌具有明顯抑制生長作用和殺菌作用。本發(fā)明重組蛋白對大腸桿菌具有很強的抑制生長作用，最小抑制濃度為3.12 μ g/mL。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1為Sal I限制性酶切重組表達(dá)載體pPIC9k_FcALF與pPIC9k的實驗結(jié)果。其中，M 為 DNA Marker ；1 為 pPIC9k_FcALF 經(jīng) Sal I 酶切結(jié)果；2 為質(zhì)粒 pPIC9k_FcALF ；3 為pPIC9k經(jīng)Sal I酶切結(jié)果；4為質(zhì)粒pPIC9k。
[0019]圖2為本發(fā)明實施例提供的誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白rFcALF陽離子交換層析色譜圖。其中，圖中曲線I表示蛋白純化過程中280nm下的紫外檢測結(jié)果；圖中曲線2表示蛋白純化過程中電導(dǎo)率的變化規(guī)律；圖中曲線3表示梯度洗脫過程中NaCl的濃度變化趨勢。圖中曲線I明顯的吸收峰即為通過NaCl洗脫得到的rFcALF。
[0020]圖3為本發(fā)明實施例提供的重組表達(dá)rFcALF分離純化樣品的16.5%的Tricine-SDS-PAGE分析結(jié)果圖，其中M:蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1:陽離子交換上樣前產(chǎn)物；2:NaCl洗脫峰上升階段收集液；3 =NaCl洗脫峰的收集液。
[0021]圖4為重組蛋白rFcALF質(zhì)譜鑒定結(jié)果圖。
[0022]圖5為本發(fā)明實施例提供的6個多拷貝克隆進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)酵上清液的SDS-PAGE分析結(jié)果圖，其中M:蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1_6為6個多拷貝克隆。
[0023]圖6為陽離子交換層析后的蛋白脫鹽結(jié)果。
[0024]圖7為用牛津杯法對重組蛋白rFcALF進(jìn)行抗菌活性檢測結(jié)果。G(_)為E.coli,其 FcALF 檢測濃度為 lmg/L ;G(+)為 Staphylococcus aureus,其 rFcALF 檢測濃度 50mg/L ；C:20mM pH7.2的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液作為對照組。
[0025]圖8為不同濃度rFcALF對大腸桿菌生長的影響。其中20mM pH7.2的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液作為對照組?！揪唧w實施方式】
[0026]下面的實施例中將對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0027]本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括以下步驟:
[0028]I)構(gòu)建中國明對蝦抗脂多糖因子重組表達(dá)載體；
[0029]2)將步驟I)所得重組表達(dá)載體經(jīng)Sal I線性化后，導(dǎo)入酵母宿主細(xì)胞，經(jīng)陽性克隆篩選后，將宿主細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)產(chǎn)物；
[0030]3)分離純化步驟2)所得到的重組蛋白，即中國明對蝦抗脂多糖因子。
[0031]在步驟I)中，所述表達(dá)載體可選用pPIC9k、pPIC9、pPIC3.5K等。
[0032]在步驟2)中，所述宿主細(xì)胞可選用畢赤酵母KM71、GS115等。
[0033]在步驟3)中，所述分離純化方法可為離子交換層析。
[0034]實施例1:
[0035]中國明對蝦抗脂多糖因子成熟肽FcALF，如SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示，
[0036]QGffEAVAAAVAVKIVGLWRNEKTELLGHECKFTVKPYIKRFQLYYKGRMWCPGWTAIRGEAKTRSRSGVAGRTAKDFVRKAFQQGLISQQQANQffLNS
[0037]該基因的核苷酸序列如SEQ N0.2所示，其5'端和3'端分別具有起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)。
[0038]ATGCGAGTTTCCGTGTTGGCAAGCCTGGTGCTGGTGGTGTCCCTGGTGGCACTCTTCGCCCCGCAGTGCCAGGCTCAAGGGTGGGAGGCTGTGGCAGCGGCCGTCGCCGTCAAGATTGTTGGGCTGTGGAGGAACGAGAAAACCGAACTCCTCGGCCACGAGTGCAAGTTCACCGTCAAGCCTTACATTAAGAGGTTCCAGTTGTACTACAAGGGGAGGATGTGGTGCCCAGGCTGGACGGCCATCAGAGGAGAAGCCAAAACACGCAGTCGGTCCGGGGTGGCTGGAAGGACAGCCAAAGACTTCGTCCGGAAAGCTTTCCAGCAAGGTCTCATCTCTCAACAGCAGGCTAACCAGTGGCTTAACTCATAG
[0039](a)序列特征:
[0040]?長度:372bp，其中有效長度76_369bp
[0041]?類型:堿基序列
[0042]?鏈型:單鏈
[0043]?拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性
[0044](b)分子類型:雙鏈DNA
[0045](C)假設(shè):否
[0046](d)反義:否
[0047]( e )最初來源:中國明對蝦
[0048](f)特異性名稱:gene
[0049]實施例2
[0050]I)中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0051]依據(jù)中國明對蝦ALF的cDNA序列(NCBI序列注冊號:AY859500)編碼成熟肽的序列信息和分泌型表達(dá)載體pPIC9k的多克隆位點特征，設(shè)計引物，上游引物PR1-Al含EcoR I酶切位點；下游引物PR1-A2含Not I酶切位點。
[0052]PR1-Al:
[0053]GCGAATTCCAAGGGTGGGAGGCTGTGGCA (下劃線為 EcoR I 酶切位點)
[0054]PR1-A2:[0055]TAG+GGCCGCCTATGAGTTAAGCCACTGG (下劃線為 Not I 酶切位點)
[0056]PCR反應(yīng)體系為20ul，如下:
[0057]Ex Taq buffer2 μ I
[0058]dNTPs (IOmM)0.4 μ I
[0059]PR1-Al (10 μ Μ)0.4 μ I
[0060]PR1-A2(10yM)0.4 μ I
[0061]Ex Taq0.2 μ I
[0062]中國明對蝦血細(xì)胞cDNA I μ I
[0063]ddH2015.6μ I
[0064]PCR 擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共30個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0065]將PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠純化試劑盒回收，回收的PCR產(chǎn)物連接PMD19-T載體(按照使用說明書進(jìn)行)，16°C連接60min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體平板，37°C培養(yǎng)過夜，以M13-F/M13-R為引物對，利用PCR方法對LB平板上的單克隆進(jìn)行檢測，將PCR檢測陽性克隆搖菌后進(jìn)行DNA測序，由此篩選到重組質(zhì)粒pMD19-FcALF (參見圖1)。
[0066]然后從測定結(jié)果為陽性的克隆中抽提質(zhì)粒pMD19_FcALF，并用EcoR I和Not I雙酶切，回收的目的片段，與用EcoR I和Not I雙酶切的pPIC9k片段，利用T4DNA連接酶在16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大`腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體平板，37°C培養(yǎng)過夜，以5' AOXl/^ AOXl為引物對，利用PCR方法對LB平板上的單克隆進(jìn)行檢測，將PCR檢測陽性克隆搖菌后進(jìn)行DNA測序，從而構(gòu)建酵母重組表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9k-FcALF。
[0067]2)重組質(zhì)粒pPIC9k_FcALF轉(zhuǎn)化至畢赤酵母KM71
[0068]用Sal I將重組載體pPIC9k_FcALF酶切,進(jìn)行質(zhì)粒線性化處理，回收線性化質(zhì)粒，利用PEG1000的方法將其轉(zhuǎn)化至畢赤酵母KM71感受態(tài)中，用菌落PCR的方法篩選陽性克隆，并利用抗生素G418濃度梯度篩選高拷貝的陽性克隆，具體方法參考Invitrogen公司的說明書進(jìn)行(Mult1-Copy Pichia Expression Kit, Version F),進(jìn)而挑選6個多拷貝的克隆進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)實驗，將誘導(dǎo)表達(dá)4天后的樣品,各取ImL離心(8000r/min, IOmin),各取IOOuL然后加20uL6 X SDS上樣緩沖液后進(jìn)行15%SDS_PAGE檢驗FcALF重組蛋白的表達(dá)情況，由圖5可以看出，所選的6個克隆中2-4號克隆的表達(dá)量相對比較高,而3號表達(dá)量在同樣條件下相對最高，選擇將其用來進(jìn)行放大實驗，同時該重組菌株命名為FcALF-60。
[0069]3)陽離子交換層析純化目的蛋白重組FcALF
[0070](I)將上述篩選到的表達(dá)量最高的工程菌株(FcALF-60)進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)后，4°C, 10000r/min 離心 15min,取上清液。
[0071](2)利用5M NaOH溶液將獲得的上清液調(diào)節(jié)至ρΗ7.0。
[0072](3)利用50mM的ρΗ7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液平衡陽離子柱(HITRAP Q FF, 5mL) 5 個柱體積。
[0073](4)將上述獲得的上清液上柱。
[0074](5 )利用50mM的pH7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液平衡5個柱體積。[0075](6)利用NaCl溶液(NaCl濃度為0-1.0M)進(jìn)行梯度洗脫，收集在400mMNaCl洗脫的組分，即為純化后的蛋白重組FcALF (即rFcALF)(參見圖2)，其中蛋白洗脫的檢測采用280nM下的紫外檢測器進(jìn)行。
[0076]將上述收集洗脫峰，經(jīng)16.5%的Tricine-SDS-PAGE電泳分析(參見圖3)，由圖3可知，重組蛋白的分子量在11.5kD左右，將圖3所示分離純化的蛋白斑點切下，利用LC-ES1-MS/MS進(jìn)行蛋白鑒定，鑒定方法參考文獻(xiàn)(Zhang Jiquan等，Journal ofBiotechnology, 2006，125(2): 173-184)。利用 Bioworks 軟件與 SEQUEST 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)I個肽段(TAEDFVR)與重組的中國明對蝦ALF蛋白完全匹配(表1和圖4)。
[0077]表1質(zhì)譜鑒定肽段信息
[0078]
【權(quán)利要求】
1.一種中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF，其特征在于:中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF為 (a)由SEQID N0.1中氨基酸序列所示的蛋白質(zhì)，或者 (b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抗脂多糖因子活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.—種權(quán)利要求1所述的中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF的制備方法，其特征在于: (a)構(gòu)建中國明對蝦抗脂多糖因子重組表達(dá)載體pPIC9k-FcALF； (b)將步驟(a)所得重組表達(dá)載體經(jīng)線性化后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，結(jié)合抗生素G418和PCR的方法進(jìn)行陽性克隆的篩選，并對獲得的陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)產(chǎn)物； (c)分離純化步驟(b)所得的表達(dá)產(chǎn)物，即獲得重組的SEQID N0.1序列所示氨基酸的蛋白(即rFcALF)或SEQ ID N0.1序列所示的氨基酸中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有抗脂多糖因子活性的由SEQID N0.1中氨基酸序列所示的衍生的蛋白質(zhì)。
3.按權(quán)利要求2所述的中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF的制備方法，其特征在于:所述步驟(b)中宿主細(xì)胞為畢赤酵母。
4.一種權(quán)利要求1所述的中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF的應(yīng)用，其特征在于:所述中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF可用于制備廣譜抗菌類藥物。
5.按權(quán)利要求4所述的中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF的應(yīng)用，其特征在于:所述中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF可用于制備革蘭氏陰性菌的抗菌類藥物。
6.一種權(quán)利要求1所述的中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF的應(yīng)用，其特征在于:所述中國明對蝦抗脂多糖因子FcALF可用于制備免疫增強劑、保健品或飼料添加劑。
【文檔編號】A61K38/17GK103724412SQ201310456658
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月29日
【發(fā)明者】張繼泉, 桂天書, 王婧, 相建海 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所