專利名稱：Peg化因子vii糖型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含因子VII綴合物的組合物，所述綴合物具有預(yù)定的 糖基化樣式。
背景技術(shù)：
因子VII是作為分子量大約50 kDa的單鏈糖蛋白在肝中合成并分泌 到血液中的維生素K依賴性血漿蛋白。FVII酶原通過蛋白水解切割轉(zhuǎn)變 成激活形式(FVIIa)。與組織因子(TF)復(fù)合的FVIIa能夠?qū)⒁蜃覫X 和因子X二者轉(zhuǎn)變成它們的激活形式，繼而發(fā)生導(dǎo)致迅速凝血酶生成和 纖維蛋白形成的反應(yīng)。
參與凝血級聯(lián)反應(yīng)的蛋白質(zhì)，包括例如vn、因子vni、因子ix、
因子x、和蛋白c，被證明是治療多種病理學(xué)狀況的有用治療劑。因此，
對于制藥學(xué)上可接受的且展示均一和預(yù)定臨床功效的包含這些蛋白質(zhì) 的制劑的需求日益增長。
由于使用人血漿作為制藥學(xué)產(chǎn)品來源有許多缺點，因此優(yōu)選在重組 系統(tǒng)中生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)。然而，凝結(jié)蛋白需要進(jìn)行多種共翻譯修飾和翻
譯后修飾，包括例如天冬酰胺連接(N連接)糖基化、O連接糖基化、和 谷氨酸殘基的"T羧化。在使用異源細(xì)胞作為宿主用于大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)
時，這些修飾在質(zhì)量上或數(shù)量上是不同的。具體而言，異源細(xì)胞中的生 成常常導(dǎo)致不同排列的糖型，即具有不同的共價連接寡糖結(jié)構(gòu)的相同多 肽。
在不同的系統(tǒng)中，治療性蛋白質(zhì)寡糖結(jié)構(gòu)中的變異尤其與免疫原性 和體內(nèi)清除有關(guān)。
除了體內(nèi)清除以外，功能性體內(nèi)半衰期對于化合物在體內(nèi)具有"治 療性利用度"的時段而言同樣是重要的。rFVIIa的循環(huán)半衰期是大約2， 3個小時(《Summary Basis for Approval for NovoSeven 》反卩糸匕-焦NovoSeven②的簡要才艮據(jù)，F(xiàn)DA證明 號96-0597 )。
人重組FVIIa的商品化制劑以NovoSeven 出售。NovoSeven忠是市場 上能夠獲得的有效且可靠的治療出血發(fā)作的唯一rFVIIa。相對較高的施 用劑量和頻率是達(dá)到并維持期望的治療或預(yù)防效果所必需的。因而，難 以獲得適當(dāng)?shù)膭┝空{(diào)節(jié)，而且因需要頻繁的靜脈內(nèi)施用而限制了患者的 生活方式。
具有較長循環(huán)半衰期的分子將減少必需施用的次數(shù)。考慮到當(dāng)前 FVIIA產(chǎn)品與頻繁注射的聯(lián)系，顯然需要改進(jìn)的FVII分子。
改進(jìn)循環(huán)的一種方法是確保由體內(nèi)清除的速率得到降低。如上所 述，治療性蛋白質(zhì)寡糖結(jié)構(gòu)中的變異尤其與體內(nèi)清除有關(guān)。另外，將化 學(xué)模塊附著于多肽上也可能賦予多肽以降低的腎清除。
無活性形式的FVII已有報道。滅活形式能夠與野生型FVII或FVIIa 竟?fàn)幣c組織因子的結(jié)合并抑制凝結(jié)活性。滅活形式的FVIIa被建議用于 治療超凝結(jié)狀況的患者，諸如患有敗血癥、有心肌梗塞風(fēng)險、或有血栓 性中風(fēng)風(fēng)險的患者。
W0 98/32466建議可以將FVII以及許多其它蛋白質(zhì)進(jìn)行PEG化，但是
不含這個方面的任何其它信息。
W0 01/58935要求保護(hù)非多肽模塊(如PEG)與多肽的綴合物，所述 多肽的氨基酸序列因?qū)牖蛳酥辽僖粋€包含非肽模塊的附著基團 的氨基酸殘基而與野生型FVII不同。
US 4847325建i義可以通過使PEG衍生物與經(jīng)過氧化的集落刺激因子 -1 (CSF-1)反應(yīng)而將CSF-1附著于PEG上。
因此，本領(lǐng)域需要提供凝結(jié)蛋白制劑的組合物和方法，特別是包含
改進(jìn)的重組人因子vn、修飾的因子vn、或因子vn相關(guān)多肽的制劑。
發(fā)明概述
本發(fā)明的研究人員發(fā)現(xiàn)，具有包含至少一個寡糖基共價連接至至少性。因此，本發(fā)明涉及提供這些綴合蛋白制劑的方法和組合物。
因此，在第一個方面中，本發(fā)明涉及包含多種因子VII多肽或因子 VII相關(guān)多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺和/或絲氨酸連接的寡
糖鏈，而且其中至少一個寡糖基團共價附著了至少一個聚合基團。
在它的一個實施方案中，聚合基團共價附著于唾液酸模塊上。在它 的另一個實施方案中，聚合基團共價附著于半乳糖模塊上。
在它的一個實施方案中，大約94 - 100 %的寡糖鏈包含至少一個唾 液酸模塊。
在它的一個實施方案中，大約94 - 100%的寡糖鏈包含至少一個唾 液酸模塊，而且其中少于大約25%的寡糖鏈包含至少一個未加帽的觸角 (antenna )。
在一個實施方案中，少于大約10%的寡糖鏈包含至少一個未加帽的
少于大約5%、優(yōu)選少于大約2%的寡糖鏈包含 大約96 - 100 %的寡糖鏈包含至少一個唾液酸 大約98 - 100 %的寡糖鏈包含至少一個唾液酸
在一個實施方案中 至少一個未加帽的觸角 在一個實施方案中模塊。
在一個實施方案中模塊。
在一個實施方案中，天冬酰胺連接的寡糖鏈位于與野生型人FVIIa (圖l)中氨基酸殘基Asn-145和Asn-322對應(yīng)的位置。
在一個實施方案中，絲氨酸連接的寡糖鏈位于與野生型人FVIIa(圖 1)中氨基酸殘基Ser-52和Ser-60對應(yīng)的位置。
在一個實施方案中，聚合物選自聚環(huán)氧烷(PAO)，包括聚亞烷 基二醇(PAG)，諸如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)、分支PEG、 聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共-馬來酸酐、 聚苯乙烯-共-馬來酸酐、和葡聚糖，包括羧曱基葡聚糖、聚氨基曱酸酯、 聚酯、和聚酰胺。在一個實施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一個實施方案 中，聚乙二醇是分子量300 - 100， 000 Da的PEG，諸如大約500 - 20， 000 Da、或大約500 - 15， 000 Da、或2-15kDa、或3-15kDa、或3-12kDa、 或大約IO kDa。
在一個實施方案中，多肽具有野生型因子VII的氨基酸序列(圖l)。 在一個實施方案中，多肽是野生型因子VIIa。
在一個實施方案中，因子VII多肽選自SS2A-因子Vn、 S60A-因子 VII、第290位與第291位殘基之間受到蛋白水解切割的因子VH、第315 位與第316位殘基之間受到蛋白水解切割的因子VII 、發(fā)生氧化的因子 VII、 L305V-FVII、 L305V/M306D/D309S-FVI1、 L305I—FVII、 L305T-FVII、 F374P-FVII 、V158T/M298Q-FVII 、V158D/E296V/M298Q-FVII 、 K337A-FVI1、 M298Q-FVn、 V158D/M298Q-FVII 、 L305V/K337A-FVI1 、 V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII 、 V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII 、 V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVn、 K157A-FVI1、 E296V-FVI1、 E296V/M298Q-FVII 、V158D/E296V-FVII 、V158D/M298K—FVII 、 S336G-FVII、第290位和/笫2W位(優(yōu)選第"0位)的氨基酸殘基已被取
代的因子vn序列變體、以及第315位和/或第316位(優(yōu)選第3is位)的
氨基酸殘基已被取代的因子VII序列變體。在另一個實施方案中，因子 VII多肽選自WO 01/83725、 WO 02/22776、 WO 02/77218、 WO 03/27147、 和WO 03/37932中公開的與野生型FVIIa相比生物學(xué)活性升高的因子Vn
變體； L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII,
L305V/M298Q-FVII, L30SV/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337AAH58D-FVII, L305VA/158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVH, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E2S6V/M298Q-FVI1, L30SV/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FV1I, L305WV158T/K337A;M298Q-FVI1, L305V/V158T/E296V/K337A-R/II, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVIi, S314E/K337A-FVII, S314EA/158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314EA/158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K315H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316HA/158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316QA/158D-FVII, K316Q/E296V-FVH, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V7M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII,S3ME/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, .S314E/L305V/E296V/M298Q-FVI1, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVI1, S314E/L305V/V158T/E296WK337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S3ME/L305V/\nS8D/E296V/K337A-(=Vll, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, 5314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H兒305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305WK337A/M298Q-FVU, K316H/L305WK337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FV", K316H/L305VA/158D/M298Q-FVI1, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII,
K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVM, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296圃298Q-FVI1, K316H/L305WV158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVI1, K316H/L305V/V1S8D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305WV158D/E296V7M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVH, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V1S8D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVU, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVU,
K316Q/L305WV158T/M298Q-FVI1, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296WM298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296WM298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L30SV/V1S8D/K337A;M298Q管FVI1, K31SQ/L305V/V1S8D/E296V/K337A —FVIl, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVU, O16Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVU, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E國FVH, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305WV158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305WM298Q-FVI1, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FV", F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVH, F374Y/K337A/E2%V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVI1, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374YA/158T/M298Q-FVM, F374Y/V158T/E296V-FVII, B74Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L30SV/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVl1, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII,
F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVN, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296WV158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305VA/158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII,
F374Y/K337A/S314EA/158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FV/II, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII,F374Y/K337A/E296WV158D-FVH, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVll, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVI1, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII,
F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A —FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FX/II, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305VA/158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374丫/L305WV158D/E296V/M298Q-FVH, F374Y/L305VA/158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305VA/1S8D/E296V/K337A-FVH, F374Y/L30SVA/158D/M298Q/S314E-FVII, F374丫/L305VA/158D/E296V/S314E-FVI1, F374YA/158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V1S8T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V1S8T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V1S8T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L30SV/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305VA/158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296WM298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E29SV/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M29BQ/K337A/V158T/S3，4E-FVI1, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305VA/158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-R/ll, F374Y/L30SV/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, SS2A-Factor VII, S60A-Fartor VII; and P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290WA292T-FVII, G291N-FVII, R3，5WV317T-FV",K143WN145T/R315IW31丌-FVM;由2 3 3Thr至2 4 0 A SH的氨基酸序歹'J
中具有取4戈、添加、或缺失的FVII、由S(MArg至MSCys的氨基酸序列中 具有取代、添加、或缺失的FVII、以及由153Ile至223Arg的氨基酸序列 中具有取代、添加、或缺失的FVII。
在一個實施方案中，因子ni相關(guān)多肽選自R152E-FHI、 S344A-FVII、 FFR-FVII、和缺乏Gla結(jié)構(gòu)域的FVIIa。
在一個實施方案中，在本說明書所述凝結(jié)測定法、蛋白水解測定法、 或TF結(jié)合測定法中一種或多種方法中進(jìn)行測試時，因子VII相關(guān)多肽展示在相同細(xì)胞類型中生成的野生型因子VIIa的比活的至少大約25y。、優(yōu) 選至少大約50%、更優(yōu)選至少大約75%、且最優(yōu)選至少大約90%。
在一個實施方案中，在本說明書所述凝結(jié)測定法、蛋白水解測定法、 或TF結(jié)合測定法中一種或多種方法中進(jìn)行測試時，因子VII相關(guān)多肽展 示在相同細(xì)胞類型中生成的野生型因子VIIa的比活的大約25y。以下、優(yōu) 選大約10%以下、更優(yōu)選大約5%以下、且最優(yōu)選大約1%以下。
在不同的實施方案中，綴合多肽展示的生物利用度是參考制劑的生 物利用度的至少大約110% ，諸如參考制劑的生物利用度的至少大約 120%、至少大約130%、或至少大約140%。
在一個實施方案中，綴合多肽展示的血清半衰期是參考制劑的半衰 期的至少大約125%，諸如參考制劑的半衰期的至少大約150% 、至少大 約200 %、或至少大約250 %。
在一個實施方案中，綴合多肽是通過酶促修飾多肽中的唾液酸或半 乳糖模塊而生成的。
在另 一個方面中，本發(fā)明涉及用于制備權(quán)利要求1的制劑的方法， 所述方法包括在至少一個聚合分子共價附著于多肽上至少一個寡糖鏈 的條件下使含寡糖的多肽接觸聚合物分子。
在還有一個方面中，本發(fā)明涉及包含權(quán)利要求l - 22任一項中定義 的制劑和制藥學(xué)可接受載體或佐劑的藥物組合物。
在還有一個方面中，本發(fā)明涉及包含多種因子VII多肽或因子VII相 關(guān)多肽的制劑用于制備治療因子VII反應(yīng)綜合癥的藥物的用途，其中所 述多肽包含天冬酰胺和/或絲氨酸連接的寡糖鏈，而且其中至少一個寡 糖基團共價附著了至少一個聚合基團。
在還有一個方面中，本發(fā)明涉及用于治療因子vn反應(yīng)綜合癥的方
法，包括對需要這種治療的患者施用包含權(quán)利要求l - 22中描述的制 劑的制藥學(xué)配方，施用的條件是會導(dǎo)致出血減少和/或凝血增加。
在它的一個實施方案中，所述綜合癥選自血友病A、血友病B、因 子XI缺乏、因子VII缺乏、血小板減少、von Willebrand氏病、凝血因 子抑制劑的存在、手術(shù)、創(chuàng)傷、抗凝劑療法，包括稀釋凝血病、顱間出血(intercranial haemorrhage )、千細(xì)胞移植、上胃腸道出血、和肝 病。
在還有一個方面中，本發(fā)明涉及用于預(yù)防有害出血的方法，包括 對需要這種治療的患者施用包含權(quán)利要求l - 22中描述的制劑的制藥學(xué) 配方，施用的條件是會導(dǎo)致出血減少和/或凝血增加。
在還有一個方面中，本發(fā)明涉及用于預(yù)防有害凝血的方法，包括 對需要這種治療的患者施用包含權(quán)利要求l - 22中描述的制劑的制藥學(xué) 配方，施用的條件是會有效抑制凝血。
在它的一個實施方案中，有害凝血與選自下組的狀況有關(guān)血管成 形術(shù)、深靜脈血栓形成、肺檢塞、中風(fēng)、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)、 與革蘭氏陰性內(nèi)毒素血癥有關(guān)的肺和腎中的纖維蛋白沉積、以及心肌梗 塞。
在還有一個方面中，本發(fā)明涉及用于防止由組織因子介導(dǎo)的反應(yīng)的 方法，包括有效抑制凝結(jié)的條件下對需要這種治療的患者施用包含權(quán) 利要求l - 22中描述的制劑的制藥學(xué)配方。
在它的一個實施方案中，由組織因子介導(dǎo)的反應(yīng)與選自下組的狀況 有關(guān)炎癥、癌癥、腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、血管發(fā)生、SIRS、 ALI、 ARDS、 M0F、 HUS、和TTP。
發(fā)明描述
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，具有其中至少一個寡糖基團共價連接了至少 一個聚合基團(諸如例如PEG)的糖型樣式的凝結(jié)蛋白的制劑展示改進(jìn) 的功能特性。因此，本發(fā)明涉及提供這些綴合蛋白制劑的方法和組合物。
具體而言，本發(fā)明涉及包含因子vn多肽或因子vn相關(guān)多肽的制劑，其
中所述多肽具有天冬酰胺連接(N連接)和絲氨酸連接(0連接)的寡糖
共價附著了至少 一個聚合基團的樣式。本發(fā)明的制劑展示改變的特性， 包括但不限于改進(jìn)的藥代動力學(xué)特性和改進(jìn)的臨床功效。本發(fā)明還涵蓋 包舍這些制劑的制藥學(xué)配方，以及利用這些配方的治療性方法。在用于本文時，術(shù)語"共價附著"意欲涵蓋寡糖模塊與聚合模塊彼 此直接共價相連，或者彼此通過間插模塊(諸如橋接、間隔子或連接模 塊)而間接共價相連。
術(shù)語"綴合物"或可互換的"綴合多肽，，意指通過將一種或多種多 肽共價附著一種或多種聚合物分子而形成的異源(在合成或嵌合的意義 上)分子。
術(shù)語"聚合分子"或可互換的"聚合基團"或"聚合模塊"或"聚 合物分子"涵蓋能夠綴合至多肽的附著基團的分子。在用于本發(fā)明綴合 物的內(nèi)容時，將理解為通過糖蛋白寡糖鏈上的附著基團將聚合物分子
(或模塊)連接至綴合物的多肽部分上；優(yōu)選的是，將聚合物分子附著 于對寡糖加帽的唾液酸模塊("唾液酸加帽基團，，)或半乳糖模塊。
聚合物分子指通過共價連接兩個或多個單體而形成的分子，其中沒 有一個單體是氨基酸殘基。優(yōu)選的聚合物是選自下組的聚合物分子聚
環(huán)氧烷(PA0),包括聚亞烷基二醇(PAG)，諸如聚乙二醇(PEG)和 聚丙二醇(PPG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡 咯烷酮、聚乙烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐和葡聚糖，包括 羧甲基葡聚糖，特別優(yōu)選PEG。
術(shù)語"附著基團"意指寡糖模塊中能夠附著聚合物分子的官能團。 有用的附著基團是例如胺、羥基、羧基、醛、酮、巰基、琥珀酰亞胺基、 馬來酰亞胺、乙烯砜、或卣代醋酸酯。
可以在與聚合物反應(yīng)之前活化寡糖模塊上的附著基團?；蛘?，可以 在與寡糖模塊反應(yīng)之前活化聚合物上存在的基團。無論是存在于寡糖才莫 塊上或者是聚合物模塊上，激活基團可以是活化離去基團的形式。
術(shù)語"活化離去基團，，包括那些易于在有機或酶促調(diào)控的取代反應(yīng) 中被取代的模塊?；罨x去基團在本領(lǐng)域是知道的，參閱例如Vocadlo 等人，《Car6o力7"rate C/ e/z /"iT a/3tf 5/o/c^F》即碳水化合物化學(xué)和 生物學(xué)，第2巻，Wiley-VCH Verlag，德國，2000; Kodama等人， 7"efra力e^ro/7ZeffeT^， 34: 6419， 1993; Lougheed等人，/. A/o人C力e頂.， 274: 37717， 1999。文獻(xiàn)中描述了用于活化聚合物的方法和化學(xué)原理。常用于活化聚合 物的方法包括用溴化氰、高碘酸鹽、戊二醛、雙環(huán)氧化物、表氯醇、二 乙燁砜、碳二亞胺、磺酰卣化物、三氯三嗪等物質(zhì)來活化官能團(參閱
，J:i口Taylor， 1991， 《尸ro/e//3 //mn06/7izaf/oz , 尸〃/7^a范e/^a/s a/7f/ ^ ; 7/cs/7朋i"》即蛋白質(zhì)固定的原理和應(yīng)用，Marcel Dekker，紐約； Wong, 1992, 《^6e頂/s/r7 o/*p_ro,e//7 fewj.wgaa/7^ 6>05^/// 〖//7^〉〉 即蛋白質(zhì)綴合和交聯(lián)的化學(xué)，CRC出版社，伯克萊屯；Hermanson等人， 199 3，《J/B邁o6iJ2'zed爿/Y7i3J'07丄J'ga/ d rec/ /^》wes》艮卩固定4b親和酉己 體技術(shù)，Academic出版社，紐約；Dunn等人編，《尸o7戸er/c "r， a/jrf Z rz/g/ ehVeiy5y^e/^》即聚合藥物和藥物投遞系統(tǒng)，ACS系列討論會， 第469巻，美國化學(xué)學(xué)會，1991 )。
的條件下進(jìn)行的類型，包括但不限于親核取代(如胺和醇與酰基卣、活 潑酯的反應(yīng))、親電子取代(如烯胺反應(yīng))、和向碳-碳和碳-雜原子 鍵中力口成(如Michael反應(yīng)、Diel s-Alder加成)。這些和其它有用的反 應(yīng)描述于例如March， 《/4c^a/7ced Or^/n'c C/ e紹'"r/》即高級有才幾化 學(xué)，第3版，John Wiley & Sons,紐約，1985; Her隠son，《腸,/柳" recA/2/《wes》民卩生物纟炎合^支術(shù)，Academic出版;f土，圣迭戈，1996; Feeney 等人，《#od//7ca"oiLs of戶rofei"s》蛋白質(zhì)修飾，化學(xué)進(jìn)展叢書， 第198巻，美國化學(xué)學(xué)會，1982。
可以選擇反應(yīng)性官能團，使得它們不參與或干擾裝配寡糖和聚合物 模塊所必需的反應(yīng)?；蛘?，可以通過保護(hù)性基團的存在來保護(hù)反應(yīng)性官 能團免于參與反應(yīng)。有用的保護(hù)性基團的范例參閱例如Greene等人， 《尸,o""i"Ve ^to〃/7S //7 Oi^a/ /c iy/7f力ei"/s》即有才凡合成中的保護(hù)性 基團，John Wiley & Sons,紐約，1991。
文獻(xiàn)中描述了用于將碳水化合物連接至其它分子的一般方法(參閱 侈寸J(口Lee等人，J2'0c/ e歷j:fr/， 28: 1856, 1989; Bhatia等人，1na/. S/oc/ e/z , , 178: 408， 1989; Janda等人，/. J/z . C力e邁.5"oc. , 112: 8886, 1990;和Bednarski等人，W0 92/18135 )。術(shù)語"天然存在的糖基化位點"意指位于位置Asn-145 (N145)、 Asn-322 (N322 ) 、 Ser-52 ( S52 )、和Ser-60 (S60)的糖基化位點。 相似的，術(shù)語"天然存在的體內(nèi)O-糖基化位點"包括位置S52和S60,而 術(shù)語"天然存在的體內(nèi)N-糖基化位點"包括位置N145和N322。
術(shù)語"功能性體內(nèi)半衰期"使用其常規(guī)含義，即身體/靶器官中仍 然存在多肽或綴合物50%的生物學(xué)活性時的時間，或者多肽或綴合物的 活性為其初始值的50 %時的時間。作為測定功能性體內(nèi)半衰期的變通方 法，可以測定"血清半衰期，，，即50%的多肽或綴合物分子在清除之前 在血漿或血流中循環(huán)時的時間。血清半衰期的測定常常比功能性半衰期 的測定更加簡單，而且血清半衰期的量級常常較好的指示了功能性體內(nèi) 半衰期的量級。血清半衰期的其它術(shù)語包括血漿半衰期、循環(huán)半衰期、 血清清除、血漿清除、和清除半衰期。多肽或綴合物是通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系 統(tǒng)(RES)、腎、脾、或肝中的一種或多種的作用，通過由組織因子、 SEC受體、或其它受體介導(dǎo)的消除，或者通過特異性或非特異性蛋白水 解而清除的。通常，清除取決于蛋白質(zhì)的大小(相對于腎小球濾過作用 的臨界值)、電荷、附著的碳水化合物鏈、和細(xì)胞受體的存在。需要保 持的功能性常常選自促進(jìn)凝血、蛋白水解、輔因子結(jié)合、或受體結(jié)合的 活性?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域知道的任何合適方法來測定功能性體內(nèi)半衰期和 血清半衰期，下文將進(jìn)一步描述(參閱"因子VII制劑的功能特性"部 分)。
術(shù)語"增加，，在用于功能性體內(nèi)半衰期或血漿半衰期時用于指在可 比條件下測定的多肽或綴合物的相關(guān)半衰期相對于參考分子諸如未綴 合的因子VIIa (如野生型FVIIa)在統(tǒng)計學(xué)上顯著增加。例如，相關(guān)半 衰期可以增加至少大約25%，諸如至少大約50%,例如至少大約100%、 150%、 200 %、 250%、或500 %。
制劑的"免疫原性"指制劑在施用于人后引發(fā)有害免疫應(yīng)答的能力， 無論是體液應(yīng)答、細(xì)胞應(yīng)答、或二者。已知因子VIIa多肽和因子VIIa相 關(guān)多肽不會在人體中引發(fā)可檢測的免疫應(yīng)答。但是，在任何人類亞群中， 可能存在對特定施用蛋白質(zhì)展示敏感性的個體?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域知T細(xì)胞定量來測量免疫原性。在有些實施方案中，本發(fā)明制劑展示在敏
少大約10%、優(yōu)選至少大約25%、更優(yōu)選至少大約40%、且最優(yōu)選至少 大約50%。
術(shù)語"與圖l (野生型FVn)的氨基酸殘基S52、 S60、 N145、 N322 對應(yīng)的氨基酸殘基，，意指將序列比對時與野生型因子VII的序列(圖l) 對應(yīng)的氨基酸殘基Asn和Ser。可以使用適于序列比對的電腦程序方便的 測定比對序列的氨基酸序列同源性/同一性，諸如例如ClustalW程序l. 8 版1999年(Thompson等人，1994，腸/e/dc/""e歸A, 22: 4673 —4680 )。
因子VII多肽和因子VII相關(guān)多肽
本發(fā)明涵蓋人因子VII多肽，諸如例如那些具有美國專利號 4， 784， 950中公開的氨基酸序列(野生型因子Vn)的多肽。在用于本文
時，"因子vn"或"因子vii多肽"涵蓋野生型因子vn，以及與野生
語"因子vn"意欲涵蓋處于其未切割(酶原)形式的因子vn多肽，以 及那些經(jīng)過蛋白水解加工而生成其各自的生物活性形式的多肽(可以稱
為因子VIIa)。通常，因子VII在第1^位與第1S3位殘基之間受到切刮 而生成因子VIIa。
在用于本文時，"因子VII相關(guān)多肽"涵蓋與野生型因子VIIa的活 性相比因子VIIa生物學(xué)活性實質(zhì)上得到修飾或降低的多肽，包括變體。 這些多肽包括但不限于經(jīng)過化學(xué)修飾的因子VII或因子VIIa,以及導(dǎo)入
了特定氨基酸序列改變而修飾或破壞多肽生物活性的因子vn變體。
因子VIIa在血液凝結(jié)方面的生物學(xué)活性衍生自它的下列能力(1) 結(jié)合組織因子(TF)和(2)催化因子IX或因子X的蛋白水解切割而生成激 活的因子IX或X (分別為因子IXa或Xa)。出于本發(fā)明的目的，例如美國 專利號5， 997， 864中所述，4吏用缺乏因子VII的血漿和促凝血酶原激酶來測量制劑促進(jìn)血液凝結(jié)的能力，由此可以對因子VIIa生物學(xué)活性定量。 在這種測定法中，生物學(xué)活性表述成凝結(jié)時間相對于對照樣品的減少， 并可通過與含l個單位/ml因子VII活性的合并人血清標(biāo)準(zhǔn)相比較而轉(zhuǎn)變 成"因子VII單位"?；蛘撸梢酝ㄟ^(l)測量因子VIIa在包含包埋在脂 膜中的TF和因子X的系統(tǒng)中生成因子Xa的能力(Persson等人，/. S/oA C力e瓜，272: 19919 - 19924, 1997 ); (2)測量水性系統(tǒng)中因子X的水解 (見下文實施例5) ; (3)使用基于表面激元共振(surface plasmon resonance)的4義器測量它與TF的物理結(jié)合(Persson，尸fAy丄ef".， 413: 359 - 363, 1997 ); (4)測量合成底物的水解(見下文實施例4 ); 和(5)測量不依賴TF的體外系統(tǒng)中的凝血酶的生成，從而對因子VIIa生 物學(xué)活性定量。
與野生型因子VIIa相比具有實質(zhì)上相同或改進(jìn)的生物學(xué)活性的因 子VII變體涵蓋那些在上文所述凝結(jié)測定法、蛋白水解測定法、或TF結(jié) 合測定法中的一種或多種方法中進(jìn)行測試時展示在相同細(xì)胞類型中生 成的野生型因子VIIa的比活的至少大約25。/。、優(yōu)選至少大約50%、更優(yōu) 選至少大約75%、且最優(yōu)選至少大約90%的變體。與野生型因子VIIa相
測定法、蛋白水解測定法、或TF結(jié)合測定法中的一種或多種方法中進(jìn)行 測試時，展示在相同細(xì)胞類型中生成的野生型因子VIIa的比活的不到大 約25%、優(yōu)選不到大約10%、更優(yōu)選不到大約5%、且最優(yōu)選不到大約l %的變體。與野生型因子VII相比具有實質(zhì)上修飾的生物學(xué)活性的因子 VII變體包括但不限于展示不依賴TF的因子X蛋白水解活性的因子VII變 體和那些可結(jié)合TF但不切割因子X的變體。
或者是與野生型因子VII相比展示實質(zhì)上得到修飾或降低的生物活性， 因子VII變體包括但不限于因一個或多個氨基酸的插入、缺失、或取代 而具有與野生型因子VI I序列不同的氨基酸序列的多肽。
VII相關(guān)多肽的非限制性范例包括:S52A-FVI1、 S60A-FVII ( I ino等人,爿rc力.^j'oc力e瓜 ^io; 力;^. , 352: 182 - 192, 1998); L305V—FVI1、 L305V/M306D/D309S-FVI1、 L305I-FVI1、 L305T-FVI1、 F374P-FVII、 V158T/M298Q-FVII 、V158D/E296V/M298Q-Fni 、K337A-FVII 、 M298Q-FVII、 V158D/M298Q-FVII、 L305V/K337A-FVII 、 V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII 、 V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII 、 V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、 K157A-FVII、 E296V—FVII 、 E296V/M298Q-FVII 、 V158D/E296V-FVII 、 V158D/M298K-FVII 、 和 S336G-FVII;美國專利號5， 580， 560中公開的展示蛋白水解穩(wěn)定性增加 的FVIIa變體；在第290位與第"1位殘基之間或第315位與第316位殘基 之間受到蛋白水解切割的因子VIIa (Mollerup等人，Wo^c/wo/. "/oe/ g., 48: 501 - 505， 1995 );因子VIIa的氧化形式(Kornfelt等 人，JrcA. 5/oc力e瓜5j'o/j/ j^. , 363: 43-54， 1999 )、(圖l的)第 "0位和/第291位(優(yōu)選第"0位)的氨基酸殘基得到取代的因子VII序 列變體、以及(圖l的)第315位和/或第316位(優(yōu)選第315位)的氨基 酸殘基得到取代的因子VII序列變體。
VII相關(guān)多肽的非限制性范例還包括WO 01/83725 、 W0 02/22776 、 W0 02/77218、 WO 03/27147、和W0 03/37932中公開的與野生型FVIIa相比 生物學(xué)活性增加的FVII變體，包括但不限于L305V-
FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305卜FVI1, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V1S8D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-R/M, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V1S8D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305VA/158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVI1, L305WV158T-FVII, L305V/K337AA/158T-FVII, L305V/K337/VM298Q-FV", L305WK337AyE296V-FVI1, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M29BQ-FVII, L305V/V158T/E296V-FVI1, L305V/E296WM298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V7M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVH, L305V/V158T/E296WK337A. FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A—
L305V/V1S8D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, 5314E/K337A-FVII, S314EAM58D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FV1I,K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FV", S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E2訴V-FVI1, S314E/L305V/K337A/V158D-FVM, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVM, S314E/L305V/V1S8D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E2訴V-FVI1, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V1S8T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVH, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVU, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L30SV/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, IG16H/L305V/V158T-FVII, K31 6h/L305V/K337A/V1 58T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII,
K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305VA/158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L30SV/V158T/K337A/M298Q-FVa, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, O16Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305WV^8D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V1S8T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305WV158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L30SV/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305WV158D/E296V/K337A -FVII, K316Q/L305V/V158D/E2訴V/M298Q/K337A-FVI1, K316Q/L305VA/1S8T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FV", F374Y/V1S8D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII,
F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FV", F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374YA/158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII,
F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII,F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVH, F374Y/K337A/M298Q/E2訴V-FVH, F374Y/K337A/M298QA/158D-FVH, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVH,
F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E2訴V-FV", F374Y/E296V/S314E/M298Q-
FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E295V/K337A/S314E-FVII,
F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVH, F374Y/L305V/E2訴V/M298Q/K337A -FVII,
F374Y/L305WE296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FV'I,
F374Y/V1S8D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII,
F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V1S8D/E296V/K337A/S314E-FVH,
F374Y/L30SV/V1.5aD/E-29eWM'29$Q-FVIl, F374Y/L305V/V1S8D/M298Q/K337A-FVII,
B74Y/L305VyVTSSD/E2訴V/K337A-Rm, F374Y/L305V/V1'58D/M298Q/S3T4E-FVI(,
F374Y/L305V/V158D/E296WS314E-FVII, F374Y/V158T/E296WM298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305VA/158T/K337A/S314E-FVII, B74YA/158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V巧8T7E296V/K337A/S314E-FVI1, F374Y/L305V/V158T/E296WM298Q-FVII, F374Y/L305WV158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVH, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVH, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305WE296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337/W158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E2訴V/M298Q/K337A-FVI1, F374Y/L305V/V1S8D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305WV1S8D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-Fartor VH, S60A-Fartor VH: and P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVH, V2S3N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII,
R31SN/V317T-FVII, K143國145T/R315N/V317T-FVII;由2 3 3Thr至2 4 0 A S n的氨基酸序歹'J中具
有取代、添加、或缺失的FVII、由:3(MArg至32冗ys的氨基酸序列中具有 取代、添加、或缺失的FVII、以及由lS3Ile至223Arg的氨基酸序列中具 有取代、添加、或缺失的FVII。因子VII相關(guān)多肽的非限制性范例包括R152E-FVIIa ( Wildgoose等人， 5/oc力e范，29: 3413 — 3420， 1990 ) 、 S344A-FVIIa( Kazama等人，/. "/o人 (7力e瓜，270: 66 — 72, 1995 ) 、 FFR—FVIIa (Holst等人，f"r. /, ^2f/oMSc. 5Vrg. ， 15: 515 - 520， 1998 )、缺乏Gla結(jié)構(gòu)域的因子VIIa (Nicolaisen等人，F(xiàn)孺丄e〃s. ， 317: 245 - 249， 1993 )、和其中Lys341 被A 1 a取代的因子VII?；瘜W(xué)修飾型因子VII多肽和序列變體的非限制性 范例描述于例如美國專利號5， 997， 864中。
糖基化
在用于本文時，糖基化"樣式"或糖型"樣式"、"分布"、或"i普"
指因子vn多肽或因子vn相關(guān)多肽的指定群體中具體寡糖結(jié)構(gòu)的表達(dá)
式。這些樣式的非限制性范例包括具有下述方式的寡糖鏈的相對比例 (1)具有至少一個唾液酸殘基；(2)缺乏任何唾液酸殘基(即電荷中性)； (3)具有至少一個末端半乳糖殘基；(4)具有至少一個末端N-乙酰半乳糖 胺殘基；(5)具有至少一個"未加帽"的觸角，即具有至少一個末端半 乳糖或N-乙酰半乳糖胺殘基；或(6)具有至少一個與觸角N-乙酰葡萄糖 胺殘基經(jīng)al-〉3連接的巖藻糖。
在用于本文時，"寡糖鏈"指與單個氨基酸殘基共價相連的整個寡 糖結(jié)構(gòu)。因子VII通常在Asn-145和Asn-322 ( N-連接糖基化)以及Ser-52 和Ser-60 ( 0-連接糖基化)處糖基化。在人體中原位生成的因子VII上 存在的N-連接寡糖鏈可以具有兩個、三個、或四個觸角，每個觸角都具 有Neu5Ac(a2-〉3或a2-〉6)Gal (pl-〉4)GlcNAc連接(pi-〉2、 4、或6)至 Man殘基的結(jié)構(gòu)，而后者連接(oil->3或6 ) 至 Man (|31-〉4) GlcNAc (pl-〉4) GlcNAc-Asn。 ( Neu5Ac表示N-乙酰神經(jīng)氨酸 (唾液酸)，Gal表示半乳糖，GlcNAc表示N-乙酰葡萄糖胺，而Man表示 甘露糖)。寡糖鏈中還可以包含巖藻糖殘基，它可以al》6連接至GlcNAc。
在人體中原位生成的因子VII上存在的O-連接寡糖鏈具有一個觸角，其中Ser-52觸角具有Xy1-Xyl-Glc-Ser或Glc-Ser的結(jié)構(gòu)，而Ser-60 觸角具有Neu5Ac(a2-〉3或a2-〉6)GaI(pl-〉4)GlcNAc-Fuc-Ser或 Fuc-Ser的結(jié)構(gòu)。(Fuc表示巖藻糖，Glc表示葡萄糖，而Xyl表示木糖)。
當(dāng)在人體中原位生成因子VII時，有些N-連接寡糖鏈缺乏核心巖藻 糖殘基；所有鏈缺乏觸角性巖藻糖殘基；而且兩種N-連接鏈幾乎完全被 唾液酸化，即每個觸角的末端糖是通過ot2-〉3或a2-〉6鍵連接至半乳糖的 N-乙酰神經(jīng)氨酸。
然而，當(dāng)在其它環(huán)境中生成時，因子VII可能包含在它們的一個或 多個觸角上具有不同末端結(jié)構(gòu)的寡糖鏈，諸如例如缺乏唾液酸殘基；包 含N-糖基神經(jīng)氨酸(Neu5Gc )殘基；包含末端N-乙酰半乳糖胺(GalNAc )
殘基代替了半乳糖；諸如此類。當(dāng)在例如存在小牛血清的條件下培養(yǎng)的 BHK細(xì)胞中生成時，因子VII制劑展示下列寡糖樣式87 - 93 %的寡糖鏈 包含至少一個唾液酸殘基；7 - 13%是中性的(缺乏任何唾液酸)；9-16%包含至少一個末端半乳糖殘基；19 - 29%包含至少一個末端N-乙酰 半乳糖胺殘基；且30 - 39 %包含至少一個未加帽的觸角，即包含至少一 個末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺殘基。 ， 當(dāng)在其它類型的細(xì)胞或在其它培養(yǎng)條件下(在無血清、化學(xué)成分完
全確定的培養(yǎng)基中)生成時，因子vn制劑可能展示下列寡糖樣式(如
WO 02/29025中所述):
(1) 大約94 - 100 %的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基，諸如例如大 約94 - 99 %、大約95 - 98 %、或大約96 - 97 %。在不同的實施方案中， 至少大約94%、 95%、 96%、或97%的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基；
(2) 6 %或更少的寡糖鏈?zhǔn)侵行缘?，諸如例如大約1. 5 - 6 %或大約2 -4 % ;
(3) 少于大約16 % 、優(yōu)選少于大約10 %的寡糖鏈包含至少 一個末端 半乳糖，諸如大約6-10%或大約8-9%;
(4) 少于大約25 % 、優(yōu)選少于大約10 %的寡糖鏈包含至少 一個末端 GalNAc殘基，諸如例如大約6 - 9%或大約7 - 8 °/0;
(5) 少于大約30 % 、優(yōu)選少于大約25 %的寡糖鏈包含至少 一個未加帽的觸角，諸如例如大約11-23%或大約12-18%;且
(6)至少大約2%、優(yōu)選至少大約5%、更優(yōu)選至少大約10%或20%、
且最優(yōu)選至少大約40。/。的寡糖鏈包含至少一個al-〉3連接至觸角N-乙酰
葡萄糖胺殘基(即以pi-〉2，4或6方式連接至Man殘基的N-乙酰葡萄糖胺
殘基)的巖藻糖。
另外，例如如美國專利號6， 399， 336中所述，可以通過用唾液酸轉(zhuǎn)
體外酶促處理來改進(jìn)唾液酸化程度(即附著于每個寡糖鏈上的唾液酸殘 基數(shù)目)。通過這種方法，寡糖鏈上基本上所有觸角可能都唾液酸化(即 由唾液酸殘基"加帽，，)。在有些情況中，F(xiàn)VII或FVII相關(guān)多肽上的N-葡聚糖也是不完全半乳糖化的，在唾液酸化步驟之前進(jìn)行包括半乳糖轉(zhuǎn) 移酶和UDP-半乳糖供體物質(zhì)的半乳糖化步驟將改進(jìn)產(chǎn)物的唾液酸含量。 本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)生產(chǎn)了因子VII制劑，其中包含含有至少一個共 價附著于至少一個寡糖基團上的聚合基團的寡糖樣式。在它的一個實施 方案中，制劑包含展示下列一種或多種糖型樣式的因子VII多肽或因子 VII相關(guān)多肽
(1) 大約94 - 100 %的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基，諸如例如大 約94 - 99 %、大約95 - 98 %、或大約96 - 97 %。在不同的實施方案中，-至少大約94%、 95%、 96%、 97%、 98%、或99 %的寡糖鏈包含至少一 個唾液酸殘基；
(2) 6 %或更少的寡糖鏈?zhǔn)侵行缘?，諸如例如大約0. 5 - 6 %或1. 5 - 6 %或大約2 - 4 %或O. 5 — 4 %或O. 5 - 2 % ;
(3) 少于大約16 % 、優(yōu)選少于大約10 %的寡糖鏈包含至少 一個末端 半乳糖，諸如例如大約6-10%或大約8-9%;
(4) 少于大約25 % 、優(yōu)選少于大約10 %的寡糖鏈包含至少 一個末端 Ga 1 NAc殘基，諸如例如大約6 - 9 %或大約7 - 8 % ;
(5) 少于大約30% 、優(yōu)選少于大約25%的寡糖鏈包含至少一個未加 帽的觸角，諸如例如大約11-23%或大約12-18%;且
(6) 至少大約2%、優(yōu)選至少大約5%、更優(yōu)選至少大約10%或20% 、且最優(yōu)選至少大約4(T/。的寡糖鏈包含至少一個經(jīng)al-〉3連接至觸角性N-乙酰葡萄糖胺殘基(即pi-"、 4、或6連接至Man殘基上的N-乙酰葡萄糖 胺殘基)的巖藻糖。
可以理解，(1) - (6)中的每一項可能代表本發(fā)明實施方案所涵蓋的 不同糖型樣式，即可以通過(l) - (6)中的一項來描述依照本發(fā)明的制劑 的糖型樣式，其中至少一個聚合基團共價附著于至少一個寡糖上?；蛘?， 可以通過(l) - (6)中的多項來描述本發(fā)明所涵蓋的制劑的糖型樣式。
另外，可以由(l) - (6)中的一項或多項并聯(lián)合一種或多種其它結(jié)構(gòu) 特征來描述本發(fā)明所涵蓋的制劑。例如，本發(fā)明涵蓋包含因子VII多肽 或因子Vn相關(guān)多肽的制劑，其中唾液酸殘基(Neu5Ac或Neu5Gc)專門 以a2-〉3構(gòu)型連接至半乳糖上。本發(fā)明還涵蓋包含因子VII多肽或因子 VII相關(guān)多肽的制劑，其中含有以al-〉6連接至核心N-乙酰葡萄糖胺上的 巖藻糖和/或以a1-〉3連接至觸角性N-乙酰葡萄糖胺上的巖藻糖。在一系
列實施方案中，本發(fā)明的制劑包含因子vn或因子vn相關(guān)多肽，其中超
過99 %的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基，且(a)所述唾液酸殘基專門 以a2-〉3的構(gòu)型連接，和/或(b)存在連接至核心N-乙酰葡萄糖胺上的巖 藻糖殘基，和/或(c)可檢測數(shù)目的觸角以N-乙酰半乳糖胺為末端。在一 個實施方案中，本發(fā)明涵蓋包含野生型因子VIIa的制劑，其中超過99% 的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基，而且唾液酸殘基專門以cc2->3的構(gòu) 型連接至半乳糖上。在另一個實施方案中，本發(fā)明涵蓋包含野生型因子 VIIa的制劑，其中超過99%的寡糖鏈包含至少一個唾液酸殘基，而且至 少一些寡糖鏈包含N-乙酰半乳糖胺。
可以使用本領(lǐng)域知道的任何方法來測定N-連接和/或0-連接寡糖的 樣式，包括但不限于高效液相層^" (HPLC);毛細(xì)管電泳(CE);核 磁共振(NMR);使用諸如快速原子轟擊、電噴射、或基質(zhì)輔助激光解 吸(MALDI)等離子化技術(shù)的質(zhì)鐠(MS);氣相層析(GC );以及聯(lián)合 陰離子交換(AIE) -HPLC、大小排阻層析(SEC)、質(zhì)譜法(MS)、凝 膠電泳(SDS-PAGE、 CE-PAGE)、等電聚焦凝膠、或等電聚焦毛細(xì)管電 泳(CE-IEF)的外切糖苦酶處理。參閱例如Weber等人，細(xì)A A'oc/ e瓜，225: 135， 1995; Klausen等人，/. ， 718: 195， 1995; Morris
等人，《船m 6^ec"o邁e"/ o尸A/.o/c^7ca7 yj/"er/a/51》即生物學(xué)材 料的質(zhì)傳，McEwen等人編，Marcei Dekker， 1990，第137 - 167頁；Conboy 等人，5/o/. Spectro瓜，21: 397， 1992; Hellerqvist, y)/ef力.
， 193: 554, 1990; Sutton等人，j/ a/. "/o力ce瓜，318: 34， 1994; Harvey等人，Or，/c yl/雄一"r歸"y, 29: 752， 1994。
使用任何上述方法(或分辨具有不同結(jié)構(gòu)的寡糖鏈的任何其它方 法)拆分因子VII衍生寡糖鏈后，將拆分出的種類歸類，例如歸入(l)-(6)其中一組。計算(l) - (6)每一種的相對含量，即歸入該組的寡糖總
數(shù)相對于樣品中寡糖鏈總含量的比例。
例如，《吏用AIE-HPLC，可以由在BHK細(xì)胞中生成的重組因子VII制劑 拆分13個或更多N-連接寡糖峰(參閱例如Klausen等人， "/Wec/wo入，9: 195, 1998 )。其中5個峰(在Klausen等人的論文中 命名為l-5)不含唾液酸，8個峰(命名為6、 7、和10-15)確實含有 唾液酸。
可以理解，在指定分析中，含唾液酸鏈和缺乏唾液酸鏈的數(shù)目和分 布可能取決于(a)所表達(dá)的多肽；(b)細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件；(c)表達(dá)后 化學(xué)和/或酶促處理對糖型樣式的任何修飾；和(d)采用的分析方法，因 此所得到的樣式可能相應(yīng)變化。
在任何情況中， 一旦將含唾液酸的寡糖與不含唾液酸寡糖拆分開 來，就使用常規(guī)數(shù)據(jù)分析程序來計算每個峰下面的面積；總的峰面積； 和各個峰占總峰面積的百分率。通過這種方式，對于指定制劑，含唾液 酸的峰的面積之和/總的峰面積X IOO即得到依照本發(fā)明的制劑的唾液 酸化百分率數(shù)值(即具有至少一個唾液酸殘基的寡糖鏈的比率)。通過 相似方式，可以計算不含唾液酸或含有至少一個半乳糖或N-乙酰葡萄糖 胺的鏈的百分率。
聚合物
將要偶聯(lián)到多肽上的聚合物分子可以是任何合適分子，諸如天然或合成的均聚物或雜聚物，分子量范圍通常是大約300 - 100, 000 Da，諸 如大約500 - 20， 000 Da、或大約500 - 15, 000 Da、或2 - 15 kDa、或3 -15 kDa、或3-12 kDa、或大約IO kDa。在本文中與某一分子量一起 使用時，術(shù)語"大約"指指定聚合物制劑中的近似平均分子量分布。
均聚物的范例包括聚醇(即poly-OH)、聚胺(即poly-NH2)、和 聚羧酸(即poly-COOH)。雜聚物指包含不同偶聯(lián)基團諸如羥基和胺基 的聚合物。
合適聚合物分子的范例包括選自下組的聚合物分子聚環(huán)氧烷 (PAO)，包括聚亞烷基二醇(PAG),諸如聚乙二醇(PEG)和聚丙二 醇(PPG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐、葡聚糖，包括羧甲基葡 聚糖、聚氨基甲酸酯、聚酯、和聚酰胺，或者適于降低免疫原性和/或 增加功能性體內(nèi)半衰期和/或血清半衰期的任何其它聚合物。 一般而言,. 由聚亞烷基二醇衍生的聚合物是生物相容性的、無毒的、無抗原性的、 且無免疫原性的，具有多種水溶性特性，而且易于由活生物體分泌。
PEG是優(yōu)選的聚合物分子，因為與例如多糖諸如葡聚糖相比它只有 少數(shù)能夠交聯(lián)的反應(yīng)性基團。具體而言，對單功能性PEG、例如甲氧基 聚乙二醇(raPEG)感興趣，因為它的偶聯(lián)化學(xué)較為簡單(只有一個反應(yīng) 性基因能夠用于綴合寡糖上的附著基因)。這樣消除了交聯(lián)的風(fēng)險，由 此得到的多肽綴合物更加均一，而且聚合物分子與多肽的反應(yīng)更加易于 控制。
為了實現(xiàn)聚合物分子對多肽的共價附著，必須以活化形式提供聚合 物分子的羥基末端基團，即具有反應(yīng)性官能團(其實例包括例如伯氨基、 酰肼(HZ)、硫醇、琥珀酸酯(SUC)、琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(SS)、 琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)、琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰 亞胺基羧曱酸酯(SCM)、苯并三唑碳酸酯(BTC) 、 N-鞋基琥珀酰亞胺 (NHS )、醛、硝基苯基碳酸酯(NPC )、和tresylate ( RES ))的形式。 合適的活化聚合物分子可以通過商業(yè)途徑獲得，例如Shearwater Polymers公司(亨茨維爾，阿拉巴馬州，美國)或PolyMASCPha簡ceuticals公司(英國)?；蛘?，可以通過本領(lǐng)域知道的常規(guī)方 法來活化聚合物分子，例如如W0 9Q/13540中所述的方法。用于本發(fā)明 的活化的線性或分支聚合物分子的具體范例描述于Shearwater Polymers公司1997年和2000年的產(chǎn)品目錄(用于研究和制藥的官能化生 物相容聚合物，聚乙二醇及衍生物，收入本文作為參考)。
活化的PEG聚合物的具體范例包括下列線性PEG: NHS-PEG (例如 SPA-PEG、 SSPA—PEG、 SBA-PEG、 SS-PEG、 SSA—PEG、 SC-PEG、 SG-PEG、 和SCM-PEG)、和賺-PEG、 BTC-PEG、 EPOX-PEG、腦-PEG、匿-PEG、 CDI-PEG、 ALD-PEG、 TRES-PEG、 VS-PEG、 IODO-PEG、和MAL-PEG,以及 分支PEG，諸如PEG2-NHS，和US 5， 932, 462和US 5, 643,575 (將二者收 入本文作為參考)中公開的那些。另外，下列發(fā)表物(收入本文作為參 考)公開了有用的聚合物分子和/或PEG化化學(xué)法US 5,824， 778 、 US 5, 476, 653、 WO 97/32607、 EP 229,108、 EP 402,378、 US 4， 902，502、 US 5， 281， 698、 US 5， 122， 6"、 US 5， 219， 564、 WO 92/16555、 WO 94/04193、 WO 94/14758、 WO 94/17039、 WO 94/18247、 WO 94/28024、 WO 95/00162、 WO 95/11924、 WO 95/13090、 WO 95/33490、 WO 96/00080、 WO 97/18832、 WO 98/41562、 WO 98/48837、 WO 99/32134、 WO 99/32139、 WO 99/32140、 WO 96/術(shù)91、 WO 98/32466、 WO 95/06058、 EP 439， 508、 WO 97/03106、 WO 96/21469、 95/13312、 EP 921， 131、 US 5， 736， 625、 WO 98/05363、 EP 809， 996、 US 5,629， 384、 WO 96/41813、 WO 96/07670、 US 5， 473， 034、 US 5,516,673、 EP 605,963、 US5，382，657、 EP 510， 356、 EP 400,472、 EP 183， 503和EP 154， 316。
可通過任何常規(guī)方法來進(jìn)行多肽的寡糖鏈與活化聚合物分子的綴 合。常規(guī)方法對于熟練技術(shù)人員而言是知道的。
熟練技術(shù)人員將認(rèn)識到，將要使用的活化方法和/或綴合化學(xué)取決 于寡糖的附著基團以及聚合物分子的功能性基團(例如胺、羥基、羧基、 醛、酮、巰基、琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺、乙烯砜、或卣代醋酸酯)。
可以理解，聚合物綴合可設(shè)計成生成就附著的聚合物分子的數(shù)目、 這些分子的大小和形式(例如它們是線性的或是分支的)、以及寡糖鏈中的附著位點而言的最佳分子?？梢愿鶕?jù)例如需要實現(xiàn)的期望效果來選 擇將要使用的聚合物的分子量。例如，若綴合的主要目的是獲得具有高 分子量的綴合物(例如用于降低腎清除)，則常常希望綴合盡可能少的 高分子量聚合物分子以獲得期望分子量。
本發(fā)明還包括通過接頭將聚合物分子偶聯(lián)至多肽上。合適的接頭對 于熟練技術(shù)人員而言是眾所周知的。優(yōu)選的范例是氰尿酰氯
(Abuchowski等人，1977， /. ，252: 3578 - 3581; US
4,179,337; Shafer等人，1986， /.戶o/y/z/. 尸o/y/w. ，
24: 375 - 378 )。綴合之后，依照本領(lǐng)域已知方法封閉殘余的活化聚合 物分子，例如通過向反應(yīng)混合液中添加伯胺，并通過合適方法清除由此 生成的滅活聚合物分子。這些方法對于熟練技術(shù)人員而言是眾所周知 的；參閱侈'J^口March， 《爿dra/3ced ( rga/7/c (7力e邁/sfr7》即高級有沖幾4匕 學(xué)，第3版，John Wiley & Sons，紐約，1985; Greene等人，《戶/x^ec〃p^ grou/^ i/ 0_rgai7/c iy/2^Ae^2's》^卩有機合成中的4呆護(hù)寸生基團，John Wi ley & Sons,紐約，1991; Taylor, 1991, 《/Vc^ei/7 尸y/jc^/z7ei3fa/5" a刀f/J/ p/icaf/o"s》^卩蛋白質(zhì)固定的/^、理和應(yīng)用，Marcel Dekker，紐約；Wong， 1992, 《C力e邁/sfr/oZ"戶rc^e//7 Co/7ywga 〃oo a/zd Cr^W/y7h'邱》蛋白質(zhì)綴合和交聯(lián)的化學(xué)，CRC出版社，伯克萊屯； Hermanson等人，1993, 《/邁邁o6』？/zed J/W/ "/Z7w/3d 7ec力/^i/es》 固定化親和配體技術(shù)，Academic出版社，紐約；Dunn等人編，《尸o人pse/7c "rw^y a/ rf "rwg "e//>ery 5y;yfe邁s》聚合藥物和聚合投遞系統(tǒng)，ACS 系列討論會，第469巻，美國化學(xué)學(xué)會，1991)。
可以理解，根據(jù)具體情況，例如多肽的氨基酸序列、所使用的活化 PEG化合物的性質(zhì)、和具體的PEG化條件，包括PEG與多肽的摩爾比，可 以獲得不同程度的PEG化，通常在PEG:多肽比例較高時獲得較高程度的 PEG化。然而，由任何指定PEG化方法得到的PEG化多肽通常將包含具有 略微不同PEG化程度的多肽綴合物的隨機分布。
在本發(fā)明的一個有趣的實施方案中，本發(fā)明的多肽綴合物包含共價
附著于位于因子vn多肽寡糖基團末端的唾液酸基團之一上的聚合物分子，其中所述聚合物分子是附著于多肽上的唯一聚合物分子。在另一個
實施方案中，兩個聚合物分子共價附著于因子VII多肽的一個或多個寡 糖基團上；在其它實施方案中，三個、四個、五個、六個、或七個聚合 物分子共價附著于因子VII多肽上。
在一個實施方案中，因子Vn多肽是圖l所示野生型FVn或FVIIa多 肽；在另一個實施方案中，因子VII多肽是因子VII相關(guān)多肽；在它的一
個實施方案中，因子vn相關(guān)多肽是因子vn氨基酸序列變體。
優(yōu)選的是，這些多肽綴合物包含單個PEG分子。具體而言，優(yōu)選分 子量至少大約5 kDa，特別是大約10-25 kDa，諸如大約15-25 kDa， 例如大約20 kDa或大約lO kDa的線性或分支PEG分子。
優(yōu)選的是，在本發(fā)明的綴合物中，選擇聚合分子的數(shù)目和分子量， 使得通過聚合分子添加的總分子量在5-25 kDa范圍內(nèi)，諸如例如10-25 kDa、大約5 kDa、大約IO kDa、大約15 kDa、或大約20 kDa。
用于生成具有預(yù)定寡糖樣式且附著了聚合物的因子VII制劑的方法 用于生成因子VII制劑的方法
可以使用表達(dá)糖基化因子VII或因子VII相關(guān)多肽的任何適當(dāng)宿主 細(xì)胞(即能夠在多肽的糖基化位點附著寡糖基團的宿主細(xì)胞)來生成因
子vn、因子vn變體、或因子vn相關(guān)多肽。還可以由來自人或其它物 種的血漿分離因子vn。
在有些實施方案中，宿主細(xì)胞是表達(dá)內(nèi)源因子VII基因的人細(xì)胞。
在這些細(xì)胞中，內(nèi)源基因可以是完整的，或者可以在原位修飾，或者可
以原位修飾因子VII基因以外的序列以改變內(nèi)源因子VII基因的表達(dá)?？?br> 以使用能夠表達(dá)內(nèi)源因子vn基因的任何人細(xì)胞。
在其它實施方案中，異源宿主細(xì)胞被處理成由重組基因表達(dá)人因子 vn。宿主細(xì)胞可以是脊推動物、昆蟲、或真菌細(xì)胞。優(yōu)選的是，細(xì)胞
是能夠進(jìn)行所有整個哺乳動物N-連接糖基化、O-連接糖基化、和T羧基 化的哺乳動物細(xì)胞。參閱例如美國專利號4， 784， 950。優(yōu)選的哺乳動物 細(xì)胞系包括CHO (ATCC CCL 61) 、 C0S-1 ( ATCC CRL 1650 )、幼倉鼠腎(BHK)、和HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham等人，/. ， 36: 59 - 72, 1977 )細(xì)胞系。優(yōu)選的BHK細(xì)胞系是tk- tsl3 BHK細(xì)胞系
(Waechter和Baserga，組/. ,， 79: 1106 - 1110，
1982 ),下文稱為BHK 570細(xì)胞。BHK 570細(xì)胞系可以由美國典型培養(yǎng)物 收藏中心(American Type Culture CollecUon, 12301 Parklawn Dr., 羅克維爾，馬里蘭州，20852 )以ATCC編號CRL 10314獲得。tk—tsl3BHK 細(xì)胞系還可以由ATCC以編號CRL 1632獲得。另外，可以使用許多其它細(xì) 胞系，包括大鼠Hep I (大鼠肝癌；ATCC CRL 1600 )、大鼠Hep II (大 鼠肝癌；ATCC CRL 1548 ) 、 TCMK ( ATCC CCL 139 )、人肺(ATCC HB 8065 )、 NCTC 1469( ATCC CCL 9. 1 )、和DUKX細(xì)胞(CHO細(xì)胞系)(Urlaub和Chas in， 戶roc. 〃"厶Sc/, 〃A， 77: 4216 - 4220， 1980 ) (DUKX細(xì)胞還 稱為CXB11細(xì)月包)、和DG44(CH0細(xì)胞系)(Ce/厶33: 405， 1983和5"o/m〃c Ce/7 a/3d (7e/ e〃"， 12: 555， 1986 )。同樣有用的是3T3
細(xì)胞、Namalwa細(xì)胞、骨髓瘤、以及骨髓瘤與其它細(xì)胞的融合體。在一 個特別優(yōu)選的實施方案中，宿主細(xì)胞是適應(yīng)了在缺乏血清的條件下生長 且被處理成表達(dá)因子VII的BHK 21細(xì)胞。在有些實施方案中，細(xì)胞可以 是所表達(dá)的糖基化酶(諸如例如糖基轉(zhuǎn)移酶和/或糖苷酶)鐠在質(zhì)量上 或數(shù)量上與衍生它們的細(xì)胞類型相比有所不同的突變或重組細(xì)胞。還可 以將細(xì)胞處理成表達(dá)其它異源肽或蛋白質(zhì)，包括例如截短形式的因子 VII。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞是被處理成共表達(dá)目的因子VII多肽
(即因子VII或因子VII相關(guān)多肽)和另一種異源肽或多肽(諸如例如修
飾酶)或因子vn片段的CHO細(xì)胞。
可以通過下列步驟來進(jìn)行用于生成因子vn (它包含上文(i) - (6)
多肽的糖型分布的方法
(a) 在第一組預(yù)定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)表達(dá)因子VII或因子VII相關(guān)多 肽的細(xì)力包；
(b) 由培養(yǎng)物回收因子VII或因子VII相關(guān)多肽以獲得包含所述多 肽的制劑；并(C)分析連接至多肽上的寡糖的結(jié)構(gòu)以測定糖型樣式。
這些方法還可以包括
(dl)改變步驟(a)的培養(yǎng)條件以獲得第二組預(yù)定培養(yǎng)條件； (el)重復(fù)步驟(b) - (dl)直至獲得期望的糖型樣式； (fl)在聚合物分子將共價附著于多肽的寡糖基團上的條件下使因 子VII或因子VII相關(guān)多肽接觸聚合物分子。 或者，這些方法還可以包括 (d2)化學(xué)和/或酶促處理制劑以改變寡糖結(jié)構(gòu)；并 (e2)重復(fù)步驟(b) - (d2)直至獲得期望的糖型樣式。 這些方法還可以包括對具有預(yù)定糖型樣式的制劑進(jìn)行至少一種生 物活性(包括例如凝結(jié)、因子X蛋白水解、或TF結(jié)合)或其它功能性(諸 如例如藥物動力學(xué)特征或穩(wěn)定性)的測試，并將特定糖型樣式與特定生 物活性或功能性特征聯(lián)系起來，以鑒定期望的糖型樣式。
步驟(dl)中可以改變的培養(yǎng)條件變量包括但不限于細(xì)胞來源，諸 如例如由與最初所用的細(xì)胞不同的物種衍生的細(xì)胞；或者一種或多種糖 基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶或糖基化裝置的其它成分有所改變的突變或重組細(xì) 胞(參閱Grabenhorst等人，67，,*"" ， 16: 81， 1999; Bragonzi 等人，5/oc/ze邊.Jcta， 1474: 27 3, 2000; Weikert， jVatfire 5/ofec力/30/. , 17: 1116， 1999 );多肽的表達(dá)水平；代謝條件，i者如 例如葡萄糖或谷氨酰胺濃度；血清的存在與否；維生素K的濃度；蛋白 水解產(chǎn)物、激素、痕量金屬、鹽、以及工藝參數(shù)(像溫度、溶解氧水平 和pH)。
可以在步驟(d2)中用于修飾制劑的寡糖樣式的酶促處理包括但不 限于以一定順序、在能夠?qū)崿F(xiàn)對具有特定末端結(jié)構(gòu)的寡糖鏈的分布產(chǎn)生 期望改變的條件下用一種或多種唾液酸酶(神經(jīng)氨酸苷酶)、半乳糖苦 酶、巖藻糖苦酶、半乳糖轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖轉(zhuǎn)移酶、和/或唾液酸轉(zhuǎn)移酶 進(jìn)行的處理。糖基轉(zhuǎn)移酶可以由Calbiochem (拉霍亞，加利福尼亞州) 購買，而糖苷酶可以由Glyko (諾瓦托，加利福尼亞州)購買。
在一系列實施方案中，對表達(dá)因子VII或相關(guān)多肽的宿主細(xì)胞進(jìn)行特定培養(yǎng)條件，其中它們分泌具有上文(l) _ (6)所述的任何期望寡糖結(jié)
構(gòu)樣式的糖基化因子vn多肽。這些培養(yǎng)條件包括但不限于減少血清或 完全不用。優(yōu)選的是，宿主細(xì)胞適應(yīng)了在缺乏血清的條件下生長，并在 生長期和生產(chǎn)期兩個階段都在缺乏血清的條件下培養(yǎng)。這些適應(yīng)化流程
4葛述于伊J 3口 Scharfenberg等人， 《J/7/邁a/ Ce// Tec/wo/c^/ "ereJo/we/ " "prarc^ Me "" Ce/ ^r/》即走向21世紀(jì)的動物細(xì)胞才支 術(shù)發(fā)展，E. C. Beuvery等人編，Kluwer Academic Publishers, 第619 一 623頁，1995 ( BHK和CHO細(xì)胞)；Cruz, A.orec力/ oL 7"ec力.，11: 117 -120, 1997 (昆蟲細(xì)胞)；Keen, 6>fofecA/7o/. ， 17: 203 - 211， 1995 (骨髓瘤細(xì)胞)；Berg等人，A'0"c力/2/《ues， 14: 972 - 978， 1993 (人 腎293細(xì)胞)。在一個優(yōu)選的實施方案中，加到細(xì)胞中的培養(yǎng)基不含蛋 白質(zhì)或由動物組織或動物細(xì)胞培養(yǎng)物分離的其它成分。參閱例如下文實 施例l。通常，除了常規(guī)成分以外，適于生產(chǎn)因子VII的培養(yǎng)基含有因子 VII中谷氨酰胺殘基y-羧化所需要的維生素K，濃度為O. 1-50 mg/L。
在另一系列的實施方案中，通過對因子VII或因子VII相關(guān)多肽制劑 進(jìn)行酶促和/或化學(xué)修飾其中所含的N-連接和/或0-連接的寡糖來生成 糖型，諸如用唾液酸轉(zhuǎn)移酶或半乳糖轉(zhuǎn)移酶對制劑進(jìn)行^l"飾，諸如例如 US 6， 399， 336中所述。優(yōu)選的是，修飾N-連接的寡糖。唾液酸轉(zhuǎn)移酶能
夠以高百分比對糖蛋白上的受體基團(例如末端半乳糖)進(jìn)行唾液酸化。 通常每mg糖蛋白使用大約50mU或更少唾液酸轉(zhuǎn)移酶來獲得期望結(jié)果。通
常的結(jié)果是，具有通過這種方法改變了的糖型樣式的糖蛋白上的寡糖鏈 與未改變的多肽相比，將有較大百分比的末端半乳糖殘基得到唾液酸 化。實質(zhì)上，在使用這些方法后，可能將100%的末端半乳糖殘基唾液 酸化。這些方法通常能夠在大約48小時或更短時間內(nèi)實現(xiàn)期望水平的唾 液酸化。優(yōu)選的是，對于糖蛋白上N-連接的碳水化合物的糖基化，唾液 酸轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)⑼僖核徂D(zhuǎn)移至序列Gal ((3 l-〈4)GlcNAc-上，即完全唾液 酸化的碳水化合物結(jié)構(gòu)上的末端唾液酸下面最常見的倒數(shù)第二個序列。 使用(P 1-〉4)GlcNAc-作為受體基團的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的范例是ST3Gal III、 ST3Gal IV、和ST3Gal V (通過cc2-〉3連接附著NeuAc)以及ST6GalI和ST6Gal II (通過cc2-〉6連接附著NeuAc)(參閱US 6, 399,336 )。 (唾液酸轉(zhuǎn)移酶的命名法描述于Tsuji等人，( 7ycoWo/ogy, 6: v-xiv， 1996 )。
因此，如果希望終產(chǎn)物中兩種連接都有，那么兩種酶的混合物可能 是有價值的。簡而言之，使用例如唾液酸轉(zhuǎn)移酶循環(huán)(其中包括CMP-唾 液酸合成酶)來實現(xiàn)糖蛋白的唾液酸化。這個循環(huán)中的CMP-再生系統(tǒng)包 括胞苷單磷酸(CMP)、核苷三磷酸、磷酸供體、能夠?qū)⒘姿嵊闪姿峁?體轉(zhuǎn)移至核苷二磷酸的激酶、和能夠?qū)⒛┒肆姿嵊珊塑杖姿徂D(zhuǎn)移至 CMP的核苷單磷酸激酶。再生系統(tǒng)中還采用CMP-唾液酸合成酶，它將唾 液酸轉(zhuǎn)移至CMP。在唾液酸化循環(huán)中，在存在添加的ATP時通過核苷單磷 酸激酶將CMP轉(zhuǎn)變成CDP。 ATP是在存在添加的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP) 時通過丙酮酸激酶(PK)由它的副產(chǎn)物ADP催化再生的。CDP進(jìn)一步轉(zhuǎn)變 成CTP，這一轉(zhuǎn)變是在存在PEP時由PK催化的。CTP與唾液酸反應(yīng)而形成 無機焦磷酸(PPi)和CMP-唾液酸，后一個反應(yīng)是由CMP-唾液酸合成酶 催化的。在半乳糖基葡萄糖苷唾液酸化后，釋放的CMP再次進(jìn)入再生循 環(huán)而重新形成CDP、 CTP、和CMP-唾液酸。形成的PPi得到清除，并形成 無機磷酸作為副產(chǎn)物。丙酮酸也是副產(chǎn)物。由于這種方法的自含和循環(huán) 特性， 一旦所有反應(yīng)物和酶都存在，反應(yīng)將繼續(xù)下去，直至一種底物(例 如游離的NeuAc和PEP，或者受體)耗盡。唾液酸轉(zhuǎn)移酶描述于例如l^ 5， 374, 541和US 6， 399, 336中。
唾液酸轉(zhuǎn)移酶的接受體將存在于待修飾的糖蛋白上。合適的接受體 包括例如Gal ( P 1—>4)GlcNAc-、 Gal( p 1—>4)GalNAc-、 Gal(P l-〉3)Ga服c-、 Gal ( p 1-〉3)GlcNAc-、 Gal ( P 1->6) GlcNAc-、 Gal(P l-〉4)Glc-、和本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員知道的其它接受體(參閱例如 Paulson等人，1978， /. C力e瓜，253: 5617 - 5624 )。通常，接
受體包含在附著于多肽中存在的天冬酰胺、絲氨酸、或蘇氨酸殘基的寡 糖鏈中。
糖蛋白可以是完全或部分經(jīng)過"修剪"而暴露唾液酸轉(zhuǎn)移酶的接受 體或可以添加一個或多個適當(dāng)殘基以獲得合適接受體的模塊。酶諸如糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)切糖苷酶可用于附著和修剪反應(yīng)。例如，可以在對蛋白質(zhì) 進(jìn)行唾液酸轉(zhuǎn)移酶循環(huán)之前通過用唾液酸酶處理糖蛋白而"修剪"它以 生成末端半乳糖基團，或者，甚至可以通過進(jìn)一步的半乳糖苦酶處理而
到達(dá)n-乙酰葡萄糖胺水平。用于獲得具有合適唾液酸化接受體的多肽的 方法參閱例如美國專利號5， 272， 066。
用于將聚合物分子共價附著于因子vii多肽的方法 可以通過化學(xué)合成或例如用經(jīng)修飾的唾液酸對多肽進(jìn)行酶促處理 而將多種化學(xué)模塊諸如用于實踐本發(fā)明的聚合物分子共價附著于因子 vii多肽上的寡糖上。還可以通過接頭將聚合物分子偶聯(lián)至寡糖。合適 的接頭對于熟練技術(shù)人員而言是眾所周知的。范例包括但不限于n-(4-乙酰苯基)馬來酰亞胺、琥珀酰亞胺基酯活化的馬來酰亞胺4汙生物，諸 如商品化的琥珀酰亞胺基4-馬來酰亞胺丁酸酯、1， 6-二馬來酰亞胺己 貌。
可以將多種化學(xué)模塊諸如用于實踐本發(fā)明的聚合物分子共價附著 于唾液酸，由此得到的"經(jīng)修飾"(或綴合)的唾液酸隨后摻入唾液酸 轉(zhuǎn)移酶循環(huán)，導(dǎo)致聚合物分子共價附著于糖蛋白?？梢酝ㄟ^熟練技術(shù)人 員知道的常規(guī)方法來生成綴合的唾液酸。還可以通過接頭將聚合物分子 偶聯(lián)至唾液酸上。
Fvn和fvii類似物的化學(xué)酶促衍生化
通式i 通式2
其中
-X是獨立選自S、 0、 NH、或價鍵的成員；-R1、 R2、 R3、 R4、和R5是獨立選自H、聚合物和共價附著于聚合 物上的接頭分子、?；?包括乙?；土u乙酰基)、和烷基的成員；
-NT是選自Na+、 K+、 Li+、四丁基銨、或類似陽離子的陽離子。
在一個優(yōu)選的實施方案中，R1和R2獨立的是分子量為1-40， 000 Da 的基于PEG的聚合物。
在一個還要更加優(yōu)選的實施方案中，Rl獨立的是分子量為l-40,000 Da的基于PEG的聚合物。
在方案l所示的一個例示性實施方案中，首先，依照Isecke，R.、 Brossmer，R. , re,ra力edro仏1994, 50 (25): 7445 — 7460所述，將胺、 2-羥基、和羧基受保護(hù)的神經(jīng)氨酸轉(zhuǎn)變成它的9-氨基衍生物，接著，使 用標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)條件，進(jìn)一步用PEG-COOH進(jìn)行衍生化。然后，在溫和的酸性 條件下將PEG衍生產(chǎn)物去保護(hù)，并酶促轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的核苷酸糖。
方案1:
<formula>formula see original document page 38</formula>
在方案2所示的另一個例示性實施方案中，在Mitsunobu條件下用經(jīng) 過PEG衍生化的硫代酸處理N-乙酰神經(jīng)氨酸，以生成PEG衍生化的N-乙酰 神經(jīng)氨酸，隨后將其轉(zhuǎn)變成糖核苷酸。
方案2:<formula>formula see original document page 39</formula>在方案3所示的一個例示性實施方案中，經(jīng)修飾的半乳糖的>5克醇與
含馬來酰亞胺模塊的PEG反應(yīng)。然后可以通過酶促或化學(xué)方法的將PEG-半乳糖化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的核苷酸糖。 方案3:
<formula>formula see original document page 39</formula>
在方案4所示的另 一個例示性實施方案中，6-氨基半乳糖 (Fernandez, J.等人，/. ，1993, 58 (19): 5192 - 5199 )
與含受保護(hù)的氨基酸模塊的PEG反應(yīng)。甲酯是皂化的。然后可以通過酶 促或化學(xué)方法將PEG-半乳糖化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的核普酸糖。
方案4:半乳糖激酶，ATP HQ' UDP-半乳糖焦磷酸酶 UTP
在方案5所示的另一個例示性實施方案中，受保護(hù)的6-溴-半乳糖 (Hodosi,G. 、 Podanyi,B.、 和Kuszmann， J. ， ( arZ7a6/<lr., 1992， 230 (2): 327 - 342 )與含石克醇模塊的PEG反應(yīng)。在酸性條件下除去異亞 丙基。然后可以通過酶促或化學(xué)方法將PEG-半乳糖化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的 核苦酸糖。
方案5:
TMS-CI，吡咬 1當(dāng)量TMS-I UDP四丁基銨 氟化四丁基銨
OH 0H
在方案6所示的另 一個例示性實施方案中，受保護(hù)的半乳糖醛酸 (Godage, Y. S.和Fairbanks， A. J. , refra^etlro/ L ， 2000， 41(39): 7589 - 7594 )與含胺部分的PEG反應(yīng)。在酸性條件下除去異亞丙基。然
<formula>formula see original document page 40</formula>后可以通過酶促或化學(xué)方法將PEG-半乳糖化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的核香酸 糖。
方案6: <formula>formula see original document page 41</formula>
一般而言，可以使用天然或突變的糖基轉(zhuǎn)移酶將糖核苦酸(諸如上 文所述那些糖核苦酸)酶促轉(zhuǎn)移至合適的糖蛋白(諸如FVII或FVII相關(guān) 多肽)上，所述糖基轉(zhuǎn)移酶例如包括但不限于ot2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、 ot2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶、或pi，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶。根據(jù)PEG衍生化的糖核苷 酸的選擇(CMP-SA-PEG或UDP-Gal-PEG),可能優(yōu)選在與糖基轉(zhuǎn)移酶和 PEG衍生化的糖核苦酸反應(yīng)之前用唾液酸酶、半乳糖苷酶、或二者處理 FVII相關(guān)多肽。
由此，在一個優(yōu)選的實施方案中，用唾液酸酶處理FVII類似物，以 生成唾液酸-FVII類似物，隨后用唾液酸轉(zhuǎn)移酶和依照通式l的 CMP-SA-PEG類似物進(jìn)行處理，以生成PEG衍生化的FVII類似物。
在另一個實施方案中，順序處理FVII相關(guān)多肽，首先是唾液酸酶， 其次是半乳糖苷酶，以生成唾液酸-半乳糖-FVII相關(guān)多肽。然后用半乳 糖轉(zhuǎn)移酶和依照通式2的UDP-Gal-PEG類似物處理這種類似物，以生成 PEG4汙生化的FVII類似物。
在系列實施方案中，采用直接或通過接頭模塊共價結(jié)合至聚合物上的經(jīng)修飾半乳糖化合物?？梢灾苯硬捎靡蜃觱n或因子vn相關(guān)多肽來獲 得較低水平的聚合物/多肽比率，或者首先用唾液酸酶處理因子vn或因 子vn相關(guān)多肽以除去末端唾液酸，從而獲得較高水平的聚合物/肽比 率。通過用半乳糖苷酶處理多肽，可以進(jìn)入經(jīng)修飾半乳糖化合物的附著
點。可以采用UDP活化形式的經(jīng)修飾半乳糖化合物和半乳糖轉(zhuǎn)移酶來開。
成經(jīng)修飾的半乳糖化合物與經(jīng)處理的多肽之間的鍵。這一類型的例示性 實施方案例示于方案7中，其中黑色的圓代表因子vn或因子vn相關(guān)多 肽，還例示了一些碳水化合物的末端部分。
方案7:
<image>image see original document page 42</image>
FVII和FVII類似物的化學(xué)衍生化
使用高碘酸鈉對碳水化合物殘基進(jìn)行化學(xué)氧化是制備FVII-PEG綴
合物的候選方法。碳水化合物的化學(xué)氧化通常將生成多個反應(yīng)性醛基，
每一個都能夠與PEG-親核試劑，諸如PEG-酰肼、PEG-屮羥胺、和PEG-胺反應(yīng)。
用PEG-酰肼和PEG-^輕胺分別能夠制備穩(wěn)定的FVII-PEG-酰腙和 FVII-PEG-肟綴合物。用PEG-胺能夠制備略不穩(wěn)定的Shiff堿綴合物形 式。然而，通過氰硼氫化鈉的還原形成仲胺鍵，能夠進(jìn)一步穩(wěn)定這種綴合物。FVII-PEG-酰腙綴合物也可以用氰硼氫化鈉還原而形成N， IT -連接 的肼綴合物。
糖綴合的因子VII制劑的純化
在用于本文時，"因子VII制劑"指已經(jīng)與合成它們的細(xì)胞或反應(yīng) 介質(zhì)分開的多種因子VII多肽、因子VIIa多肽、或因子VII相關(guān)多肽，包 括變體和化學(xué)修飾形式。
因子VII制劑和綴合物的純化
可以通過本領(lǐng)域知道的任何方法來實現(xiàn)將重組生產(chǎn)的多肽與它們
的細(xì)胞來源相分離，包括但不限于將包含期望產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)基與粘附 細(xì)胞培養(yǎng)物分開；離心或過濾以除去非粘附細(xì)胞；諸如此類。
任選的是，可以進(jìn)一步純化因子vn多肽。可以使用本領(lǐng)域知道的 任何方法來實現(xiàn)純化，包括但不限于親和層析，諸如例如在抗因子vn
抗體柱上進(jìn)行(參閱例如Wakabayashi等人，/. 5/o厶C力e邁.，261: 11097， 1986;和Thira等人，"/oc力e瓜，27: 7785， 1988 );疏水相互作用層沖斤； 離子交換層析；大小排阻層析；電泳流程(例如制備性等電聚焦(IEF)、 差異溶解性(例如硫酸銨沉淀)、或抽提等等。通常參閱Scopes ，《？rofe//7 尸wr/Z7caf/'o/3》艮卩蛋白質(zhì)純4b, Springer—Verlag,紐纟々，1982 ;和
《尸ro,e//7尸w/"277ca^yo/3》艮卩蛋白質(zhì)純^f匕，J. 一C. Janson和Lars Ryden 編，VCH Publishers,紐約，1989。純化后，制劑優(yōu)選包含少于大約IO
% (以重量計)、更優(yōu)選少于大約5%、且最優(yōu)選少于大約1%的由宿主 細(xì)胞衍生的非因子VII蛋白質(zhì)。
可以使用因子XIIa或具有胰蛋白酶樣特異性的其它蛋白酶，諸如例 如因子IXa、激肽釋放酶、因子Xa、和凝血酶，通過蛋白水解切割來激 活因子VII和因子VII相關(guān)多肽。參閱例如0sterud等人，A'oc/ e瓜，11: 2853, 1972; Thomas,美國專利號4， 456， 591;和Hedner等人，/.
， 71: 1836， 1983?；蛘?，可以通過流經(jīng)離子交換層析柱諸如 Mono Q (Pharmacia)等來激活因子VII。然后可以如下文所述配制并: 施用由此得到的激活的因子VII。因子vn制劑的功能特性
與參考制劑相比，具有共價附著了聚合物分子的預(yù)定寡糖樣式的因 子vii多肽和因子vn相關(guān)多肽的本發(fā)明制劑展示改進(jìn)的功能特性。所述
改進(jìn)的功能特性可以包括但不限于l)物理特性，諸如例如貯藏穩(wěn)定性； 2)藥物動力學(xué)特性，諸如例如生物利用度和半衰期；和3)在人體中的免 疫原性。
參考制劑指包含具有與進(jìn)行比較的本發(fā)明制劑所含多肽相同的氨 基酸序列、但未綴合本發(fā)明制劑中的任何聚合物分子的多肽的制劑(諸
如例如非綴合形式的野生型因子vn或特定變體或化學(xué)修飾形式)。例 如，參考制劑通常包含非綴合的野生型因子vn或非綴合的因子vn相關(guān) 多肽。
可以通過測量(l)將干粉貯藏于25。C時制劑的生物活性衰減20。/。所 需要的時間，和/或(2)制劑中因子VI Ia聚集體的比率加倍所需要的時 間，由此評估因子VII制劑的貯藏穩(wěn)定性。
在有些實施方案中，當(dāng)本發(fā)明制劑與參考制劑二者以干粉|&藏于25 'C時，本發(fā)明的制劑展示生物活性衰減20%所需要的時間相對于參考制 劑實現(xiàn)相同現(xiàn)象所需要的時間增加至少大約3 0 % 、優(yōu)選至少大約6 0 % 、, 且更優(yōu)選至少大約100%。生物活性測量可以^使用凝結(jié)測定法、蛋白水 解測定法、TF結(jié)合測定法、或不依賴TF的凝血酶生成測定法中的任何方 法來進(jìn)行。
在有些實施方案中，當(dāng)本發(fā)明制劑與參考制劑二者以干粉貯藏于25 。C時，本發(fā)明的制劑展示聚集體加倍所需要的時間相對于參考制劑而言 增加至少大約30%、優(yōu)選至少大約60%、且更優(yōu)選至少大約100% 。如 下所述，通過在蛋白質(zhì)Pak 300 SW柱(7. 5 x 300ram) (Waters, 80013 ) 上進(jìn)行凝膠滲透HPLC來測定聚集體的含量。用洗脫液A ( 0. 2M硫酸銨、5 %異丙醇，用磷酸將pH調(diào)至2.5,然后用三乙胺將pH調(diào)至7. 0)平衡柱， 然后將25 n g樣品加樣到柱上。用洗脫液A以流速O. 5ml/min洗脫30分鐘， 并通過測量215nra的吸光率來進(jìn)行檢測。根據(jù)因子VII聚集體峰面積/因子VII峰總面積(單體和聚集體)之比來計算聚集體的含量。
"生物利用度"指施用后在預(yù)定時間在血漿中能夠檢測到的因子
vn或因子vn相關(guān)制劑占施用劑量的比率。通常，生物利用度是如下在
測試動物中測量的以大約25 - 250jug/kg的劑量施用制劑；施用后預(yù) 定時間采集血漿樣品；并使用凝結(jié)測定法(或任何生物測定法)、免疫 測定法、或相當(dāng)測定法中的一種或多種方法測定樣品中因子VII或因子 VII相關(guān)多肽的含量。數(shù)據(jù)通常以因子VII對時間作圖來顯示，而生物利 用度表述成曲線下的面積(AUC)。待測制劑的相對生物利用度指待測 制劑的AUC與參考制劑的MJC之間的比率。
在有些實施方案，本發(fā)明的制劑展示參考制劑的生物利用度的至少 大約110%、優(yōu)選至少大約120%、更優(yōu)選至少大約130%、且最優(yōu)選至 少大約140%?？梢栽谌魏尾溉閯游镂锓N中測量生物利用度，優(yōu)選狗， 而且用于計算AUC的預(yù)定時間可以涵蓋10分鐘-8小時的不同增量。
"半衰期"指因子vn多肽或因子vn相關(guān)多肽的血漿濃度由特定值 降至該值的 一 半所需要的時間?？梢允褂门c生物利用度相同的流程來測 定半衰期。在有些實施方案中，本發(fā)明的制劑展示半衰期相對于參考制
劑的半衰期增加至少大約O. 25小時、優(yōu)選至少大約O. 5小時、更優(yōu)選至 少大約1小時、且最優(yōu)選至少大約2小時。
制劑的"免疫原性"指制劑在施用于人后引發(fā)有害免疫應(yīng)答的能力， 可以是體液應(yīng)答、細(xì)胞應(yīng)答、或二者。已知因子VIIa多肽和因子VIIa相 關(guān)多肽不會在人體中引發(fā)可檢測的免疫應(yīng)答。但是，在任何人類亞群中， 可能存在對施用的特定蛋白質(zhì)展示敏感性的個體。可以通過使用本領(lǐng)域
性T細(xì)胞定量來測量免疫原性。在有些實施方案中，本發(fā)明的制劑展示 在敏感個體中的免疫原性相對于參考制劑在該個體中的免疫原性降低 了至少大約10%、優(yōu)選至少大約25%、更優(yōu)選至少大約40%、且最優(yōu)選 至少大約50%。
藥物組合物紊亂，包括但不限于那些由凝結(jié)因子缺乏(如血友病A和B或凝結(jié)因子XI 或VII缺乏)、由血小板減少或von Willebrand氏病、或由凝結(jié)因子抑 制劑引起的出血紊亂，或者任何原因的過度出血。還可以對與手術(shù)或其 它創(chuàng)傷有關(guān)的患者或者接受抗凝劑療法的患者施用所述制劑。
包含依照本發(fā)明的、與野生型因子VII相比生物活性實質(zhì)性降低的
因子vn相關(guān)多肽的制劑可以作為抗凝劑，諸如例如用于經(jīng)歷血管成形 術(shù)或其它手術(shù)操作的患者，這些手術(shù)可能增加例如再狹窄中發(fā)生的血栓 形成或血管堵塞的風(fēng)險。開出抗凝劑藥方的其它醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥包括但不限
于深靜脈血栓形成、肺栓塞、中風(fēng)、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)、與革 蘭氏陰性內(nèi)毒素血癥有關(guān)的肺和腎中的纖維蛋白沉積、心肌梗塞；急性 呼吸窘迫綜合癥(ARDS)、全身性炎性應(yīng)答綜合癥(SIRS)、溶血性尿 毒癥綜合癥(HUS ) 、 M0F和TTP。
包含依照本發(fā)明的因子VII和因子VII相關(guān)制劑的藥物組合物主要 意欲腸胃外施用，以進(jìn)行預(yù)防性和/或治療性處理。優(yōu)選的是，腸胃外 施用藥物組合物，即靜J^內(nèi)、皮下、或肌肉內(nèi)施用。它們可以通過連續(xù) 或脈動輸注進(jìn)行施用。
藥物組合物或配方包含依照本發(fā)明的制劑，并聯(lián)合、優(yōu)選溶于制藥 學(xué)可接受載體、優(yōu)選水性載體或稀釋劑中?？梢允褂枚喾N水性載體，諸 如水、緩沖液、0. 4%鹽水、0. 3%甘氨酸、諸如此類。本發(fā)明的制劑還 可以配制成脂質(zhì)體制劑，用于投遞或靶向到損傷部位。脂質(zhì)體制劑概括 描述于例如美國專利號4， 837， 028、 4,501,728、和4,975， 282中。組合 物可以通過常規(guī)的、眾所周知的滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌。可以包裝由此生成 的水溶液備用，或者在無菌條件下過濾并凍干，在施用前將凍干制劑與 無菌水溶液。
組合物中可以包含制藥學(xué)可接受的輔助物質(zhì)或佐劑，包括但不限于 pH調(diào)節(jié)和緩沖劑和/或張力調(diào)節(jié)劑，諸如醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯 化鉀、氯化鉤、等。
這些配方中的因子vn或因子vn相關(guān)多肽的濃度可以廣泛變化，即由低于大約0.5% (以重量計)、通常是或至少大約1% (以重量計)至 高達(dá)15%或20°/。(以重量計)，而且將主要根據(jù)流體體積、粘度等選擇， 并與選擇的具體施用模式一致。
由此，用于靜脈內(nèi)輸注的典型藥物組合物可以配制成包含25 Oml無 菌Ringer氏溶液和10mg制劑。用于制備可腸胃外施用的組合物的實際方 法對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言將是知道的或顯而易見的，而且更加詳 細(xì)的描述于侈4:i(口《We/2 /i gfo/7Zs尸/ ar邊aceuf/ca/ Sc/e/ ces》艮卩雷日月牽頁 制藥科學(xué)，第18版，Mack出版^S司，伊斯頓，賓夕法尼亞州，1990。
包含本發(fā)明制劑的組合物可以施用于預(yù)防性和/或治療性處理目 的。在治療性應(yīng)用中，如上所述對早就患有疾病的受試者施用組合物， 施用的量足以治愈、減輕、或部分阻止疾病及其并發(fā)癥。足以實現(xiàn)這一 目的的量定義為"治療有效量"。對于每種目的的有效量將取決于疾病 或損傷的嚴(yán)重程度，以及受試者的體重和一般狀況。然而， 一般而言， 有效量的范圍將是7Okg受試者每天大約0. 05mg至大約50Orag制劑，更常 用的劑量是每天大約l. 0mg至大約200mg制劑。可以理解，可以利用常規(guī) 實驗，通過構(gòu)建數(shù)值矩陣并測試矩陣中的不同點來實現(xiàn)適當(dāng)劑量的測 定。
可以通過例如噴霧、灌注、二聯(lián)氣嚢導(dǎo)管、stent、摻入血管移植 物或stent、用于包被氣嚢導(dǎo)管的水凝膠、或其它完善建立的方法等手 段來進(jìn)行本發(fā)明制劑的局部投遞，諸如局部應(yīng)用。在任何情況下，藥物 組合物提供的制劑的量應(yīng)當(dāng)足以有效治療受試者。
本發(fā)明的藥物組合物還可以包含其它生物活性劑，諸如例如非因子
vn相關(guān)凝血劑或抗凝劑。
緩釋制劑
緩釋制劑的范例包括含有多肽或綴合物的固體疏水聚合物的半滲 透基質(zhì)，基質(zhì)具有合適的形式，諸如薄膜或微嚢。緩釋基質(zhì)的實施例包
括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸S旨)或聚(乙烯醇))、 聚交酯、L-谷氨酸與乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物-渚如ProLease⑧技術(shù)或Lupron Depot @ (由乳酸-乙醇酸寡聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射孩吏球 體)、和聚D-(-)-3-羥丁酸。諸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等 聚合物能夠在較長的時間里釋放分子，諸如長達(dá)或超過100天，而某些 水凝膠在較短的時間里釋放蛋白質(zhì)。當(dāng)封裝的多肽在體內(nèi)保持長時間 后，它們可能因暴露于37'C濕氣而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性的喪失 和免疫原性的可能改變?？梢愿鶕?jù)有關(guān)機制而設(shè)計穩(wěn)定化的合理策略。 例如，若發(fā)現(xiàn)聚集機制是通過硫醇-二硫化物交換形成分子間S-S鍵， 則可以通過修飾巰基、由酸性溶液凍干、控制舍濕量、使用適當(dāng)添加劑、 和開發(fā)特定聚合物基質(zhì)組合物來實現(xiàn)穩(wěn)定化。
下列非限制性實施例例示了本發(fā)明的某些方面。
實施例
實施例l:高唾液酸含量的產(chǎn)品的糖PEG化 通過將分子量IO， 000 Da的PEG共價附著于唾液酸來制備聚乙二醇 -CMP-唾液酸(PEG-CMPSA)。
用唾液酸酶處理唾液酸含量為87 - 99 %的因子VI Ia (例如如美國專 利號5， 272， 066中所述)，并以PEG-CMPSA作為供體分子用唾液酸轉(zhuǎn)移酶 再次唾液酸化(例如如美國專利號6， 399， 336中所述)。在PEG化反應(yīng)達(dá) 到最大摻入后，向反應(yīng)混合液中加入CMPSA以對任何暴露的末端半乳糖 進(jìn)行力口帽。
通過SDS-PAGE、 CE-PAGE、等電聚焦凝膠、和CE-IEF來分析PEG化唾 液酸的摻入。
摻入了 94 - 100 %的唾液酸；平均摻入了 1 - 4個PEG基團。
實施例2:具有中等唾液酸含量的產(chǎn)品的糖PEG化 通過將分子量為IO， QOO Da的PEG共價附著于唾液酸來制備聚乙二醇 —CMP-唾液酸(PEG-CMPSA )。以PEG-CMPSA作為供體分子用唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理唾液酸含量為87 -93。/。的因子VIIa (例如如美國專利號6，399，336中所述)。在PEG化反應(yīng) 達(dá)到最大摻入后，向反應(yīng)混合液中加入CMPSA以對任何暴露的末端半乳 糖進(jìn)行加帽。
通過SDS-PAGE、 CE-PAGE、等電聚焦凝膠、和CE-IEF來分析PEG化唾 液酸的摻入。
摻入了 87 - 100 %的唾液酸；平均摻入了O. 1 - 0. 5個PEG基團。
實施例3
將PEG化的胞普5'-單磷酸-唾液酸衍生物(CMP-SA-PEG) : N-乙酰 -02-曱基-9-氨基-9-脫氧-神經(jīng)氨酸甲酯(10mg, 0.031ramo1，依照 Isecke,R. 、 Brossmer,R. , 7e/ra力ec^rao, 1994， 50 (25)， 7445-7460 制備)溶于 K ( 2ml )，并力口入raPEG—SBA ( 170mg， 0. 03mrao1， 5kDa， Shearwater 2M450H01)。于室溫攪動混合液直至反應(yīng)完成(依照TLC)。 通過凍干法來除去溶劑，并將殘渣再次溶于甲醇與O. 1MNaOH溶液的l:l 混合液(5ml)中。將混合液于室溫攪動l小時，然后于4。C通過Dowex 50W-X8 (H+)樹脂柱，并凍干。然后將殘渣再次溶于水(5ml )，加入Dowex 50W-X8 (H+)樹脂，并攪動混合液直至反應(yīng)完成(TLC)。
如下所述，大體依照E. S. Si隨、M. D. Bednarski 、 和 G.M. Whitesides， /. J瓜C力e瓜， 1998， 110， 7159 - 7163制備通 式l的唾液酸衍生物的胞苦5'-單磷酸類似物將胞苦5'-單磷酸神經(jīng)氨 酸合成酶溶于9-PEG化的N-乙酰-9-氨基-9-脫氧-神經(jīng)氨酸(如上所述制 備)溶液，并加到CTP溶液中。將混合液調(diào)至pH8.5，并加入MgCh'6H20。 于室溫攪動反應(yīng)液，并通過蠕動泵加入1N NaOH以維持pH接近8. 5。當(dāng)小 樣的111-NMR顯示反應(yīng)完成后，通過標(biāo)準(zhǔn)離子交換層析分離產(chǎn)物。
實施例4
將FVIIa ( lmg)溶于lral 0. 1M醋酸鈉pH5. 5，并用10mM高碘酸鈉將 它的多糖于室溫氧化30分鐘達(dá)到一定水平。然后將溶液在100raM醋酸鈉pH5.5中透析。透析后，將PEG-C(0)-NHNH2(通過mPEG-SBA(2rag, 5 kDa, Shearwater 2M450H01 )的肼解來制備)與經(jīng)過氧化的FVIIa混合，并一 邊溫和搖動一邊讓其于室溫反應(yīng)過夜。將由此得到的FVIIa-PEG綴合物 溶液在100mMTris-HCl緩沖液pH7. 5中透析(截留值為10 kDa的透析膜)， 并保存于4"C。
藥理學(xué)方法
半衰期、和生物利用度,
測定法l:體外水解測定法
下面的方法可用于測定因子VIIa的生物活性。該測定法在微量滴定 板(MaxiSorp， Nunc，丹麥)中進(jìn)行。向因子VIIa (終濃度100nM，溶 于含有O. 1M NaCl、 5mM CaCh、和lmg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes pH7. 4)中加入呈色底物D-lie-Pro-Arg-對硝基苯胺(終濃度lmM, S-2288， Chromogenix，瑞典)。在SpectraMax頂340讀板儀(Molecular Devices,美國)中連續(xù)測量405nm的吸光率。將保溫20分鐘期間形成的 吸光率減去不含酶的空白孔的吸光率，由此計算待測因子VI Ia與參考因 子VIIa的活性之間的比率。
測定法2:體外蛋白水解測定法
下面的方法可用于測定因子VIIa的生物活性。該測定法在微量滴定 板(MaxiSorp， Nunc,丹麥)中進(jìn)行。將因子VIIa ( 10nM)和因子X ( 0. 8 iaM)(溶于IOO u l含有O. 1M NaCl、 5mM CaCl2、和lmg/ml牛血清清蛋 白的50mM Hepes pH7. 4 )保溫15分鐘。然后加入50 )i l含有0. 1M NaCl、 20mM EDTA、和lmg/ml牛血清清蛋白的50raM Hepes pH7.4終止對因子X 的切割。加入呈色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-對硝基苯胺(終濃度O. 5mM， S-2765, Chromogenix,瑞典)，測量所生成的因子Xa的數(shù)量。在 SpectraMax 340讀板儀(Molecular Devices,美國)中連續(xù)觀情405nm的吸光率。將10分鐘期間形成的吸光率減去不含F(xiàn)VIIa的空白孔的吸光 率，由此計算待測因子VI Ia與參考因子VI Ia的活性之間的比率。
測定法3:功能性體內(nèi)半衰期的測量 可以以文獻(xiàn)中描述的許多方法來進(jìn)行體內(nèi)生物學(xué)半衰期的測量。用 于測量rFVIIa及其變體的體內(nèi)半衰期的測定法的范例描述于FDA參考號 96-0597中。簡而言之，測量在施用綴合物、多肽、或組合物之前和施 用后24小時期間采集的血漿中的FVIIa凝結(jié)活性。測量穩(wěn)定狀態(tài)時分布 的表》見體積中值，并測定清除中值。
測定法4:因子VII多肽的生物利用度
例如，可以如下所述在狗才莫型中測量生物利用度在分成四組的12 只比格狗中進(jìn)行四腿交叉研究的實驗。所有動物接受劑量大約90 ju g/kg 的待測制劑A和參考制劑B (溶于含有2.92mg/ml NaCl 、 1. 47rag/ral CaCh'2H20、 30mg/ml甘露醇、和聚山梨酸酯80的甘氨酰甘氨酸緩沖液 pH5.5中)。初次施用后IO、 30、和60分鐘、2、 3、 4、 6、和8小時釆集 血才羊。由樣品獲得血漿，并通過ELISA對因子VII定量。
每種樣品的生物利用度表述成因子VII的血漿濃度曲線下的劑量調(diào) 整面積(AUC/劑量)。相對生物利用度表述成待測制劑與參考制劑的平 均AUC/劑量之間的比率乘以100，并計算相對生物利用度的90%置信 度。野生型人因子VII的氨基酸序列
Ala-Asn-Ala-Phe-Leu-GLA-GIiA-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-ljeu-GLA-Arg-GUA-Cya-Ly曰-5 10 15
GLA-GLA-Gln-Cys-Ser-Phe-GLA-GLA-Aia-Arg、GLA-Il€-Phe-LyB-Mp-Ala-GLA-Arg-20 25 30 35
Thr-Lys-Leu-Phe-Trp-Ile-Ser-Tyr-Ser-Asp-Gly-Asp-Gln-Cys-Ala-Ser-Ser-Pro -40 45 50
Cys-Glii-Asn-Gly-Gily-Ser-Cys-Liys-Aep-Gln-Leu-Gln-Ser-Tyr-lie-Cys-Phe-Cys _ 55 SO 65 70
Iieu-Pro-Ala-Phe-Glu-Gly-Arg-Asn-CyB-Glu-Thr^HiB-Lya-Asp-ABp-<31n-Iieu-lle-75 80 85 90
Cys-Val-Asn-Glu-Asn-Gly-Gly-Cys-G工u-Gln-Tyr-Cys、Ser-ABp-Hi3-Thr-Gly-Thr-95 100 105
Iiys-Arg-Ser-Cys-Arg-Cys-His-Glu-Gly-Tyr-Ser-tieu-Iieu-Ala、Asp-Gly-Val-Se3r-110 115 120 125
Cye-Tlir-Pro-Thr-Val-Glu-Tyr-Pro-Cys-Gly-Iiys-Ile-Pjro-Ile-lieu-Giu-riys-Arg-130 135 140
Asn-Ala-Ser-Lys-Pro-Gln-Gly-Arg-ile-Val-Gly-Giy-Lys-Val-Cys-Pro-Lys-Gly-14S 150 155 160
Glu-Cys-Pro-Trp-Gln-Val-Iieu-Iieu-Leu-Val-Asn-Gly-Ala-Gln-lieu-Cys-Gly-Gly-165 170 175 180
Thr-Leu-Ile-Asn-Thr-lie-Trp-Val-Val-Ser-Ala-Ala-His-Cys-Phe-Asp-Lye-lie-18S 190 195Lys-Afln-Trp-Arg-Asn-Leu-ne-Ala-Val-Leu-Gly-Glu-His-Asp-Leu-Ser-Glu-His-
200 205 210 21S
Asp-Giy-Asp-CUu-Gln-Ser-Arg-Arg-Val -Ala-Gln-Val-Ile-Ile-Pro-Ser-Thr-Tyr-220 225 230 Val-Pro-Gly-Thr-Thr-Asn-His-Asp-Ile-Ala-Leu-Leu-Arg-Iieu-His -Gin-Pro-Val-
235 240 24S 250
Val-Leu-Thr-Asp-His-Val - Val - Pro-Leu-Cys -Ijeu-Pro-Glu-Arg-Thr- Phe -Ser-Glu-255 260 265 270
Arg-Thr-I'eu-Ala -phft-Va〗-Arg-Phe-Seir-IiSU-Val-SwGly-Trp-Gly-Gin-Leu-Leu-275 280 285
Asp-Arg-Gly-Ala-Thr-Ala-Leu-Glu-Leu-Met-Val-Leu-Asn-Val-Pro-Arg-Leu-Met -230 300 305 306
Thr-Gln-Asp-Cys-I*eu-Gln-Gln-Ser-Arg-I*ys-Val-Giy-Asp-Ser-Pro-Asn-Ile-Thr-310 315 320
Glu-Tyr-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Ser-Asp-Gly-Ser-Lys-Asp-Ser-Cys-Lys-Gly-325 330 335 340
A3p-Ser-Gly-Gly-Pro-H丄3-Ala-Thr-Hia-Tyr-Arg-Gly-Thr-Trp-Tyr-Leu-Thr-Gly-345 3S0 355 360
lle-Val-Ser-Trp-<ny-Gln-Gly-CyB-Ala-Thr-Val-Gly-His-Phe-Gly-Val-Tyr-Thr-365 370 375
Arg-Val-Ser-Gln-Tyr-Ile-Glu-Trp-Lieu-Gln-Iiys-Lieu-Met-Arg-Ser-Glu-Pro-Arg-380 385 390 395
Pro-Gly-Val-Leu-iieu-Arg-Ala-Pro-Phe-Pro 400 405 40權(quán)利要求
1.包含多種因子VII多肽或因子VII相關(guān)多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺連接的和/或絲氨酸連接的寡糖鏈，而且其中至少一個寡糖基團共價附著了分子量為300-100,000Da的至少一個聚合基團。
2. 依照權(quán)利要求l的制劑，其中聚合基團附著于唾液酸模塊上。
3. 依照權(quán)利要求1或2的制劑，其中大約94 - 100 %的寡糖鏈包含 至少一個唾液酸模塊。
4. 依照權(quán)利要求3的制劑，其中大約94 - 100%的寡糖鏈包含至少 一個唾液酸模塊，而且其中少于大約25%的寡糖鏈包含至少一個未加帽 的觸角。
5. 依照權(quán)利要求4的制劑，其中少于大約10%的寡糖鏈包含至少 一個未加帽的觸角。
6. 依照權(quán)利要求5的制劑，其中少于大約5%的寡糖鏈包含至少一 個未加帽的觸角。
7. 依照權(quán)利要求4-6任一項的制劑，其中大約96 - 100 %的寡糖 鏈包含至少一個唾液酸模塊。
8. 依照權(quán)利要求7的制劑，其中大約98 - 100 %的寡糖鏈包含至少 一個唾液酸模塊。
9. 依照權(quán)利要求l的制劑，其中天冬酰胺連接的寡糖鏈位于與野 生型人FVIIa (圖l)中氨基酸殘基Asn-145和Asn-322對應(yīng)的位置處。
10. 依照權(quán)利要求l的制劑，其中絲氨酸連接的寡糖鏈位于與野生 型人FVIIa (圖l)中氨基酸殘基Ser-52和Ser-60對應(yīng)的位置處。
11. 依照權(quán)利要求l的制劑，其中所述聚合物選自下組聚環(huán)氧烷， 包括聚亞烷基二醇、分支PEG、聚乙烯醇、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙烯-共-馬來酸酐、聚苯乙烯-共-馬來酸酐和葡聚糖、聚氨基曱酸酯、 聚酯、和聚酰胺。
12. 依照權(quán)利要求ll的制劑，其中聚合物是聚乙二醇。
13. 依照權(quán)利要求12的制劑，其中聚乙二醇是分子量大約500 -
14. 依照權(quán)利要求l的制劑，其中多肽具有野生型人因子VII的氨基 酸序列(圖l )。
15. 依照權(quán)利要求l的制劑，其中多肽是由血漿衍生的人因子VIIa。
16. 依照權(quán)利要求l的制劑，其中因子VII多肽選自下組S52A-因 子VII、 S60A-因子VII、在第290位與第291位殘基之間受到蛋白水解切 割的因子VII 、在第315位與第316位殘基之間受到蛋白水解切割的因子 VII、已發(fā)生氧化的因子VII、 L305V-FVI1、 L305V/M306D/D309S-FVn、 L305I-FVII 、L305T-FVI1 、F374P-FVII 、V158T/M298Q-FVII 、 V158D/E296V/M298Q-FVI1、 K337A-FVI1 、 M298Q-FVI1 、 V158D/M298Q-FVII 、 L305V/K337A-兩I 、 V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII 、 V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII 、 V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII 、 K157A-FVII、 E296V-FVII、 E296V/M298Q-FVII 、VI58D/E296V-FVII 、VI58D/M298K-FVII 、 S336G-FVII、第290位和/第291位的氨基酸殘基已被取代的因子VII序列 變體、以及第315位和/或第316位的氨基酸殘基已被取代的因子VII序刮 變體。
17. 依照權(quán)利要求1的制劑，其中因子VII多肽選自L305V/K337A-FVII, L305WV1S8D-FVII, L305V/E2S6V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVU, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q.FVII, L30SV/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII,L305V/V158D/E296V-FVII, L30SV/V158T/M298Q-FVII, L3.05WV158T/E296V-FVII,L305V/E296V/M298Q-FVII, L305VAM58D/E296V/M298Q-FVII, L305WV158T/E295V/M29BQ-FV11, L30SV/V158T/K337A/M298Q-FVH, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVH, L305V/V1S8D/E296V/K337A—FVII, L30SV/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,L305V/V1S8T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S3"E/K316Q-FVI1, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316畫298Q-剛， K3t6H/V1S8T-FV", K316Q/L305V-FVII, (G16Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K3，6Q/E296V-FVI1, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FV". S314E/L305V/E296V-FV", S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305VA/1S8T-FVII,S314EA305V/K337A/V15盯-FVI1, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314EyL305V/K337A/E296V-FV,1, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305VA/158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305VAM58D/E296V/M298Q-FV", S314E/L305WV158T/E296V7M298Q-FVII,S314E/L305V/V1S8T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVM, S3WE/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314EyL305WV158D/E296V/K337A-FVH, S3l4EyL305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVM, S314E/L305V/V158T7E296V/M298Q/K337A-FVU, K316H/L30SV/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L30SV/E296V-FVII,K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII,K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337 A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305WV158D/E296V-FVH,K316H/L305V/V158T/M298Q-FVU, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,K316H/L305V/V1S8T/K337A/M298Q-FV11, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FV", K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305VA/158D/E296V/K337A —FVII,K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K3 ， 6Q/L305V/V158D-FVI I, K316Q/L305V/E296V-FV",K316Q/L305V/M298Q-FVII, O16Q/L305V/V158T-FV", K316Q/L305V/K337A/V1S8T-FVII,K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FV", K316Q/L305V/1O37AA/158D-FVU, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FV1I, K316Q/L305VA/158D/E296V-FVII,K316Q/L30SV/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305WV158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,K316Q幾305V/V158T/K337A/M298Q-FVI1, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVU, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVM, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A -FVH,K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVn, F374Y7K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374丫/M298Q-FV", F374丫/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVIi, F374丫/L305V-FVI1, F374Y/U05V/K337A-FVII, F374V7L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K33'7A/S314'E-FV", F374Y/K3'37A/V158T-隨， F374丫/K337誦298:Q-FVI1, F374Y/K3'37A/E296V-FW,, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374.Y/V158,14E-FVI1,F374Y/V158國298Q-FV", F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII,F374Y/V158T/M298Q-FVH, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII,F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374丫/E296V/M298Q-FV", F374丫/L305WO37A/V158D-FVI1,F374V7L305WK337A/E296V-FVI1, F374Y凡305V/K337A/M298Q-FVH, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII,F374Y/L305V/K337/VS314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V-FVn,F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374丫/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296WS3'4E-FVII, F374Y/L305漏298Q/V158T-FVII, F374Y/L305WM298Q/S314E-FVII, F374Y/U05V/V158T/S314E-FVII, F374丫/K337A/S314EAM58T-FVII, F374Y7K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII,F374丫/K337A/S314EA/158D-FVII, F374Y/K337AA/1S8T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVH,F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII,F374丫/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374丫/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374 Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII,F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/V158D/E296薩298Q/5314E-FVH,F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296割298Q-FVH,F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,F374Y/L305V/V1S8D/E296V/S314E-FV1I,F374Y/V1S8T/E296薩298Q/S314E-FVI1,F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/1305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII.F374Y/L305V/V1S8T/E296V/S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/K337/W158T/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/L305WV158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374YAJ05V/E296菌298Q/K337A -FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M29SQ/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296WM298Q/K337A.FVI1, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374V7L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E:FVH, F374Y/L305V/V1S8D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; and P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143薩145T-FVI1, V253N-FVII, R2謂/A292T-FVI1, G291N-FVII, R315N/V317T-FVH,:K143N/N145T/R315N/V317T-FVII;由233Thr至240Asn的氨基酸序列中具 有取代、添加、或缺失的FVII、由304Arg至329Cys的氨基酸序列中具有 取代、添加、或缺失的FVII、以及由153Ile至223Arg的氨基酸序列中具 有取代、添加、或缺失的FVII。
18.依照權(quán)利要求l的制劑，其中因子VII相關(guān)多肽選自下組 R152E_FVII、 S344A-FVII、 FFR—FVII、和缺乏Gla結(jié)構(gòu)域的FVIIa。
19. 依照權(quán)利要求l的制劑，其中在本說明書所述凝結(jié)測定法、'蛋白水解測定法、或TF結(jié)合測定法中的一種或多種方法中進(jìn)行測試時，因 子VII相關(guān)多肽展示的比活是在相同細(xì)胞類型中生成的野生型因子VIIa 的比活的至少大約25%。
20. 依照權(quán)利要求l的制劑，其中在本說明書所述凝結(jié)測定法、蛋 白水解測定法、或TF結(jié)合測定法中的一種或多種方法中進(jìn)行測試時，因的比活的大約25%以下。
21. 依照權(quán)利要求l的制劑，其中所述制劑展示的生物利用度是參 考制劑的生物利用度的至少大約110 % 。
22. 依照權(quán)利要求l的制劑，其中所述制劑展示的血清半衰期是參 考制劑的半衰期的至少大約125 % 。
23. 依照權(quán)利要求ll的制劑，其中所述聚合物選自聚亞烷基二醇 (PAG)和羧甲基葡聚糖
24. 依照權(quán)利要求23的制劑，其中所述聚合物選自聚乙二醇和聚丙二醇。
25. 用于制備權(quán)利要求l - 24的制劑的方法，所述方法包括在至少 一個聚合物分子共價附著于所述多肽中至少一個寡糖鏈上的條件下使 該多肽接觸所述聚合物分子。
26. 包含權(quán)利要求l - 24任一項中定義的制劑和制藥學(xué)可接受載體 或佐劑的藥物組合物。
27. 權(quán)利要求l - 24任一項中定義的包含因子VII多肽或因子VII相 關(guān)多肽的制劑用于制備治療因子VII反應(yīng)性綜合癥的藥物的用途。
28. 權(quán)利要求27中定義的用途，其中所述綜合癥選自血友病A、 血友病B、因子XI缺陷、因子VII缺陷、血小板減少、von WiUebrand 氏病、凝血因子抑制劑的存在、手術(shù)、創(chuàng)傷、和抗凝劑療法，包括稀釋 性凝血病、顱間出血、干細(xì)胞移植、上胃腸道出血、和肝病。
29. 權(quán)利要求l - 24任一項中定義的包含因子VII多肽或因子VII相 關(guān)多肽的制劑用于制備預(yù)防有害出血的藥物的用途。
30. 權(quán)利要求l - 24任一項中定義的包含因子VII多肽或因子VII相關(guān)多肽的制劑用于制備預(yù)防有害凝血的藥物的用途。
31. 權(quán)利要求30中定義的用途，其中有害凝血與選自下組的狀況有 關(guān)血管成形術(shù)、深靜脈血栓形成、肺栓塞、中風(fēng)、彌漫性血管內(nèi)凝血、 與革蘭氏陰性內(nèi)毒素血癥有關(guān)的肺和腎中的纖維蛋白沉積、以及心肌梗
32. 權(quán)利要求l - 24任一項中定義的包含因子VII多肽或因子VII相
33. 權(quán)利要求32中定義的用途，其中由組織因子介導(dǎo)的反應(yīng)與選自 下組的狀況有關(guān)全身性炎性應(yīng)答綜合癥、急性肺損傷、急性呼吸窘迫 綜合癥、多發(fā)性器官衰竭、溶血性尿毒癥綜合癥、和血栓性血小板減少 性紫癲。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含多種因子VII多肽或因子VII相關(guān)多肽的制劑，其中所述多肽包含天冬酰胺連接的和/或絲氨酸連接的寡糖鏈，而且其中至少一個寡糖基團共價附著了至少一個聚合基團。該聚合基團可以是聚環(huán)氧烷(PAO)，例如聚乙二醇(PEG)。
文檔編號C07KGK101301475SQ200810009468
公開日2008年11月12日 申請日期2003年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月21日
發(fā)明者C·貝倫斯, N·K·克勞森, P·W·加里貝, S·比約恩 申請人:諾和諾德醫(yī)療保健公司